阅读说明：本技术 偶联到单一支持物或标签的线性双链dna和用于制备所述线性双链dna的方法 (Linear double-stranded DNA coupled to a single support or tag and method for preparing the same ) 是由 本雅明·亚兹丹·潘纳 蒂尔曼·鲁斯 薇罗妮卡·瓦格纳 卡罗拉·波格拉茨 于 2018-12-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及线性双链DNA,其在其非编码链的3’末端偶联到单个支持物或标签,以及制备所述线性双链DNA的方法。本发明还涉及所述线性双链DNA在RNA体外转录反应中的用途,并且还涉及体外制备RNA的方法。本发明还涉及用于RNA体外转录的生物反应器。(The present invention relates to linear double stranded DNA coupled at its non-coding strand's 3' end to a single support or tag, and methods of making the same. The invention also relates to the use of said linear double-stranded DNA in RNA in vitro transcription reactions, and also to a method for the in vitro preparation of RNA. The invention also relates to a bioreactor for in vitro transcription of RNA.)

偶联到单一支持物或标签的线性双链DNA和用于制备所述线 性双链DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种线性双链DNA，其包含编码序列元件，所述编码序列元件在其非编码链的3'末端偶联到支持物或标签，并且其中所述支持物或标签是偶联到所述DNA的唯一支持物或标签。

本发明还涉及一种用于制备上述线性双链DNA的方法。几种方法包括将修饰的脱氧核苷酸添加到线性双链DNA的3'末端并将所述修饰的脱氧核苷酸偶联到支持物或标签的步骤。通过核酸内切酶消化所获得的线性双链DNA导致线性双链DNA，其仅在其非编码链的3'末端包含支持物或标签。另一种方法包括向线性双链DNA的每条链的3'末端添加连接了标签的脱氧核苷酸，然后进行核酸内切酶酶切，以获得在非编码链的3'末端带有单个标签的线性双链DNA。还有一种方法包括在具有平端和粘端的线性双链DNA的平端特异性地向所述非编码链的3'末端添加经修饰的脱氧核苷酸，并且还包括经由所述经修饰的脱氧核苷酸将所述DNA偶联到支持物或标签。还可以用连接了标签的脱氧核苷酸获得上述非编码链的3'末端的特异性添加。本发明提供了包含用于执行上述方法的必要组分的试剂盒。

包含编码序列元件和在其非编码链的3'末端的支持物或标签的线性双链DNA用于RNA体外转录的用途也是本发明的一部分。此外，本发明还提供了一种体外制备RNA的方法，包括提供如上所述的双链线性DNA作为模板DNA是本发明的一部分。另外，本发明涉及一种用于RNA体外转录的生物反应器，其包含如上所述的线性双链DNA。

背景技术

基于RNA的疗法是现代医药的最有前景和快速发展的领域之一，因此核糖核酸分子(RNA)代表了一类新兴药物。基于RNA的疗法为各种疾病的治疗提供高度特异性和单独的治疗选项，并且可以例如用于免疫治疗、基因治疗和遗传疫苗接种。因此，需要以合理的价格制备大量的高品质RNA。

通常，RNA是使用合适的DNA模板通过RNA体外转录反应产生的。为了获得适用于基于RNA的治疗剂的均质RNA，RNA必须具有独特的长度，这是通过在体外转录反应中精确终止RNA来实现的。控制RNA体外转录终止的常见方式是在RNA编码序列之后立刻对DNA模板进行线性化。这样就实现了所谓的失控(run-off)RNA体外转录。

为了获得适合在治疗中使用的高级RNA，必须进行各种质量控制步骤，例如确保DNA模板的正确线性化，以及随后通过DNA消化和随后的RNA纯化从RNA产物中除去DNA模板。

因此，RNA制备中的一个关键步骤是生成合适的DNA模板，这在工业规模是主要的成本因素。然而，目前，DNA模板通常只能用于单次RNA体外转录反应，随后需要通过DNAse消化而被破坏并且通过RNA纯化去除，以确保基于RNA的治疗剂的功效和安全性。在最终的基于RNA的治疗剂中残留量的DNA可能会诱导先天免疫系统的激活，并且具有在患者中充当致癌基因的可能。

因此，需要提供一种可再次使用的DNA模板，它在没有破坏的情况下可以容易且有效地从RNA体外转录反应分离。

Marble和Davis描述了从与琼脂糖微珠(bead)相关联的DNA模板进行的RNA体外转录，并且因此可以通过使用温和的离心回收微珠来再次使用。特别地，要在RNA体外转录反应中使用的DNA模板通过DNA模板的非模板链的5'末端的单个生物素与链霉亲和素包被的琼脂糖微珠相关联(Marble and Davis,Biotechnol.Prog.1995,11,393-396)。此外，Liu和Price描述了从DNA模板进行的RNA体外转录，所述DNA模板与链霉亲和素包被的顺磁性颗粒通过5'结合的生物素相关联，所述生物素已经通过聚合酶链式反应(PCR)使用生物素化引物添加到DNA模板中(Liu and Price,Promega Notes,64,1997,21-26)。Fujita和Silver描述了从线性双链DNA模板进行的RNA体外转录，该线性双链DNA模板一端有T7或T3 RNA聚合酶启动子，另一端有单个生物素部分连接到链霉亲和素包被的顺磁性微珠(Fujita andSilver,Biotechniques Rapid Dispatches,14(4)1993,608-617)。Fujita和Silver结论是，当DNA被定向成使得转录朝向微珠进行且DNA通过生物素-dUTP或生物素-dATP部分连接在非模板链的3'末端，合成的RNA的收率和质量大致相当于在溶液中制备的RNA。

如上所述的DNA模板(例如，琼脂糖或磁性颗粒)的基于PCR的关联性具有缺点：关联性是序列依赖性的(例如，必须为每个单独的DNA构建体设计不同的引物对)，并且DNA模板的基于PCR的制备是容易出错的。此外，上述实验室方法不适合在工业规模上大量制备RNA。

尽管已知化学的、非基于PCR的DNA固定化技术，但这些技术不提供DNA与单个支持物或标签的定向偶联。然而，当将DNA模板与支持物或标签偶联以容易且有效地将所述模板从RNA体外转录反应分离时，重要的是，这种偶联以定向方式进行，例如不损害RNA聚合酶(RNAP)的高效失控，这确保了均匀长度的RNA产物(参见图1)。

因此，当前没有方法可用于，在线性DNA模板生成(例如，在从生物体制备DNA之后)后，将支持物或标签与其进行定向非序列、非基于PCR的偶联。

因此，需要提供高质量的线性DNA模板，其在线性DNA模板的期望末端与支持物或标签相关联，并且其可以以相对低的成本大量制备，使得在工业规模上的RNA体外转录将变得可行。