基于血清代谢组学改变建立的预测冠心病斑块不稳定性临床模型
阅读说明：本技术 基于血清代谢组学改变建立的预测冠心病斑块不稳定性临床模型 (Clinical model for predicting coronary heart disease plaque instability based on serum metabonomics change ) 是由 姜华丽 王善花 李恒 陈本发 于 2020-01-02 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物化学领域,具体涉及基于血清代谢组学改变建立的预测冠心病斑块不稳定性临床模型。一种用于诊断急性冠脉综合征的特异性代谢物,包括甜菜碱、乙酰肉碱、1-十七碳酰-甘油-3-磷酰胆碱、异十一酸中的一种或多种；一种用于计算急性冠脉综合征患者血清中斑块稳定性的临床模型,所述模型为logit(P＝VP vs.SP)＝0.029*甜菜碱+0.051*射血分数-6.137。该模型敏感性高达70.6％,特异性高达80％。利用本发明的诊断模型计算冠脉综合征高危患者的斑块的稳定性,可为临床冠脉综合征斑块的鉴定及早期积极的干预及治疗提供治疗策略。(The invention relates to the field of biochemistry, in particular to a clinical model for predicting coronary heart disease plaque instability, which is established based on serum metabonomics change. A specific metabolite for diagnosing acute coronary syndrome, comprising one or more of betaine, acetyl-carnitine, 1-heptadecacarbonyl-glycerol-3-phosphorylcholine, isoundecanoic acid; a clinical model for calculating plaque stability in serum of a patient with acute coronary syndrome, said model being logit (P ═ VP vs. sp) ═ 0.029 betaine +0.051 ejection fraction-6.137. The sensitivity of the model is as high as 70.6%, and the specificity is as high as 80%. The diagnosis model of the invention is used for calculating the stability of the plaque of the coronary syndrome high-risk patient, and can provide a treatment strategy for the identification of the clinical coronary syndrome plaque and the early active intervention and treatment.)
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体涉及基于血清代谢组学改变建立的预测冠心病斑块不稳定性临床模型。
背景技术5
冠状动脉疾病(CAD)是代谢性疾病之一，可以导致最严重的心血管事件死亡。急性冠脉综合征(ACS)是一种严重的冠心病类型。ACS通常与不稳定的动脉粥样斑块破裂、冠状动脉血栓形成、急性心肌缺血有关。临床上，ACS可分为急性心肌梗死(AMI)和不稳定性心绞痛(UA)。早期发现易损斑块(VPs)对于及时、有效地抑制心肌坏死和心衰至关重要。
