作为用于阿尔茨海默氏病的生物标志物的miRNA

文档序号：1301709 发布日期：2020-08-07 浏览：7次 >En<

阅读说明：本技术 作为用于阿尔茨海默氏病的生物标志物的miRNA (MiRNAs as biomarkers for Alzheimer's disease ) 是由安德烈亚斯·凯勒马库斯·贝尔于 2018-10-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及确定患者中的阿尔茨海默氏病(AD)的方法。此外,本发明涉及多核苷酸用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的用途,所述多核苷酸用于对分离自患者的血液样品中的miRNA进行检测。此外,本发明涉及用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的试剂盒。(The present invention relates to methods of determining Alzheimer's Disease (AD) in a patient. Furthermore, the present invention relates to the use of a polynucleotide for the determination of alzheimer's disease in a patient, said polynucleotide being used for the detection of miRNA in a blood sample isolated from the patient. Furthermore, the invention relates to a kit for determining alzheimer's disease in a patient.)

本发明涉及用于确定患者中的阿尔茨海默氏病(AD)的方法。此外，本发明涉及多核苷酸用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的用途，所述多核苷酸用于对分离自患者的血液样品中的miRNA进行检测。此外，本发明涉及用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的试剂盒。

背景技术

分子诊断越来越重要。它已经进入疾病的临床诊断(尤其是传染性病原体检测、基因组突变检测、患病细胞检测以及鉴别疾病易感性的风险因子)。特别是，通过确定生物样品(例如体液和组织)中的基因表达，核酸分析为疾病的研究和诊断开辟了非常有前途的新可能性。

要检测的目标核酸包括基因组DNA、表达的mRNA和诸如微小RNA(缩写为miRNA)的其它RNA。miRNA是一类具有多种生物学功能的新型小RNA。它们是在真核细胞中发现的短(平均20-24个核苷酸)核糖核酸(RNA)分子。在哺乳动物中已经鉴别出数百种不同种类的miRNA(即数百种不同的序列)。它们对于转录后基因调节很重要，并与靶信使RNA转录物(mRNA)上的互补序列结合，这可能导致翻译抑制或靶标降解以及基因沉默。因此，它们也可用作研究、诊断和治疗目的的生物学标志物。

阿尔茨海默氏病(AD)在医学文献中也称为阿尔茨海默病，是最常见的痴呆形式。阿尔茨海默氏病的特征是大脑皮层和某些皮质下区域的神经元和突触丧失，并导致这些区域的严重变性。在AD中，脑中的蛋白错误折叠和集聚(形成所谓的“斑块”)是由异常折叠的A-β蛋白和tau蛋白在受影响的组织中积累引起的。

AD的早期症状通常被误认为是与年龄有关的问题。在AD的早期阶段，最常见的症状是难以记住最近发生的事件。当怀疑为AD时，通常通过评价行为和认知能力的功能测试来确认诊断，通常随后要对脑进行影像分析。用于此目的的影像学方法包括计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和正电子发射断层扫描(PET)。然而，需要进行脑组织检查(验尸)才能明确诊断。在已经患有痴呆的患者中，与通常使用精神测试和病史分析的尝试相比，SPECT似乎在区分阿尔茨海默氏病与其它可能病因方面似乎更优异。不过，上述AD诊断费时、昂贵且有困难。

miRNA已被建议作为诊断阿尔茨海默氏病的非侵入性生物标志物。特别是，已经建议检测患者生物样品中的miRNA，以确定患者是否患有阿尔茨海默氏病。然而，所述的基于miRNA的诊断测试的诊断能力以及从中获得的数据的可靠性尚有许多不足之处。特别是，基于非侵入性分子生物标志物的AD的可靠的早期诊断仍然是挑战。特别是，目前建议的miRNA标签仅允许分析特定人群(区域限制、特定国家)。

因此，迫切需要针对AD的强有力且可靠的诊断测试。该测试应允许测量非特定区域的人群、尤其是来自不同国家的人群。另一个临床需求是指导治疗并监测患者的疾病状况。

本发明满足了这些需求。特别是，本发明人发现了具有不同种族背景的群体以及不同国家中持有的新的阿尔茨海默标签。

发明内容

在第一方面，本发明涉及用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)确定分离自患者的血液样品中的包含在集中的至少3种miRNA(各自)的水平，其中，第一miRNA具有根据SEQ ID NO：1(hsa-miR-363-3p)的核苷酸序列；以及

(ii)将包含在所述集中的至少三种miRNA(各自)的水平与所述至少三种miRNA的参比水平进行比较，其中，所述比较允许确定患者中的阿尔茨海默氏病。

在第二方面，本发明涉及用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)确定分离自患者的血液样品中的至少3种miRNA(各自)的水平，其中，所述至少3种miRNA包含在集中，所述集选自于由以下所组成的组：

(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9；

(b)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4；

(c)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5；

(d)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6；

(e)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9；

(f)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：12；

(g)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQID NO：10；

(h)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8；

(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQID NO：13；

(j)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQID NO：11；

(k)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：11；

(l)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13；

(m)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(n)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(o)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12；

(p)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：12；

(q)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：14；

(r)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(s)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：15；

(t)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11；

(u)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQID NO：10；

(v)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：16；

(w)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17；

(x)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQID NO：17和SEQ ID NO：18；和

(y)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17；

以及

(ii)将包含在所述集中的至少三种miRNA(各自)的水平与所述至少三种miRNA的参比水平进行比较，其中，所述比较允许确定患者中的阿尔茨海默氏病。

在第三方面，本发明涉及至少三个多核苷酸用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的用途，所述至少三个多核苷酸用于检测分离自患者的血液样品中的包含在集中的至少三种miRNA，其中，第一miRNA具有根据SEQ ID NO：1(hsa-miR-363-3p)的核苷酸序列。

在第四方面，本发明涉及至少三个多核苷酸用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的用途，所述至少三个多核苷酸用于检测分离自患者的血液样品中的至少三种miRNA，其中，所述至少三种miRNA包含在集中，所述集选自于由以下所组成的组：

(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9；

(b)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4；

(c)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5；

(d)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6；

(e)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9；

(f)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：12；

(g)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQID NO：10；

(h)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8；

(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQID NO：13；

(j)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQID NO：11；

(k)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：11；

(l)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13；

(m)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(n)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(o)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12；

(p)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：12；

(q)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：14；

(r)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(s)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：15；

(t)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11；

(u)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQID NO：10；

(v)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：16；

(w)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17；

(x)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQID NO：17和SEQ ID NO：18；以及

