益智仁配方颗粒的特征图谱构建方法及其质量检测方法
阅读说明：本技术 益智仁配方颗粒的特征图谱构建方法及其质量检测方法 (Characteristic spectrum construction method and quality detection method of fructus alpiniae oxyphyllae formula granules ) 是由 刘燎原 邓颂 李燕珍 崔婷 干丽 魏梅 程学仁 孙冬梅 于 2020-04-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种益智仁配方颗粒的特征图谱构建方法及其质量检测方法。所述构建方法包括如下步骤：对照品溶液的制备：取圆柚酮、山柰素对照品,加溶剂溶解,得对照品溶液；供试品溶液的制备：取益智仁配方颗粒,加入提取溶剂进行提取,提取液过滤,取续滤液,得供试品溶液；将所述对照品溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪中进行检测,所述超高效液相色谱仪采用的流动相A为乙腈,流动相B为体积分数为0.05～0.15％的甲酸水溶液,洗脱方式为梯度洗脱。该构建方法构建获得的特征图谱能够较全面的反映益智仁配方颗粒的特征,特别是实现了益智仁配方颗粒中挥发油的检测,能够很好地对益智仁配方颗粒的质量进行控制。(The invention relates to a method for constructing a characteristic spectrum of fructus alpiniae oxyphyllae formula granules and a quality detection method thereof. The construction method comprises the following steps: preparation of control solutions: dissolving pomelo ketone and kaempferide reference substances in solvent to obtain reference substance solution; preparation of a test solution: adding an extraction solvent into the fructus alpiniae oxyphyllae formula granules for extraction, filtering an extracting solution, and taking a subsequent filtrate to obtain a test solution; and injecting the reference substance solution and the test solution into an ultra-high performance liquid chromatograph for detection, wherein a mobile phase A adopted by the ultra-high performance liquid chromatograph is acetonitrile, a mobile phase B is a formic acid aqueous solution with the volume fraction of 0.05-0.15%, and the elution mode is gradient elution. The characteristic spectrum constructed by the construction method can comprehensively reflect the characteristics of the fructus alpiniae oxyphyllae formula particles, particularly realizes the detection of volatile oil in the fructus alpiniae oxyphyllae formula particles, and can well control the quality of the fructus alpiniae oxyphyllae formula particles.)
技术领域
本发明涉及中药检测技术领域，特别是涉及一种益智仁配方颗粒的特征图谱构建方法及其质量检测方法。
背景技术
益智仁(Alpinia Oxyphylla Miq)为姜科多年生草本植物益智的干燥成熟果实，其性温，味辛，归脾、肾经，具有温脾止泻摄唾，暖肾固精缩尿的功效，用于肾气不足、不能固摄所致之腹痛吐泻、食少多唾等。主产于海南、广东、广西等地，为海南地道药材之一，也为四大南药之一。现代药理学表明，益智仁具有多方面的药理作用，同时越来越多的研究表明，益智仁中发挥其药效的主要成分是挥发油：如罗琴等人认为，益智仁的挥发油具有明显的抑菌作用，在抗菌方面具有较大的潜力；刘长虹等人研究表明，益智挥发油中化学成分圆柚酮对慢性肾损伤具有保护作用，并阐述了圆柚酮补肾缩尿的机理；另研究表明，益智仁起温脾止泻作用的有效成分为挥发油。综上可知，益智仁的挥发油成分是益智仁发挥药效的重要成分。