研究表明，动脉粥样硬化是一种慢性炎症性动脉疾病，由脂质代谢受损和免疫反应不平衡所致。虽然在外周循环或冠脉循环中检测到的一些生物标志物已被报道与斑块炎症相关，可能在预测ACS的发生及发展中有用。然而，大多数关于生物标志物的研究是回顾性的，其预测价值仍不确定。因此，探索能够预测诱发心血管事件的易损斑块的新的生物标志物仍然是一个重大挑战。代谢组学是一门相对较新的学科。它被认为可以在生理或病理条件下对不同的低分子量代谢物或内源性代谢物质进行识别和定量分析。代谢组学已被广泛应用于多种代谢性疾病的诊断，如胃炎、肝纤维化、糖尿病和不同类型的癌症。同时，代谢组学在高脂血症、动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病中的应用也逐渐受到重视。然而，代谢组学在ACS代谢组学中的变化尚未被深入研究，也不为人所知。此外，血清代谢标志物在急性冠脉综合征和稳定性冠心病中的危险分层作用需要进一步探索。
冠状动脉粥样硬化性心脏病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病，常常被称为“冠心病”。我国冠心病人数高达2.9亿，每年超过350万人死于冠脉事件。不稳定的动脉粥样硬化斑块及斑块破裂所继发的血栓形成是导致急性冠脉综合征(ACS)发生、发展的主要原因。因此早期预测冠状动脉粥样硬化斑块的稳定性，及时对冠心病临床干预及预防ACS发生、发展具有重要临床意义。然而目前确诊冠状动脉不稳定性斑块主要是通过冠状动脉造影检查(CAG)结合冠状动脉血管内超声检查(IVUS)，存在的问题主要有：(1)CAG和IVUS均属于有创的检查，有一定比例心脏相关的风险，身体基础条件差的患者并不能耐受；(2)CAG和IVUS检查均需要在X射线下在冠状动脉内注入碘造影剂才能实现，严重的心功能不全及肾功能不全的患者，对碘剂过敏的患者均不能开展这两项检查。(3)CAG和IVUS检查后可能会损伤桡动脉，患者进行两项检查后导致桡动脉闭塞，患者会遗留上肢麻木、疼痛等后遗症；(4)CAG和IVUS检查后需要在桡动脉穿刺处加压止血，术后患者检查侧上肢会出现肿胀、疼痛，增加了病人痛苦；(5)CAG和IVUS检查必须住院才能实现，增加医院管理负担和患者经济费用；(6)CAG和IVUS检查费用较高，两项检查加起来费用约16000元，大大增加社会和国家医疗费用负担。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种用于诊断急性冠脉综合征的特异性代谢物及斑块稳定性诊断模型，具体如下：
一种用于诊断急性冠脉综合征的特异性代谢物，包括甜菜碱、乙酰肉碱、1-十七碳酰-甘油-3-磷酰胆碱、异十一酸中的一种或多种。
进一步的，包括任意两个所述的代谢物。
进一步的，包括任意三个所述的代谢物。
进一步的，包括任意四个所述的代谢物。
一种定性或定量分析以上所述的用于诊断急性冠脉综合征的特异性代谢物的方法，其采用液质联用仪定性或定量分析所述代谢物。
一种于诊断急性冠脉综合征的检测试剂盒，包括以上所述的特异性代谢物的标准品，所述标准品为各特异性代谢物的化学单体或混合物。
一种用于计算急性冠脉综合征患者血清中斑块稳定性的临床模型，所述模型为logit(P＝VP vs.SP)＝0.029*甜菜碱+0.051*射血分数-6.137。
进一步的，本发明应用逻辑回归及ROC曲线下面积的方法，模型会先纳入影响斑块稳定性所有的临床指标，然后backward stepwise逐个剔除回归最不显著的指标，直到模型的评价值最高，筛选出诊断冠状动脉不稳定斑块敏感性及特异性的临床模型【logit(P＝VPvs.SP)＝0.029*甜菜碱+0.051*射血分数-6.137】，该模型敏感性高达70.6％，特异性高达80％。利用该模型计算冠脉综合征高危患者的斑块的稳定性，为临床冠脉综合征斑块的鉴定及早期积极的干预及治疗提供治疗策略。本发明的模型的优点如下：
1、非侵入性的检查方法，没有创伤及并发症，患者更容易接受；
2、无需住院，容易进行和实现，门诊即可完成；
3、不受其他疾病的影响，怀疑冠心病急性冠脉综合征的所有患者均可实现；
4、诊断不稳定性冠状动脉斑块的准确性及特异性较高；
5、费用相对较低，减轻患者的经济负担；
6、避免过度的医疗检查，节约医疗资源；