(y)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17。

在第五方面，本发明涉及用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的试剂盒，所述试剂盒包含：

(i)确定分离自患者的血液样品中的包含在集中的至少三种miRNA(各自)的水平的工具，其中，第一miRNA具有根据SEQ ID NO：1(hsa-miR-363-3p)的核苷酸序列；和

(ii)任选至少三个参比。

在第六方面，本发明涉及用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的试剂盒，所述试剂盒包含：

(i)确定分离自患者的血液样品中的至少三种miRNA(各自)的水平的工具，其中，所述至少三种miRNA包含在集中，所述集选自于由以下所组成的组：

(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9；

(b)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4；

(c)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5；

(d)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6；

(e)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9；

(f)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：12；

(g)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQID NO：10；

(h)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8；

(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQID NO：13；

(j)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQID NO：11；

(k)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：11；

(l)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13；

(m)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(n)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(o)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12；

(p)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：12；

(q)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：14；

(r)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(s)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：15；

(t)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11；

(u)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQID NO：10；

(v)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：16；

(w)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17；

(x)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQID NO：17和SEQ ID NO：18；和

(y)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17；

以及

(ii)任选至少三个参比。

本发明的这一概述不一定描述本发明的所有特征和/或所有方面。通过阅读随后的详细描述，其它实施方式将变得显而易见。

具体实施方式

定义

在下面详细描述本发明之前，应理解的是，本发明并不限于本文所述的特定的方法学、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解的是，本文使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附的权利要求所限制。除非另有定义，本文所用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同含义。

优选地，按“A multilingual glossary of biotechnological terms：(IUPACRecommendations)”，Leuenberger,H.G.W，Nagel,B.和H.著(1995)，HelveticaChimica Acta，CH-4010Basel，Switzerland中所述，来定义本文使用的术语。

在本说明书全文中引用了若干文献。不论在上文或下文中，本文引用的各文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、使用说明、GenBank序列提交的登录号等)均通过引用的方式以其整体并入于此。不应将本文的任何内容解释为承认本发明无权借助在先发明而先于此类公开。如果此类并入的参考文献的定义或教导与本说明书中所列举的定义或教导之间冲突，本说明书的文本优先。

根据本发明，术语“包含/包括/含有(comprise)”或变化形式(例如，包含/包括/含有(“comprises”和“comprising”))是指包含所说明的整体或整体的组，但不排除任何其它整体或整体的组。根据本发明，术语“基本上由···组成(consisting essentially of)”是指包含所说明的整体或整体的组，同时排除实质上会影响或改变所说明的整体的其它整体或变型。根据本发明，术语“由···组成(consisting of)”或变化形式(例如，由···组成(“consists of”))是指包含所说明的整体或整体的组，并排除任何其它整体或整体的组。

除非本文另有指出或与上下文明显矛盾，在描述本发明的上下文中(尤其是权利要求的上下文中)所使用的术语“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”以及类似的指代应理解为涵盖单数和复数。

如本文所用，术语“微小RNA(microRNA)”或“miRNA”是指共价连接在一起的至少10个核苷酸且不超过45个核苷酸的单链RNA分子。优选地，用于本发明的多核苷酸是长度为10-45个核苷酸或15-35个核苷酸的分子，更优选长度为16-28个核苷酸或17-27个核苷酸的分子，即长度为10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个或45个核苷酸的分子，任选地不包括标记和/或延长的序列(例如生物素延伸段(stretches))。miRNA调节基因表达，并由从其DNA转录它们的基因编码，但miRNA不会被翻译成蛋白(即miRNA是非编码RNA)。编码miRNA的基因比加工后的成熟miRNA分子长。在细胞核中首先将miRNA转录成具有帽和多聚腺苷酸尾(poly-Atail)的初级转录物或pri-miRNA，然后将其加工成短的、70个核苷酸的茎环结构(称为pre-miRNA)。在动物中该加工由被称为微处理器复合体(Microprocessor complex)的蛋白复合体执行，所述微处理器复合体由核酸酶Drosha和双链RNA结合蛋白Pasha组成。然后，在细胞质中通过与核酸内切酶Dicer的相互作用，将这些pre-miRNA加工成成熟miRNA，所述核酸内切酶Dicer也启动RNA诱导的沉默复合体(RISC)的形成。当Dicer切割pre-miRNA茎环时，形成两个互补的短RNA分子，但只有一个被整合到RISC中。该链被称为引导链，并由argonaute蛋白(RISC中的催化活性的核糖核酸酶)基于5'端的稳定性来选择。被称为miRNA*、反向引导(反向链)或过客链的剩余链被降解为RISC底物。因此，像“正常”miRNA一样，miRNA*来自同一发夹结构。因此，如果“正常”miRNA后来被称为“成熟miRNA”或“引导链”，则miRNA*是“反向引导链”或“过客链”。该加工称为经典miRNA加工途径(canonical miRNA processingpathway)。

如本文所用，术语“微小RNA*(microRNA*)”或“miRNA*”是指共价连接在一起的至少10个核苷酸且不超过35个核苷酸的单链RNA分子。优选地，用于本发明的多核苷酸是长度为10-45个核苷酸或15-35个核苷酸的分子，更优选长度为16-28个核苷酸或18-23个核苷酸的分子，即长度为10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个或45个核苷酸的分子，任选地不包括标记和/或延长序列(例如生物素延伸段)。也被称为“反向引导链”或“过客链”的“miRNA*”大多与“成熟miRNA”或“引导链”互补，但在每个末端通常具有单链垂悬(overhang)。通常有个或多个错误配对，有时有额外或缺失的碱基，其导致单链“气泡”。miRNA*可能像miRNA一样以调节方式起作用(也参见上文)。在本发明的上下文中，术语“miRNA”和“miRNA*”可互换使用。

如本文所用，术语“miRBase”是指经过验证的miRNA的建立完善的储存库。miRBase是已公布的miRNA序列和注释的可搜索数据库。miRBase序列数据库中的每个条目表示miRNA转录物(在数据库中称为mir)的预测发夹部分，具有关于成熟miRNA序列(称为miR)的位置和序列的信息。发夹序列和成熟序列都可用于搜索和浏览，也可通过名称、关键字、参考文献和注释来检索条目。所有的序列和注释数据也都可下载。