传统中药汤剂是临床中医师在中医药理论的指导下，在辩证论治的基础上为病人开具的处方，自商代伊尹创制汤液以来沿用至今，为中华民族的医疗健康做出了重大贡献。但随着现代社会的发展、科技水平的提高。中药汤剂已不能满足现代人快节奏的生活方式，中药配方颗粒应运而生。中药配方颗粒是以符合传统炮制规范的现代炮制工艺炮制好的中药饮片为原料，应用现代科学技术进行提取、固液分离、浓缩、干燥、制粒包装而成的纯中药新的供临床使用形式；其功能、主治、性味、归经同传统中药饮片一致，既保持了传统中药饮片的药效、药性，又具有方便患者服用、便于调剂的特点。
《中国药典》2015年版规定，益智仁饮片挥发油含量不得少于1.0％。但益智仁挥发油的性质不稳定，易挥发、导致在制剂生产和贮藏过程中损耗大部分，影响药效，因此，目前益智仁配方颗粒的质量难以保证等同于其中药汤剂，特别是其中挥发油的含量，若益智仁配方颗粒中挥发油含量过低，难以发挥等同于其中药汤剂的药效。
目前关于益智仁配方颗粒的质量研究较少，特别是针对其挥发油的检测，缺少较好的质量标准以确保益智仁配方颗粒质量稳定。利用特征图谱获取全面的中药化学成分特征信息已广泛地应用于中药的质量控制之中，中药特征图谱是对中药整体性化学特征的表达和反映，可以有效监控中药制剂的质量，提高并稳定疗效。因此，建立益智仁配方颗粒的特征图谱是非常必要的。
发明内容
基于此，有必要提供一种益智仁配方颗粒的特征图谱构建方法。该构建方法构建获得的特征图谱能够较全面的反映益智仁配方颗粒的特征，特别是实现了益智仁配方颗粒中挥发油的检测，质量检测全面、可靠、用时短，能够很好地对益智仁配方颗粒的质量进行控制。
一种益智仁配方颗粒的特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
对照品溶液的制备：取圆柚酮、山柰素对照品，加溶剂溶解，得对照品溶液；
供试品溶液的制备：取益智仁配方颗粒，加入提取溶剂进行提取，提取液过滤，取续滤液，得供试品溶液；
利用超高效液相色谱法对所述对照品溶液和供试品溶液进行检测，所述超高效液相色谱法采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.05％～0.15％的甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱包括如下程序：
0～10min，流动相A的体积百分比由8％上升至16％；
10～25min，流动相A的体积百分比由16％上升至23％；
25～35min，流动相A的体积百分比由23％上升至73％；
35～38min，流动相A的体积百分比由73％下降至8％。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱法的条件包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：250～260nm；流速：0.25～0.35mL/min；柱温：25～35℃。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱法的条件包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：254nm；流速：0.3mL/min；柱温：30℃。
在其中一个实施例中，所述供试品溶液的制备中，所述提取溶剂为体积分数45％～55％的甲醇水溶液。
在其中一个实施例中，所述提取的方法为超声提取：超声功率为200～300W、频率为20～30kHZ；所述提取的时间为25～35min。
本发明还提供一种益智仁配方颗粒的质量检测方法，包括如下步骤：
指标成分对照品溶液的制备：取圆柚酮对照品，加溶剂溶解，配置成不同浓度的指标对照品溶液；
待测样品溶液的制备：取待测益智仁配方颗粒，加入提取溶剂进行提取，提取液过滤，取续滤液，得供试品溶液；
标准曲线建立：利用超高效液相色谱法对所述不同浓度的指标成分对照品溶液进行检测，并构建指标成分的浓度-峰面积标准曲线；
检测：利用超高效液相色谱法对所述待测样品溶液进行检测，并将检测图谱与所述指标成分的浓度-峰面积标准曲线进行比较；
其中，所述超高效液相色谱法采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.05％～0.15％的甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱包括如下程序：
0～10min，流动相A的体积百分比由8％上升至16％；
10～25min，流动相A的体积百分比由16％上升至23％；
25～35min，流动相A的体积百分比由23％上升至73％；
35～38min，流动相A的体积百分比由73％下降至8％。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱法的条件包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：250～260nm；流速：0.25～0.35mL/min；柱温：25～35℃。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱法的条件包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：254nm；流速：0.3mL/min；柱温：30℃。