本发明提供一种非侵入型的诊断冠状动脉不稳定性斑块的临床模型，不需要住院，更不需要进行桡动脉穿刺及置入造影管，通过抽取静脉血的方法即可实现，避免了传统的因CAG及IVUS所带来的的手术风险，避免了CAG及IVUS术后患者穿刺处肿胀、疼痛的痛苦，不需要在冠状动脉血管内注入碘造影剂，所有怀疑冠心病的患者均可以通过抽取静脉血的方式来判断冠状动脉斑块的稳定性，节约了患者的住院时间，减轻了患者的经济负担。一种非侵入型的诊断冠状动脉不稳定性斑块的临床模型诊断不稳定性动脉粥样硬化斑块特异性及敏感性可达70％-80％，特异性及敏感性均较高，可重复，是一种快捷、经济、高效的识别冠状动脉不稳定性动脉粥样硬化斑块的方法。
附图说明
为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。
图1为实施例1中SPs与VPs患者的代表性质谱分析，其中A为SPs患者的代表性质谱分析，A为VPs患者的代表性质谱分析；
图2为实施例1在HCs(A)、SPs(B)、VPs(C)中血清代谢物PLS-DA分析；
图3为实施例1非靶向四种代谢物在VPs组与SPs组表达(A-D)及曲线下面积(F-H)；
图4为实施例1中靶向三种代谢物在VPs与SPs组表达(A-C)及曲线下面积(D-F)；
图5为实施例1中甜菜碱、乙酰肉碱和1-十七碳酰-甘油-3-磷酸胆碱在ACS组与HCs组(A)、VPs组与HCs组(B)、SPs组与HCs组(C)、VPs组与SPs组(D)的诊断效能；
图6为实施例2中甜菜碱与射血分数联合模型在斑块稳定性中诊断效能。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通的技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1：用于诊断急性冠脉综合征的特异性代谢物
1.诊断急性冠脉综合征的特异性代谢物
1.1.研究方案的伦理批准
研究方案经中山大学(中国广州)东华医院伦理委员会批准。所有受试者在接受研究前均获得书面知情同意。
1.2.排除标准
排除标准为：严重肝肾疾病、骨髓增生性疾病、特发性血小板减少性紫癜、外伤性胸痛或癌症诊断；口服抗凝剂；前8周诊断为急性冠脉综合征并进行相应治疗；急性冠脉综合征合并冠脉内血栓的患者。
1.3.患者特征和样本选择
我们对2016年11月至2019年2月在中山大学通华医院接受治疗的新诊断急性冠脉综合征患者进行了回顾性分析和鉴定。我们招募252名成人(>20岁)急性胸痛患者到东华医院急诊室就诊。根据临床表现、体格检查、典型的缺血性ST改变、心肌肌钙蛋白升高、冠状动脉造影和血管内超声符合急性冠脉综合征标准，所有急性冠脉综合征患者均入选。新鲜血液样本(约800μl)在入组后采集，并在-80℃下储存。
1.4.化学品
乙腈、甲醇和适用于液相色谱-质谱(LC-MS)的超纯水购自Thermo Scientific。以中国上海cnw为原料，合成了乙酸铵和甲酸。1-十七碳酰-甘油-3-磷酸胆碱和甜菜碱来自中国成都。乙酰肉碱购自Effbio(中国上海)。
1.5.样品制备
血液统一标准处理后，200μl血清样品真空干燥。然后，向血清样品中加入800μl甲醇/乙腈(1:1，v/v)溶液。将后者摇动30s，置于超声波下1min，并将混合物在-20℃下孵育1h，以促进蛋白质沉淀。然后，将混合物在4℃下以17000rpm离心15分钟。收集上清液，然后真空干燥并用200μl甲醇/水溶液重新溶解。上清液通过超高效液相色谱-质谱(UHPLC-MS)进行代谢组学分析。
1.6.非靶向代谢组学和代谢产物测量
血清样本使用ACQUITYTMUPLC HSS T3柱进行分析，ACQUITY UHPLC系统配有XEVOTMG2四倍飞行时间质谱仪。代谢组学程序(样品制备、代谢物分离/检测、数据预处理和代谢物识别的统计分析)按照之前描述的方案进行，并进行了少量修改[17-20]。UPLC是使用ACQUITYTMUPLC系统实现的。色谱分离在35℃下在ACQUITYTMUPLC HSS T3柱上进行。流动相a由含0.1％甲酸的乙腈溶液组成。流动相b由含0.1％甲酸的水溶液组成。在20min运行期间，流速保持在0.4ml/min，梯度如下：95％A和5％B从0到0.5min；90％A和10％B从0.5到2min；40％A和60％B从2到10min；5％A和95％B从10到14min；5％A和95％B从14到16min；95％A和5％B从16到18min；从18到20分钟，95％a和5％b。样本以阳性模式分析。质谱参数为：离子喷射电压4000v，源温度350℃，碰撞诱导解离的碰撞能20ev，分子质量/电荷(m/z)的ms1扫描范围50-1000，ms2扫描范围50-1000。