本文所述的miRNA具有选自于由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24所组成的组的核苷酸序列；包含选自于由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24所组成的组的核苷酸序列；基本上由选自于由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24所组成的组的核苷酸序列组成；或者由选自于由SEQID NO：1至SEQ ID NO：24所组成的组的核苷酸序列组成。

如本文所用，术语“核苷酸”是指DNA和RNA的结构组分或构筑单元。核苷酸由碱基(四种化学物质之一：腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶)加上糖分子和一个磷酸组成。术语“核苷”是指由与核糖或脱氧核糖结合的核碱基(通常简称为碱基)组成的葡基胺(glycosylamine)。核苷的实例包括胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、胸苷和肌苷。在细胞中可以通过特定激酶在糖的伯醇基团(-CH2-OH)上磷酸化核苷，产生核苷酸，其是DNA和RNA的分子构筑单元。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指共价连接在一起的至少10个核苷酸且不超过35个核苷酸的分子。优选地，用于本发明的多核苷酸是长度为10-35个核苷酸或15-45个核苷酸的分子，更优选长度为16-28个核苷酸或17-27个核苷酸的分子，即长度为10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个或45个核苷酸的分子，任选地不包括下述的间隔元件和/或延长元件。多核苷酸单链的描述也限定了互补链的序列。多核苷酸可为单链或双链，或者可含有双链序列和单链序列的部分。术语“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基的聚合物，并且包括DNA和RNA分子，有义链和反义链二者。具体而言，多核苷酸可为DNA(cDNA和基因组DNA)、RNA、cRNA或杂交体(hybrid)，其中多核苷酸序列可含有脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤在内的碱基的组合。可通过化学合成方法或者通过重组方法获得多核苷酸。

在本发明的上下文中，作为单链多核苷酸的多核苷酸提供探针(例如，miRNA捕获探针)，其能够通过一种或多种类型的化学键(通常通过互补碱基配对，通常通过氢键形成)结合、杂交或检测互补序列的靶标(例如miRNA或miRNA*的核苷酸序列)。其功能为探针的多核苷酸可结合与多核苷酸的序列缺乏完全互补性的靶标序列(例如miRNA或miRNA*的核苷酸序列)，这取决于杂交条件的严格性。可存在任何数量的碱基对错配，其将干扰本文所述的单链多核苷酸与靶标序列(例如miRNA或miRNA*的核苷酸序列)之间的杂交。然而，如果突变的数量很大以至于即使在最不严格的杂交条件下也不会发生杂交，则这些序列不是互补序列。下文进一步定义了多核苷酸变体(包括多核苷酸片段或多核苷酸突变体)以及miRNA变体(包括miRNA片段或miRNA突变体)。本文描述了作为探针的单多核苷酸链形式的多核苷酸，用于结合、杂交或检测miRNA(靶标)的互补序列，所述miRNA(靶标)选自于由SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：24所组成的组。

多核苷酸(例如用作检测miRNA或miRNA*的探针的多核苷酸)可为未标记的多核苷酸、直接标记的多核苷酸或者间接标记的多核苷酸(例如用生物素标记，链霉亲和素复合体之后可结合至所述生物素)。多核苷酸(例如用作检测miRNA或miRNA*的探针的多核苷酸)还可被修饰，例如可包含延长(EL)元件。为了用于RAKE或MPEA分析中，可将具有延长元件的多核苷酸用作探针。延长元件包含具有1-30个核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列基于与潜在靶标序列(例如miRNA或miRNA*的核苷酸序列)显示低互补性来选择，因此不会导致与靶标混合物低程度交叉杂交。优选为同聚物序列延伸段(homomeric sequence stretch)N_n，其中n＝1-30(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)，并且N＝A或C或者T或G。特别优选为同聚物序列延伸段N_n，其中n＝1-12(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)，并且N＝A或C或者T或G。多核苷酸(例如用作检测miRNA或miRNA*的探针的多核苷酸)可以以串联形式存在，即以两个不同或相同的多核苷酸的多核苷酸混合体形式存在，两者的方向相同(即5'至3'或3'至5')或两者方向不同(即5'至3'和3'至5')。所述多核苷酸混合体/串联体可包含间隔元件。为了用于串联杂交分析，作为探针的多核苷酸混合体/串联体可包含间隔(SP)元件。间隔元件代表具有n＝0-12个核苷酸(即0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个核苷酸)的核苷酸序列，所述核苷酸序列基于与潜在靶标序列(例如miRNA或反向miRNA的核苷酸序列)显示低互补性来选择，因此不导致与靶标混合物低程度的交叉杂交。优选n为0，即在两个miRNA序列延伸段之间没有间隔。

如本文所用的术语核酸分子的“差异表达”是指暂时的和/或局部的核酸分子表达模式(例如在血液样品内和/或之间)中的定性和/或量性差异。因此，差异表达的核酸分子可定性地改变其表达，包括例如相对于来自健康受试者的血液，在来自疾病受试者的血液中的激活或失活。核酸分子表达中的差异也可为量性的，例如，因为该表达被调控，即导致核酸分子的量增加的上调，或者导致核酸分子的量减少的下调。核酸分子表达差异的程度仅需要大到足以通过标准表达表征技术来量化，例如，通过定量杂交(例如与微阵列、珠)、扩增(PCR、RT-PCR、qRT-PCR、高通量RT-PCR)、定量ELISA、下一代测序(例如ABI SOLID、Illumina Genome Analyzer、Roche 454GS FL、BGISEQ)、流式细胞术(例如LUMINEX)等。

如本文所用，术语“标签”是指可通过光谱学手段、光化学手段、生物化学手段、免疫化学手段、化学手段或其它物理手段检测的组合物。例如，有用的标签包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，如在ELISA中通常使用的酶)、生物素、地高辛、或半抗原，以及可被检测到的其它实体。标签可掺入核酸的任何位置(例如在3'或5'端或内部)。用于检测miRNA的多核苷酸(多核苷酸探针)和/或miRNA本身可被标记。