在其中一个实施例中，所述待测样品溶液的制备中，所述提取溶剂为体积分数45％～55％的甲醇水溶液。
在其中一个实施例中，所述提取的方法为超声提取，超声功率为200～300W、频率为20～30kHZ；所述提取的时间为25～35min。
与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的益智仁配方颗粒的特征图谱构建方法，以超高效液相色谱(UPLC)作为技术手段，采用合适的流动相进行梯度洗脱，可以获得益智仁配方颗粒的特征图谱，特别是针对益智仁配方颗粒中的挥发油成分进行检测，可以全面地反映益智仁配方颗粒的主要化学成分信息，且质量检测全面、可靠，能够准确地检测和评价益智仁配方颗粒的质量，为保证其临床疗效具有重要的意义。同时还具有方法简单、用时短、稳定性好、精密度高及重现性好的优点。
(2)本发明提供的质量检测方法，可以全面的反映益智仁配方颗粒的主要化学成分信息，同时还可以准确测定益智仁配方颗粒中圆柚酮的含量，便于对益智仁配方颗粒的质量进行全面监控，同步进行定性和定量分析，能够准确、有效的区分益智仁配方颗粒中是否加入与益智仁标准汤剂中挥发油相当量的挥发油，从整体上保证药品安全有效、质量可控。
附图说明
图1为对照品山柰素的色谱图；
图2为对照品圆柚酮的色谱图；
图3为构建的益智仁配方颗粒的特征图谱；
图4为益智仁标准汤剂色谱图；
图5为传统工艺制备的益智仁配方颗粒的色谱图；
图6为方法学验证中β-环糊精阴性对照溶液的色谱图；
图7为方法学验证中二氧化硅阴性对照溶液的色谱图；
图8为方法学验证中50％甲醇阴性对照溶液的色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的益智仁配方颗粒的特征图谱构建方法及其质量检测方法作进一步详细的说明。
本发明的实施例提供一种益智仁配方颗粒的特征图谱构建方法，包括如下步骤：
对照品溶液的制备：取圆柚酮、山柰素对照品，加溶剂溶解，得对照品溶液；
供试品溶液的制备：取益智仁配方颗粒，加入提取溶剂进行提取，提取液过滤，取续滤液，得供试品溶液；
将所述对照品溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪中进行检测，所述超高效液相色谱仪采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.05％～0.15％的甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
在其中一个具体的实施例中，所述梯度洗脱包括如下程序：
0～10min，流动相A的体积百分比由8％上升至16％；
10～25min，流动相A的体积百分比由16％上升至23％；
25～35min，流动相A的体积百分比由23％上升至73％；
35～38min，流动相A的体积百分比由73％下降至8％。
在其中一个具体的实施例中，所述超高效液相色谱仪的条件包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：250～260nm；流速：0.25～0.35mL/min；柱温：25～35℃。
更为具体地，所述超高效液相色谱仪的条件包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：254nm；流速：0.3mL/min；柱温：30℃。
在其中一个具体的实施例中，所述超高效液相色谱仪的条件还包括：理论塔板数按圆柚酮峰计算应不低于100000。
在其中一个具体的实施例中，所述供试品溶液的制备中，所述提取溶剂为体积分数45％～55％的甲醇水溶液。与之相应地，所述提取的方法具体可为超声提取，更具体地，所述超声提取的工艺条件包括：超声功率为200～300W、频率为20～30kHZ，提取的时间为25～35min。
在其中一个具体的实施例中，所述对照品溶液的制备中，采用的溶剂可以为醇类溶剂，优选为甲醇。更为具体地，所述对照品溶液中，圆柚酮、山柰素的浓度为105～115μg/mL、80～90μg/mL。
在其中一个具体的实施例中，所述构建方法构建的特征图谱中，设置积分参数为最小峰面积为6000。
本发明的实施例还提供一种益智仁配方颗粒的质量检测方法，包括如下步骤：
指标成分对照品溶液的制备：取圆柚酮对照品，加溶剂溶解，配置成不同浓度的指标对照品溶液；
待测样品溶液的制备：取待测益智仁配方颗粒，加入提取溶剂进行提取，提取液过滤，取续滤液，得供试品溶液；
标准曲线建立：将所述不同浓度的指标成分对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中进行检测，并构建指标成分的浓度-峰面积标准曲线；
检测：将所述待测样品溶液注入超高效液相色谱仪中进行检测，并将检测图谱与指标成分的浓度-峰面积标准曲线进行比较；
其中，所述超高效液相色谱仪采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.05％～0.15％的甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