1.7.靶向代谢组学和血清生物标志物测定
在ACQUITYTMUPLC HSS T3柱上进行靶向代谢组学分析。采用非靶向代谢组学流动相和UHPLC梯度洗脱程序测定潜在的生物标志物。等比例洗脱3min，流速保持在0.5ml/min。以阳性模式分析样本。ms参数为：离子喷射电压4000v，源温度350℃，ms1扫描范围为m/z50-1000，ms2扫描范围为25-1000。
1.8.代谢产物的鉴定
代谢物识别方案基于报告的程序。根据最小绝对分子量和选择Lasso回归，使用精确的分子量、M/Z元素组成(Masslynx i-Fit；Waters)、MS、MSE片段以及代谢数据库(Metlin；(https://metlin.scripps.edu)、人类代谢组数据库(HMDB；www.hmdb.ca)和基因组百科全书(kegg；www.genome.jp/kegg)来识别和注释重要变量。如果观测值与数据库值之间的质量差小于0.025da，则可鉴定出代谢物。
1.9.代谢组学数据分析
使用metaboanalyst 3.0(www.metaboanalyst.ca/)分析代谢组学数据集。为了减小样品间代谢物浓度的差异，使数据分布更加对称，通过对数变换将数据归一化为总谱峰面积和非线性对话。采用自动标度法使变量之间具有可比性。
对于单因素变量分析，使用Metaboanalyst3.0的t检验确定每个对照组之间特征的显著性(不稳定斑块vs.斑块稳定，不稳定斑块vs.正常健康人群，斑块稳定vs.正常健康人群，急性冠脉综合征vs.正常健康人群)。p<0.05被认为是显著的。对于多变量分析，为了消除参与者间变异性的影响并识别不同的代谢物，应用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)确定对斑块稳定性有显著差异的代谢物。为了保证多变量模型的质量，避免过度拟合的风险，采用多重相关系数(r2)和交叉验证的r2(q2)对不同代谢物进行了验证。然后，根据PLS-DA模型中代谢物在重要性得分中的可变重要性对代谢物进行排序。重要性得分>1.0的代谢物被认为是重要的贡献因素。
2.结果分析
2.1纳入人群分析
根据心电图、肌钙蛋白和冠状动脉血管造影诊断急性冠脉综合征。血管内超声检测动脉粥样硬化斑块的稳定性。动脉粥样硬化斑块和动脉粥样硬化病变与冠脉综合征密切相关。根据双侧非配对t检验，冠脉综合征组与正常健康人群组在年龄、性别、身高、体重、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病或血液生化方面没有显著差异。
2.2非靶向LC-MS对血清样品进行代谢组学分析
97例ACS患者血清代谢物(稳定斑块(Stable Plaques(SPs),n＝33)；不稳定斑块(vulnerable plaques(VPs),n＝32)和正常健康人群(Healthy Controls(HCs),n＝32)进行对比和比较。图1中A和B分别为SPs与VPs患者的代表性质谱。利用非靶向LC-MS，我们检测了正离子模式和负离子模式下的变量。共获得3069个分子特征，并使用MetaboAnalyst 3.0进行统计分析。
如图2所示，PLS-DA显示，HCs和ACS患者(尤其是SPs和VPs患者)的Q2分别为0.416和0.820,R2分别为0.870和0.973，说明模型没有过度拟合，是可靠的。VIP评分>1.0的多变量分析和P<0.05的单变量分析被认为是最显著的代谢物，并通过热图进行可视化。
为了识别临床上重要的代谢物，我们筛选了VPs组和SPs组的不同代谢物，其ROC曲线为>0.6。以这种方式发现了四种代谢物(甜菜碱、乙酰肉碱、1-十七碳酰-甘油-3-磷酸胆碱、异十一酸)，详见表1。
表1 四种特异性非靶向代谢物
如图3所示，这四种代谢物与ACS患者动脉粥样硬化斑块的稳定性相关。VPs组与SPs组四种代谢物的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.884、0.689、0.655和0.782(图3E-H)。