如本文所用，术语“严格杂交条件”意味着以下条件：例如在复杂的核酸混合物中，在所述条件下第一核酸序列(例如，其功能为检测miRNA或miRNA*的探针的多核苷酸)将与第二核酸序列(例如，靶标序列，如miRNA或miRNA*的核苷酸序列))杂交。严格条件是序列依赖性的，并且在不同环境下会有所不同。严格条件可选择为在限定的离子强度pH下比特定序列的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm可为平衡时在该温度下50％的与靶标互补的探针杂交至靶标序列的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)，因为靶标序列过量存在，在Tm下50％的探针以平衡状态被占据。严格条件可为以下条件：其中，在pH 7.0-8.3时盐浓度小于约1.0M钠离子(例如约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐))，并且对于短探针(例如，约10-35个核苷酸)温度至少为约20℃，对于长探针(例如，大于约50个核苷酸)温度高至60℃。通过添加去稳定剂(如甲酰胺)也可实现严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可为背景杂交的至少2-10倍。示例性严格杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，在42℃下孵育；或者，5×SSC、1％SDS，在65℃下孵育，在65℃下于0.2×SSC和0.1％SDS中洗涤；或者，6×SSPE、10％甲酰胺、0.01％吐温20、0.1×TE缓冲液、0.5mg/mL BSA、0.1mg/mL鲱鱼精子DNA，在42℃下孵育，在45℃下于05×SSPE和6×SSPE中洗涤。

如本文所用，术语“反义”是指与特定DNA或RNA序列互补的核苷酸序列。术语“反义链”用于指与“有义”链互补的核酸链。

如果两个或多个多核苷酸中的残基在多核苷酸结构中占据类似位置，则称它们彼此“对应”。在本领域中众所周知，可通过基于核酸序列或结构相似性比对多核苷酸序列来确定两个或多个多核苷酸中的类似位置。此类比对工具是本领域技术人员公知的，并且例如可在万维网上获得，例如，使用标准设置的Align或ClustalW，优选Align EMBOSS:：needle、Matrix：Blosum62、Gap Open10.0、Gap Extend 0.5。

如本文所用，术语“水平”是指本文所述的miRNA的量(例如，以克、摩尔或诸如离子或荧光计数之类的计数进行测量)或浓度(例如绝对或相对浓度)，所述miRNA特别是具有选自于由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24所组成的组的核苷酸序列的miRNA、包含选自于由SEQID NO：1至SEQ ID NO：24所组成的组的核苷酸序列的miRNA、基本上由选自于由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24所组成的组的核苷酸序列组成的miRNA、或由选自于由SEQ ID NO：1至SEQID NO：24所组成的组的核苷酸序列组成的miRNA。

如本文所用，术语“水平”还包括缩放的的量或值、归一化的的量或值、或者缩放且归一化的量或值。优选地，本文确定的水平是表达水平。

如本文所用，术语“灵敏度”是指相对于所有患者的数量(100％)的真阳性患者数量(％)。患者可为具有AD的受试者。灵敏度通过以下公式计算：灵敏度＝TP/(TP+FN)(TP＝真阳性；FN＝假阴性)。

如本文所用，术语“特异性”涉及相对于所有健康受试者的数量(100％)的真阴性患者的数量(％)。特异性通过以下公式计算：特异性＝TN/(TN+FP)(TN＝真阴性；FP＝假阳性)。

如本文所用，术语“精度”指用于样品类型的分类或鉴别的正确性的统计量度。精度是真实结果(真阳性和真阴性二者)的比例。

每个分析组的结果通常是由例如选自于由未患有AD的受试者(即，相对于AD而言健康的受试者)和患有AD的受试者所组成的组的多个独立的样品(即由至少2个独立的样品，优选由2-20个、更优选由10-60个、甚至更优选由50-100个独立的样品)计算而得。本发明的方法可与用于确定患者中AD的其它方法结合进行，以增加整体敏感性和/或特异性。本文提及的miRNA水平的计算/检测允许确定患者中的AD。特别是，阿尔茨海默氏病的确定包括：诊断患者是否患有阿尔茨海默氏病；确定患者中是否存在阿尔茨海默氏病；确定患者中是否不存在阿尔茨海默氏病；和/或确定患者中阿尔茨海默氏病的病程。

如本文所用，术语“AUC”指曲线下面积的缩写。特别是，它是指受试者工作特征(ROC)曲线下的面积。如本文所用，术语“受试者工作特征(ROC)曲线”是指针对诊断测试的不同可能的切点的真实阳性率相对于阴性阳性率的绘图。它显示了灵敏度和特异性之间的权衡，取决于所选的切点(灵敏度的任何提高都会伴随特异性的降低)。ROC曲线下的面积是诊断测试的精度的度量(面积越大越好，最优为1，随机测试的ROC曲线位于对角线，面积为0.5(参见例如JP.Egan.Signal Detection Theory and ROC Analysis，以供参考)。

如本文所用，术语“阿尔茨海默氏病(AD)”是指神经退行性疾病。它是最常见的痴呆形式。阿尔茨海默氏病的特征是大脑皮层和某些皮质下区域的神经元和突触丧失，并导致这些区域的严重变性。在阿尔茨海默氏病中，脑中的蛋白错误折叠和集聚(形成所谓的“斑块”)是由异常折叠的A-β蛋白和tau蛋白在受影响的组织中积累引起的。最常见的早期症状是难以记住最近发生的事件(短期记忆丧失)。随着疾病的进展，症状可包括语言问题、迷失方向、情绪波动、失去动力、无法自理和行为问题。随着人的病情恶化，他们往往退出家庭和社会。逐渐地，身体功能丧失，最终导致死亡。AD可能难以准确诊断。可能的诊断基于疾病的病史和认知测试以及医学影像和血液测试，以排除其它可能的病因。最初的症状经常被误认为是正常衰老。为了确定诊断，需要检查脑组织(验尸)。已知一些基于生物标志物(例如miRNA)的诊断测试。然而，本发明人发现了在具有不同种族背景的群体和不同国家中持有的新的阿尔茨海默miRNA标签。因此，所述miRNA标签允许可靠地确定患者中的AD。尤其是，新的标签允许对来自不同国家的人群进行测量，从而在不同方面改善了翻译过程。首先，由于可包括来自不同国家的患者，因此可更容易获得所需的人群规模。其次，监管程序可简化到某个方面。第三，相同的分析格式和布局可在不同的国家使用，从而降低了成本。在相同的方向上，可应用相同的计算方案。

如本文所用，术语“确定患者中的阿尔茨海默氏病”优选涵盖：诊断患者是否患有阿尔茨海默氏病；确定患者中是否存在阿尔茨海默氏病；确定患者中是否不存在阿尔茨海默氏病；和/或确定患者的阿尔茨海默氏病病程。