具体地，所述待测样品溶液的制备的方法同如上特征图谱的构建中供试品溶液的制备，所述标准曲线建立和检测步骤中超高效液相色谱相关的条件设置同如上特征图谱的构建，在此均不再赘述。
在其中一个具体的实施例中，所述指标成分对照品溶液的制备中，采用的溶剂可以为醇类溶剂，优选为甲醇。更为具体地，所述不同浓度的指标成分对照品溶液的浓度设置可以为80～90μg/mL及75～85μg/mL。
在其中一个具体的实施例中，所述质量检测方法还包括，按照如上所述的构建方法构建所述益智仁配方颗粒的特征图谱；并将获得的所述待测样品的检测图谱与所述特征图谱进行比较。即所述质量检测方法可以实现所述益智仁配方颗粒的特征图谱和圆柚酮含量检测，简便且全面的监控益智仁配方颗粒的质量。
如下为具体的实施例，如无特别说明，实施例中采用的原料均为市售获得。
具体的实施例中采用的实验材料和仪器如下：
实验材料：
圆柚酮对照品(6-JTN-173-1，深圳丽景)；
山柰素对照品(110861-201209，中国食品药品检定研究院)；乙腈，0.1％甲酸。
益智仁配方颗粒，由广东一方制药有限公司提供，一共10批，其制备方法如下：
取益智仁药材，挑选除去杂质得益智仁饮片，煎煮，收集挥发油，挥发油使用β-环糊精包合，得β-环糊精包合物；收集药渣煎煮两次，滤液进行真空减压浓缩得清膏，清膏喷雾干燥，将喷干粉与β-环糊精包合物混匀，干法制粒，即得。
批号见下表1：
表1
仪器：超高效液相色谱仪Waters ACQUITY UPLC；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱，2.1mm×100mm，1.8um；XP26百万分之一天平(METTLER TOLEOD)；超声仪：KQ-500DE型超声波清洗器(300W，40Hz)。
实施例1
本实施例为益智仁配方颗粒的特征图谱的构建方法。
1、色谱条件与系统适用性实验：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱，2.1mm×100mm，1.8um；以乙腈为流动相A，以每100mL水中含0.1mL的甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱如表2所示；柱温30℃，流速为0.3ml/min，检测波长为254nm，理论塔板数按圆柚酮峰计算应不低于100000。
表2
时间(分钟)
流动相A(％)
流动相B(％)
0～10
8～16
92～84
10～25
16～23
84～77
25～35
23～73
77～27
35～38
73～8
27～92
2、溶液的制备
对照品溶液的制备：取圆柚酮、山柰素对照品适量，精密称定，置于容量瓶中，加入甲醇，将其浓度分别制成为110.3μg/mL、82.92μg/mL的对照品溶液。
供试品溶液的制备：取实验材料中准备的益智仁配方颗粒0.1g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入体积分数50％的甲醇水10mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率25kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用体积分数50％的甲醇水补足减少的重量，摇匀，滤过，即得。
3、特征图谱构建
分别吸取对照品溶液和供试品溶液各2μL，注入超高效液相色谱仪(WatersACQUITY UPLC)，按照“色谱条件与系统适用性实验”进行测定。测定得到的对照品山柰素、圆柚酮的色谱图分别如图1-2所示。
对10批益智仁配方颗粒进行测定，建立获得的特征图谱如图4所示，呈现15个特征峰，分别为峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8、峰9、峰10、峰11、山柰素、峰13、圆柚酮、峰15，设置积分参数为最小峰面积为6000。各特征峰的保留时间如下表3所示。
表3
4、标准汤剂、传统工艺制备的益智仁配方颗粒特征图谱定性鉴别
4.1益智仁标准汤剂的制备方法如下：
a、将益智仁药材挑选除去杂质、去壳、捣碎，得到益智仁饮片。
b、将益智仁饮片用水煎煮两次，第一次加10倍水，浸泡40分钟，煎煮60分钟，第二次加8倍水煎煮40分钟，收集煎液；
c、煎液过滤，减压浓缩，得益智仁清膏；
d、取益智仁清膏，冷冻干燥，得益智仁标准汤剂冻干粉。
4.2传统工艺制备的益智仁配方颗粒的方法如下：
a、取6批益智仁药材，挑选除去杂质，得到益智仁饮片；
b、取6批益智仁饮片加水煎煮两次，滤液滤过；
c、将滤液进行真空减压浓缩，得益智仁清膏；
d、取益智仁清膏，喷雾干燥，将喷干粉混匀，干法制粒，即得。
按照实施例1的益智仁配方颗粒的特征图谱构建方法对益智仁标准汤剂进行检测，获得益智仁标准汤剂图谱，见图4。同时，传统工艺制备的益智仁配方颗粒共6批(批号如下表4所示)，按照实施例1的益智仁配方颗粒的特征图谱构建方法进行测定，获得传统工艺制备特征图谱，见图5。
表4
由实施例1以本发明构建的益智仁配方颗粒特征图谱(图3)与益智仁标准汤剂图谱(图4)、传统工艺制备图谱(图5)的比较可知，本发明构建的益智仁配方颗粒的特征图谱与标准汤剂图谱一致，与传统工艺制备特征图谱相比较，多一个特征峰，(峰号：15)。