2.3靶向LC-MS对血清样品进行代谢组学分析
为了进一步检测候选代谢物的价值，我们采用了靶向LC-MS检测它们。如图4所示，异十一酸在HMDB未找到,我们系统地分析了其他三个代谢物的相对浓度(甜菜碱,乙酰肉碱1-十七碳酰-甘油-3-磷酸胆碱),这个和非靶向代谢的结果是一致(图4A-C),表示这三个代谢物与ACS患者的斑块的稳定性是相关联的。VPs组与SPs组的甜菜碱、乙酰肉碱、1-十七碳酰-甘油-3磷酸胆碱的AUC分别为0.793、0.568和0.518(图4D-F)。这些结果提示，甜菜碱、乙酰肉碱和1-十七碳酰-甘油-3-磷酸胆碱可用于预测斑块的稳定性。
实施例2：
本发明希望建立一个诊断模型，可以有效的识别ACS患者斑块的稳定性。因此，如图5所示，本发明对甜菜碱、乙酰肉碱和1-十七碳酰-甘油-3-磷酸胆碱进行logistic回归分析，以评估其在ACS诊断和斑块稳定性风险分层中的准确性。然而，ACS组与HCs组、VPs组与HCs组、SPs组与HCs组、VPs组与SPs组分别建立了四种基于代谢的模型。ACS组与HCs组、VPs组与HCs组、SPs组与HCs组、VPs组与SPs组的AUC分别为0.579、0.594、0.732、0.793，对应的敏感性分别为75.5％、52.8％、56.6％和78.4％，特异性分别为46.5％、68.6％、64.0％和70.0％。
为了提高斑块稳定性的诊断性能，我们采用了逐步逆向选择的方法来确定亚组的最佳模型。如图6所示，该模型以logit(P＝VPs vs.SPs)＝0.029×甜菜碱+0.051×射血分数-6.137表示。AUC为0.808，敏感性为70.6％，特异性为80.0％。ACS组与HCs组、SPs组与HCs组、VPs组与HCs组的AUC分别为0.558、0.618和0.717，对应的敏感性为66.0％、67.9％和70.6％，特异性为49.5％、56.9％和60.0％。结果表明，该组合模型不存在过拟合问题，具有较好的可靠性。
实施例3：检测试剂盒的制备
基于本发明提供的特异性代谢物制备了检测试剂和，该试剂盒包括如下成分：
特异性代谢物标准品：包括甜菜碱、乙酰肉碱、1-十七碳酰-甘油-3-磷酰胆碱、异十一酸，各标准品分别封装；
血浆代谢物提取溶剂：比例为1：1的乙腈和甲醇混合溶液(用于UPLC-Q/TOF样本制备)，50％的乙腈水溶液作为溶解标准品的溶剂
外标物：甜菜碱、乙酰肉碱、1-十七碳酰-甘油-3-磷酰胆碱、异十一酸。
本发明通过分析血清代谢组学改变对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响。血清样本的代谢物谱可将ACS患者的SPs和VPs与HCs进行分类。ACS患者4种代谢物水平显著改变。与HCs相比，ACS患者的甜菜碱、乙酰肉碱、1-十七碳酰-甘油-3-磷酸胆碱和异十一酸代谢受到干扰。此外，甜菜碱与心脏射血分数的联合诊断对ACS VPs患者与ACS SPs患者的鉴别具有重要意义。本发明通过分析血清代谢组学改变对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响，提出一种用于诊断急性冠脉综合征的特异性代谢物，包括甜菜碱、乙酰肉碱、1-十七碳酰-甘油-3-磷酰胆碱、异十一酸中的一种或多种。以上四种代谢物可用于ACS与HCs的分离。
本发明进一步提出一种基于代谢的非侵入性斑块诊断模型。本发明首次将甜菜碱作为检测斑块稳定性最有前途的生物代谢物。甜菜碱是一种存在于许多生物体内的天然化合物。甜菜碱作为甲硫氨酸和肉碱合成的甲基基团的供体，可以保护细胞不被渗透失活，增加细胞的保水能力，提高蛋白质代谢和能量代谢。甜菜碱是一种有效的抗氧化剂，在饮食中的甜菜碱可以增加动物血浆中谷胱甘肽过氧化物酶的水平。氧化应激是动脉粥样硬化的重要病理过程。Ya等人发现，甜菜碱通过调节p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径中的氧化应激，在dm诱导的小鼠血睾丸屏障的破坏中起重要作用。Saeed等研究表明甜菜碱是一种天然的抗热应激剂。我们发现VPs ACS患者的甜菜碱水平明显升高，且甜菜碱在斑块稳定性中起重要作用。这些发现与甜菜碱在生物体中的保护作用是一致的。