如本文所用，术语“将患者(怀疑具有AD)诊断为具有阿尔茨海默氏病(AD)”意味着确定患者是否患有AD。因此，可将患者诊断为患有AD。

如本文所用，术语“确定患者(怀疑具有AD)中AD的存在”意味着确定患者是否显示AD体征。因此，可确定患者中是否存在AD。

如本文所用，术语“确定患者(怀疑具有AD)中不存在AD”意味着确定患者是否未显示AD体征。因此，可确定患者中是否不存在AD。

如本文所用，术语“确定患者是否处于发展为AD的风险”意味着确定患者是否将显示AD体征，特别是在将来，例如，在接下来的1、2、3、4或5年内。因此，可确定患者是否有发展为AD的倾向或将可能发展为AD。

如本文所用，术语“确定患者中的阿尔茨海默氏病(AD)病程”意味着确定AD随时间的发展，例如，随着时间AD是否在患者中恶化、是否在患者中未恶化/稳定、或者是否在患者中改善。特别是，待测试的患者是具有/患有AD的患者。

如本文所用，术语“诊断”是指确定可能的疾病或紊乱的过程，因此，是试图定义患者的(临床)状况的过程。根据本发明确定的miRNA的水平与患者的(临床)状况有关。优选地，诊断包括(i)确定AD的发生，尤其是在疾病的(非常)早期阶段；(ii)AD的分期；(iii)测量具有AD的患者对治疗性干预的反应；和/或(iv)对患有AD的患者的细分。

如本文所用，术语“患者”是指希望知道她或他是否患有/具有阿尔茨海默氏病(AD)的任何受试者。

具体而言，如本文所用，术语“患者”是指怀疑受AD影响的受试者。可将患者诊断为受AD影响，即患病；或者可将患者诊断为未受AD影响，即就AD而言健康。此外，可确定患者中是否存在或不存在AD。

如本文所用，术语“患者”还指受AD影响(即患病)的受试者。可再次测试患者的AD，并且可诊断出该患者仍然受AD的影响，例如，轻度形式的AD或者晚期/重度形式的AD。

可进一步确定随着时间AD在患者中是否恶化，在患者中是否稳定或在患者中是否改善。例如，可确定患有轻度形式AD的患者是否随时间发展为晚期/重度形式的AD。

如本文所用，术语“患者”还指期望了解她或他是否可能/将(在将来)发展为AD的任何受试者。具体而言，如本文所用，术语“患者”是指具有发展为AD的倾向或将可能发展为AD的受试者。可确定患者是否有发展为AD的风险/是否处于发展为AD的风险之中。

应当注意，被诊断为未患有AD的患者(即，相对于AD而言健康)的患者可能患有另一未经测试/已知的疾病。

患者可为任何哺乳动物，包括人和另一哺乳动物，例如，诸如兔子、小鼠、大鼠或猴的动物。特别优选人受试者作为患者。

如本文所用，术语“(对照)受试者”是指已知不受AD影响(即相对于AD而言健康)的受试者(阴性对照)。如本文所用，术语“(对照)受试者”还指已知受AD影响(即患病)的受试者。所述(对照)受试者可能已经发展为晚期形式的AD。

应当注意，已知未患有AD(即相对于AD而言健康)的(对照)受试者可能患有另一未经测试/已知的疾病。

(对照)受试者可为任何哺乳动物，包括人和另一哺乳动物，例如，诸如兔子、小鼠、大鼠或猴的动物。特别优选人(对照)受试者。

如本文所用，术语“治疗”、特别是“治疗性治疗”是指改善健康状况和/或延长(增加)患者寿命的任何疗法。所述疗法可消除患者的疾病，阻止或减慢患者的疾病发展，抑制或减慢患者的疾病发展，降低患者的症状的频率或严重性，和/或降低当前或以前具有疾病的患者的复发。在阿尔茨海默氏病(AD)的情况下，(治疗性)治疗包括但不限于给予药物、认知训练、运动疗法和心理疗法。药物可选自于由抗痴呆剂、抗抑郁剂和精神安定药所组成的组。

如本文所用，术语“血液样品”是指允许确定患者中的阿尔茨海默氏病和/或可用于控制目的的任何血液样品。特别是，本文所用的术语“血液样品”涵盖全血或血液级分，例如血细胞/细胞级分、血清或血浆。优选全血、血清或血浆样品的体积在0.01-20mL之间，更优选在0.1-10mL之间，甚至更优选在0.5-8mL之间，最优选在1-5mL之间。

所述血液样品可通过从患者或(对照)受试者中移出血液来提供，但也可通过使用先前分离的样品来提供。例如，可通过常规的血液采集技术从患者或(对照)受试者采集血液样品。

可在开始治疗性治疗之前、治疗性治疗期间和/或治疗性治疗之后进一步从患者或(对照)受试者获得血液样品。如果血液样品获得自至少一个(对照)受试者(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500或1000个(对照)受试者)，则将其指定为“参比血液样品”。优选地，参比血液样品来自与待测试的患者的血液样品来自相同的来源，例如，两者都是全血样品或血细胞/细胞级分。进一步优选两者均来自相同物种，例如来自人。(可选地或另外地)还优选的是，(对照)受试者的参比血液样品的测量和待测试的患者的血液样品的测量是一致的，例如，两者的体积相同。特别优选地，参比血液样品和血液样品来自相同性别和相似年龄的(对照)受试者/患者。

优选通过采血管收集全血样品。例如，将其收集在PAXgene Blood RNA管、TempusBlood RNA管、EDTA管、柠檬酸钠管、肝素管或ACD管(柠檬酸右旋糖)中。优选地，当收集全血样品时，可保护/确保RNA级分、尤其是miRNA级分免于降解。为了这一目的，可使用稳定RNA级分和/或miRNA级分的专门收集管(例如，Preanalytix的PAXgene Blood RNA管，AppliedBiosystems的Tempus Blood RNA管)或添加剂(例如，Ambion的RNAlater，Promega的RNAsin)。

还优选通过血斑技术(bloodspot technique)(例如使用Mitra MicrosamplingDevice)收集全血样品。该技术需要较小的样品体积，对于人而言通常为45-60μL或更少。例如，全血可经由用针或刺血针扎手指从患者中提取。因此，全血样品可具有血滴的形式。然后，将所述血滴放置在吸收探针(例如亲水性聚合材料，如纤维素)上，其能够吸收全血。采样完成后，将血斑在空气中干燥，然后转移或邮寄到实验室进行处理。由于血液被干燥，因此不被认为是危险的。因此，在处理或运输时不需要采取特殊的防护措施。处于分析位置后，将所需的组分(例如miRNA)从干燥的血斑中提取到上清液中，然后进行进一步分析。此技术适用于在家中监测患有AD或处于AD风险的患者(基于家庭护理/家庭抽样)，或者用于筛查目的。