实施例2
本实施例为益智仁配方颗粒中圆柚酮的含量测定方法。
1、色谱条件与系统适用性实验：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱，2.1mm×100mm，1.8um；以乙腈为流动相A，以每100mL水中含0.1mL的甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱如表5所示；柱温30℃，流速为0.3ml/min，检测波长为254nm，理论塔板数按圆柚酮峰计算应不低于100000。
表5
时间(分钟)
流动相A(％)
流动相B(％)
0～10
8～16
92～84
10～25
16～23
84～77
25～35
23～73
77～27
35～38
73～8
27～92
2、溶液的制备
指标成分对照品溶液的制备：取圆柚酮对照品约5mg，精密称定，置于容量瓶中，加入甲醇，将其制成浓度分别为85.6μg/mL(圆柚酮1)、78.9μg/mL(圆柚酮2)的对照品溶液。
供试品溶液的制备：取实验材料中准备的益智仁配方颗粒0.1g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入体积分数50％的甲醇水10mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率25kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用体积分数50％的甲醇水补足减少的重量，摇匀，滤过，即得。
3、浓度-峰面积标准曲线建立和待测样品中圆柚酮含量测定
分别吸取不同浓度的指标成分对照品溶液2μL，注入超高效液相色谱仪(WatersACQUITY UPLC)，按照“色谱条件与系统适用性实验”进行测定，指标成分对照品溶液分别进样两次，取平均值。结果如下表6所示。
表6对照品信息
根据外标法，可得出样品浓度计算方程式：C＝(样品A均值/13778.27+样品A均值/13869.07)/2，再根据浓度计算含量：含量＝C×稀释倍数/取样量。
吸取供试品溶液2μL，注入超高效液相色谱仪(Waters ACQUITY UPLC)，按照“色谱条件与系统适用性实验”进行测定，分别进样两次(记作样品1和样品2)，取平均值。计算可知，此批颗粒中圆柚酮含量为0.6979mg/g(参见下表7)。
表7样品含量
实施例3方法学验证
3.1精密度
3.1.1重复性试验：取同一批号的益智仁配方颗粒(编号：S3)的制备6份供试品并测定。结果圆柚酮含量重复性良好，见表8。
表8圆柚酮重复性试验结果
3.1.2对照品精密度：取同一批号的圆柚酮对照品6份，按检测方法测定其峰面积。结果圆柚酮精密度良好，见表9。
表9圆柚酮精密度
3.2线性关系考察
分别吸取圆柚酮对照品母液0.05mL、0.1mL、1mL、2mL、4mL、6mL，加入甲醇定容至10mL，注入超高液相色谱仪，以峰面积为纵坐标、对照品浓度(ug/mL)为横坐标，圆柚酮在0.1103～66.18ug/ml浓度范围内，得回归方程为：Y＝14976X+749.98(R2＝0.9993)，结果见表10。
表10圆柚酮线性关系考察
3.3稳定性考察
取同一供试品溶液，分别在不同时间测定，结果见表11所示：
表11供试品溶液稳定性考擦
在12小时内测得的益智仁配方颗粒中圆柚酮的峰面积稳定，圆柚酮的峰面积RSD为0.62％，表明供试品溶液在12小时内稳定。
3.4专属性
益智仁配方颗粒β-环糊精阴性对照溶液的制备：称取β-环糊精0.1g，置具塞锥形瓶中，加入体积分数50％的甲醇水10mL，密塞，称定重量，超声处理(250W，频率25kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用体积分数50％的甲醇水补足减少的重量，摇匀，滤过，即得β-环糊精阴性样品溶液。
益智仁配方颗粒二氧化硅阴性对照溶液的制备：称取二氧化硅0.1g，置具塞锥形瓶中，加入体积分数50％的甲醇水10mL，密塞，称定重量，超声处理(250W，频率25kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用体积分数50％的甲醇水补足减少的重量，摇匀，滤过，即得二氧化硅阴性样品溶液。
益智仁配方颗粒阴性对照溶液的制备：取体积分数50％甲醇，超声处理(250W，频率25kHz)30分钟，放冷，过滤，即得。
精密吸取β-环糊精阴性样品溶液、二氧化硅阴性样品溶液、50％甲醇阴性对照溶液各2uL，分别注入超高液相色谱仪，按检测方法测定。结果阴性对照溶液对试验均无干扰(见图6、7、8)。
3.5加样回收率
取同一批已知含量(编号：S3)的供试品9份，分别置具塞锥形瓶中，每份取样量为供试品取样量(0.1g)的一半，以当前取样含量的1:0.5、1:1、1:1.5，按表12分别精密加入浓度为110.3ug/mL的圆柚酮，加入50％甲醇定容至10mL，密塞，称定重量，按照供试品的制备方法进行处理并检测，计算圆柚酮的回收率。结果圆柚酮的平均回收率为95.20％，RSD＝3.39％。具体结果见表12。
表12圆柚酮加样回收率试验结果
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。