如本文所用，术语“血细胞/细胞组分”是指通过去除细胞外级分(血清和/或血浆)而由全血产生的血细胞/细胞级分。换句话说，血细胞/细胞级分除去了细胞外血液组分，例如血清和/或血浆。优选地，血细胞/细胞部分包含红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)；或基本上由红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)组成；或由红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)组成。

在一个实施方式中，血液样品为血细胞/细胞级分。优选地，血细胞/细胞级分包含红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)；或基本上由红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)组成；或由红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)组成。

在一个可选实施方式中，血液样品是血细胞样品。优选地，血细胞样品包含红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)；或基本上由红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)组成；或由红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)组成。

在另一可选实施方式中，血液样品为源自全血的血细胞制剂。

如本文所用，术语“源自全血样品的血细胞制剂”是指全血样品的制剂，所述制剂包含血细胞(红细胞、白细胞和/或血小板，例如红细胞、白细胞和血小板)；或基本上由血细胞(红细胞、白细胞和/或血小板，例如红细胞、白细胞和血小板)组成；或由血细胞(红细胞、白细胞和/或血小板，例如红细胞、白细胞和血小板)组成。

源自全血样品的血细胞制剂优选由全血样品的处理而获得，所述全血样品收集在PAXgene Blood RNA管、Tempus Blood RNA管、EDTA管、柠檬酸钠管或肝素管中，以维持或大体上维持全血样品的初始细胞分布(血细胞组分)，所述血细胞制剂包含红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)，或基本上由红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)组成，或由红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)组成。优选地，全血样品收集在例如PAXgene RNA管中，并根据制造商的方案进行处理，得到血细胞制剂，从中分离总RNA(包含含有miRNA级分的短RNA级分)，并根据本发明用于确定所述样品中的miRNA水平；所述血细胞制剂包含红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)，或基本上由红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)组成，或由红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)组成。

在本发明的另一实施方式中，源自全血样品的血细胞制剂由全血样品的处理而获得，所述全血样品收集在PAXgene Blood RNA管、Tempus Blood RNA管、EDTA管、柠檬酸钠管或肝素管中，不一定要维持或不一定要大体上维持全血样品的初始细胞分布(血细胞组分)；所述血细胞制剂包含红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)，或基本上由红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)组成，或由红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)组成。

关于包含红细胞、白细胞和血小板的血细胞级分或血细胞制剂，或基本上由红细胞、白细胞和血小板组成的血细胞级分或血细胞制剂，或由红细胞、白细胞和血小板组成的血细胞级分或血细胞制剂，应注意，确定的miRNA水平代表红细胞、白细胞和血小板的混合物中miRNA水平的(数学上的)平均值。

如本文所用，术语“总RNA”涉及分离的RNA，所述分离的RNA包含存在于血液样品(例如，源自全血样品的血细胞制剂)中的miRNA级分。优选地，根据本发明的总RNA包含miRNA级分或者包含分离的RNA的富含miRNA的级分。例如，总RNA(包含miRNA级分或富含miRNA的级分)通过以下来获得：将血细胞制剂中的血细胞裂解(例如，Trizol)，然后进行RNA纯化(例如，通过苯酚/氯仿萃取和/或基于分离的技术(例如玻璃纤维过滤柱、硅胶膜柱))。用于RNA分离和纯化的试剂盒的示例包括miRNeasy试剂盒(Qiagen)、PAXgene BloodmiRNA试剂盒(Qiagen)、mirVana PARIS试剂盒(Life Technologies)、PARIS试剂盒(LifeTechnologies)、Tempus Spin RNA Isolation试剂盒(Life Technologies)。

在本发明的上下文中，术语“部件套件(简称：试剂盒)”应理解为是本文所认定的组件的至少一些的任意组合，这些组件组合成(在空间上共存于)功能单元，并且其中可包含其它组件。所述试剂盒可允许即时检测(POCT)。

如本文所用，术语“即时检测(POCT)”是指在护理点或护理点附近的医学诊断，护理点为患者护理的时间和地点。这与历史模式相反，在历史模式中，测试完全或大部分局限于医学实验室，其要求将样本从护理点送出，然后等待数小时或数天以知晓结果，在此期间，必须继续进行护理而没有所期望信息。即时检测是可在床边进行的简单医学测试。POCT背后的驱动理念是方便快捷地将测试给予待测试的患者。这增加了患者、医生和护理团队更快收到结果的可能性，从而允许立即做出临床管理决策。POCT通常通过使用可移动、便携式和手持式仪器和测试试剂盒来实现。当手持式设备不可用时，也可使用小型台式分析仪或固定式设备-目的是在很短的时间内在患者所在位置或附近采集样本并获得结果，以便可在患者出院前根据需要对治疗计划进行调整。

本发明的实施方式

通过心理测试和病史分析来诊断AD费时、昂贵又困难。miRNA已被建议作为诊断阿尔茨海默氏病的非侵入性生物标志物。特别是，已经推荐检测患者生物样品中的miRNA，以确定患者是否患有阿尔茨海默氏病。然而，所述的基于miRNA的诊断测试的诊断能力以及从中获得的数据的可靠性尚有许多不足之处。特别是，基于非侵入性分子生物标志物的AD的可靠的早期诊断仍然是挑战。尤其是，建议的miRNA标签仅允许分析特定人群(区域限制、特定国家)。本发明人发现了在不同国家和具有不同种族背景的群体中持有的新的阿尔茨海默标签。尤其是，新的标签允许对来自不同国家的人群进行测量，这在不同方面改善了翻译过程。首先，由于可包括来自不同国家的患者，因此可更轻松地获得所需的人群规模。其次，监管程序可简化到某个方面。第三，相同的分析格式和布局可在不同的国家使用，从而降低了成本。在相同的方向上，可应用相同的计算方案。

因此，在第一方面，本发明涉及用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的(体外)方法，所述方法包括以下步骤：

(i)确定来自患者的血液样品中的包含在集中的至少3种miRNA(例如，至少3种、4种、5种或6种miRNA或7种miRNA)(各自)的水平，其中，第一miRNA具有根据SEQ ID NO：1(hsa-miR-363-3p)的核苷酸序列或者与其具有至少90％、优选至少95％、更优选至少99％(即，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性的核苷酸序列；以及

(ii)将包含在所述集中的至少三种miRNA(各自)的水平与所述至少三种miRNA的参比水平进行比较，其中，所述比较允许确定患者中的阿尔茨海默氏病。

优选地，第二miRNA和第三miRNA具有选自于由SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：18所组成的组的核苷酸序列。或者，根据SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：18的miRNA的核苷酸序列是与其具有至少90％、优选至少95％、更优选至少99％(即，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性的核苷酸序列。

更优选地，第二miRNA具有根据SEQ ID NO：2(hsa-miR-28-3p)或SEQ ID NO：3(hsa-let-7e-5p)的核苷酸序列，并且其中，在第二miRNA和第三miRNA不同的前提下，第三miRNA具有选自于由SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：18所组成的组的核苷酸序列。

甚至更优选地，第二miRNA具有根据SEQ ID NO：2的核苷酸序列，并且第三miRNA具有选自于由SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：15所组成的组的核苷酸序列。

还甚至更优选地，第二miRNA具有根据SEQ ID NO：3的核苷酸序列，并且第三miRNA具有选自于由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：11、以及SEQ ID NO：16-SEQ ID NO：18所组成的组的核苷酸序列。

特别优选地，第二miRNA具有根据SEQ ID NO：2(hsa-miR-28-3p)的核苷酸序列，并且第三miRNA具有根据SEQ ID NO：3(hsa-let-7e-5p)的核苷酸序列。

最优选地，所述至少三种miRNA包含在集中，所述集选自于由以下所组成的组：

(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9；

(b)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4；

(c)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5；

(d)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6；

(e)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9；

(f)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：12；

(g)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQID NO：10；

(h)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8；

(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQID NO：13；

(j)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQID NO：11；

(k)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：11；

(l)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13；

(m)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(n)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(o)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12；

(p)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：12；

(q)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：14；

(r)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(s)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：15；

(t)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11；

(u)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQID NO：10；

(v)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：16；

(w)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17；

(x)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQID NO：17和SEQ ID NO：18；以及

(y)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17。

应当注意，所述至少三种miRNA具有如根据(a)至(y)的集中所示的核苷酸序列。例如，根据(a)的集包含具有根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列的miRNA、具有根据SEQ ID NO：2的核苷酸序列的miRNA和具有根据SEQ ID NO：9的核苷酸序列的miRNA。

确定miRNA水平的患者可为怀疑患有/具有AD的患者或者患有/具有AD的患者。在后一种情况下，可就AD对患者进行再次测试(例如，一段时间后)。

参比水平可为允许确定或不确定患者中AD的任何水平。所述参比水平可获得自(对照)受试者(即不同于待测试/诊断的患者的受试者)或同一患者。在后一种情况下，可就AD再次测试患者，例如以纵向监测的形式。可确定患者当前受AD影响或仍未受AD影响。

优选地，参比水平为通过测量至少一个参比血液样品而确定的水平，所述至少一个参比血液样品来自

至少一名健康受试者，或

至少一名具有阿尔茨海默氏病的受试者。

优选地，参比水平为通过测量从至少一个健康(即未患有AD)的(对照)受试者(例如从至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个或1000个健康(即未患有AD)的(对照)受试者)分离的至少一个参比血液样本(例如至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个或1000个参比血液样品)而确定的水平。更优选地，参比水平为通过测量从2-500个健康(即未患有AD)的受试者中分离的2-500个参比血液样品而确定的水平。甚至更优选地，参比水平通过测量从50-500个健康(即未患有AD)的受试者分离的50-500个参比血液样品来确定。最优选地，参比水平通过测量从100-500个健康(即未患有AD)的受试者分离的100-500个参比血液样品来确定。

或者，优选地，参比水平为通过测量从至少一个具有AD的(对照)受试者(例如从至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个或1000个具有AD的(对照)受试者)分离的至少一个参比血液样品(例如至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个或1000个参比血液样品)而确定的水平。更优选地，参比水平为通过测量从2-500个具有AD的受试者分离的2-500个参比血液样品而确定的水平。甚至更优选地，参比水平通过测量从50-500个具有AD的受试者分离的50-500个参比血液样品来确定。最优选地，参比水平通过测量从100-500个具有AD的受试者分离的100-500个参比血液样品来确定。

每受试者抽取一个参比血液样品进行分析是可行的。如果需要额外的参比血液样品(例如为了确定不同参比血液样品中的参比水平)，可对同一受试者进行(再次)测试。所述参比水平可为平均参比水平。所述平均参比水平可通过测量参比水平并计算其“平均”值(例如，平均值、中位值或众数值)来确定。优选地，参比血液样品与从患者分离的血液样品来自相同的来源(例如血细胞样品)。进一步优选地，参比水平获得自与待测试或诊断的患者相同性别(例如雌性/女性或者雄性/男性)和/或类似年龄/生命阶段(例如成年或老年)的受试者。

在一个实施方式中，阿尔茨海默氏病(AD)的确定包括诊断患者(怀疑具有AD)是否患有AD。在这种情况下，参比水平可为允许确定患者(怀疑具有AD)是否患有AD的任何水平。其可获得自(对照)受试者(即不同于待测试/诊断的患者的受试者)或获得自同一患者。在后一种情况中，可就AD再次测试患者。特别是，参比水平为通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品而确定的水平(参见上文)。

优选地，

具有选自于由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：18所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平高于参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者患有阿尔茨海默氏病；和/或

具有选自于由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：17所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平低于参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者患有阿尔茨海默氏病。

因此，例如，当确定集(a)中所包含的miRNA(即具有根据SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9的核苷酸序列的miRNA)的水平时，并当具有根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列的miRNA的水平高于参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，而具有根据SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9的核苷酸序列的miRNA水平低于参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参照血液样品来确定)时，这表明患者患有AD。

特别是，miRNA的水平低于/高于参比水平至少0.4倍、至少0.5倍、至少0.6倍或至少0.7倍，优选至少0.8倍或至少0.9倍，更优选至少1.2倍或至少1.5倍，甚至更优选至少2.0倍或至少3.0倍。例如，miRNA的水平低于/高于参比水平至少0.4倍、至少0.5倍、至少0.6倍、至少0.7倍、至少0.8倍、至少0.9倍、至少1.0倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍或至少3.0倍。

在另一实施方式中，阿尔茨海默氏病(AD)的确定包括确定患者(怀疑具有AD)中是否存在AD。在这种情况下，参比水平可为允许确定患者(怀疑具有AD)中是否存在AD的任何水平。其可获得自(对照)受试者(即不同于待测试患者的受试者)或同一患者。在后一种情况下，可就AD再次测试患者。特别是，参比水平为通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品而确定的水平(参见上文)。

优选地，

具有选自于由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：18所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平高于参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者中存在阿尔茨海默氏病；和/或

具有选自于由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：17所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平低于参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者中存在阿尔茨海默氏病。

在另一实施方式中，阿尔茨海默氏病(AD)的确定包括确定患者(怀疑具有AD)中是否不存在AD。在这种情况下，参比水平可为允许确定患者(怀疑具有AD)中是否不存在AD的任何水平。其可获得自(对照)受试者(即不同于待测试患者的受试者)或同一患者。在后一种情况下，可就AD再次测试患者。特别是，参比水平为通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品而确定的水平(参见上文)。

优选地，

具有选自于由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：18所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平与参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品而确定)相当，表明患者中不存在阿尔茨海默氏病；

具有选自于由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：17所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平与参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品而确定)相当，表明患者中不存在阿尔茨海默氏病；

具有选自于由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：18所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平低于参比水平(通过测量至少一名具有阿尔茨海默氏病的受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者中不存在阿尔茨海默氏病；和/或

具有选自于由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：17所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平高于参比水平(通过测量至少一名具有阿尔茨海默氏病的受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者中不存在阿尔茨海默氏病。

在这方面与参比水平“相当”的水平意味着该水平高于参比水平不超过15％、优选不超过10％、更优选不超过5％；或者该水平低于参比水平不超过15％、优选不超过10％、更优选不超过5％。

或者，在这方面与参比水平相当的水平意味着所检测的水平变化在测量精度之内。测量精度取决于所使用的测量方法。

在另一实施方式中，阿尔茨海默氏病(AD)的确定包括确定患者是否处于发展为AD的风险中。在这种情况下，参比水平可为允许确定患者是否处于发展为AD的风险的任何水平。其可获得自(对照)受试者(即不同于待测试患者的受试者)或同一患者。在后一种情况下，可就AD再次测试患者。特别是，参比水平为通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品而确定的水平(参见上文)。该确定可具有筛选方法的形式。所述筛选方法允许及早检测AD，并由此鉴别例如在不久的将来(例如在接下来的1、2、3、4或5年内)具有发展为AD的倾向或可能性的患者(例如，基于其身体和/或生理状况)。

优选地，

具有选自于由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：18所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平高于参比水平(通过测量至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者处于发展为阿尔茨海默氏病的风险中；和/或

具有选自于由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：17所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平低于参比水平(通过测量至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者处于发展为阿尔茨海默氏病的风险中。

在另一实施方式中，阿尔茨海默氏病(AD)的确定包括确定患者(具有AD)中AD的病程。在这种情况下，参比水平可为允许确定患者(具有AD)的AD病程的任何水平。其可获得自(对照)受试者(即不同于待测试/诊断的患者的受试者)或同一患者。在后一种情况下，可再次测试患者的AD。可确定：患者中AD是否恶化，患者中AD是否未恶化/是否稳定，或者患者中AD是否改善。特别是，参比水平为通过测量来自至少一名具有AD的受试者的至少一个参比血液样品而确定的水平(参见上文)。

特别是，所述确定包括在第一时间点确定血液样品中的包含在集中的至少三种miRNA(各自)的水平，并在稍后的时间点确定至少一个另外的血液样品中的包含在集中的至少三种miRNA(各自)的水平，并比较在不同时间点确定的所述水平。

优选地，

具有选自于由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：18所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平

(i)随时间增加，表明患者的阿尔茨海默氏病恶化；

(ii)不随时间变化，表明患者的阿尔茨海默氏病未恶化/稳定；或

(iii)随时间减少，表明患者的阿尔茨海默氏病有所改善；

和/或

具有选自于由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：17所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平

(i)随时间减少，表明患者的阿尔茨海默氏病恶化；

(ii)不随时间变化，表明患者的阿尔茨海默氏病未恶化/稳定；或

(iii)随时间增加，表明患者的阿尔茨海默氏病有所改善。

如上所述，检测到水平随时间减少/增加(取决于所检测的miRNA)表明患者的AD恶化。优选地，所述随时间减少/增加为至少0.4倍、至少0.5倍、至少0.6倍或至少0.7倍。更优选地，所述随时间减少/增加为至少0.8倍或至少0.9倍。甚至更优选地，所述随时间减少/增加为至少1.2倍或至少1.5倍。最优选地，所述随时间减少/增加为至少2.0倍或至少3.0倍。例如，可在1年(12个月)或2年(24个月)内确定所述减少/增加。

如上所述，不随时间变化的水平表明AD在患者中未恶化/稳定。在这方面，“不随时间变化”可意味着该水平随时间在0到<20％之间变化，例如，0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、19.9％、19.99％或19.999％。在这方面，“不随时间变化”也可意味着所检测的水平变化在测量精度之内。测量精度取决于所使用的测量方法。优选地，水平随时间恒定。

如上所述，检测到水平随时间增加/减少(取决于所检测的miRNA)表明患者的AD改善。优选地，所述随时间增加/减少为至少0.4倍、至少0.5倍、至少0.6倍或至少0.7倍。更优选地，所述随时间增加/减少为至少0.8倍或至少0.9倍。甚至更优选地，所述随时间增加/减少为至少1.2倍或至少1.5倍。最优选地，所述随时间增加/减少为至少2.0倍或至少3.0倍。例如，可在一年(12个月)或两年(24个月)内确定所述增加/减少。

在第一时间点和稍后的时间点之间的时间段优选地等于至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天(1周)、至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月(1年)、至少24个月(2年)、至少3年、至少4年、至少5年、至少6年、至少7年、至少8年、至少9年或至少10年。例如，可定期检查患者，例如，一年一次或一年两次。可在2、3、4、5、6、7、8、9或10个时间点(第一时间点和另外的时间点)对患者进行(再次)测试。

除了确定AD的病程外，还可监测该疾病的治疗。即，优选地，在确定AD病程的过程中，患者接受或已经接受了AD的治疗，特别是治疗性治疗。AD的治疗可选自于由给予药物、认知训练、运动疗法和心理疗法所组成的组。药物可选自于由抗痴呆剂、抗抑郁剂和精神安定药所组成的组。

患者可在完整的确定/监测过程中接受治疗(例如，给予药物)，或者可在第一时间点之前、之时或之后接受治疗(例如，给予药物)，并可在稍后的时间点进行再次测试。特别是，所述第一时间点可在治疗开始之前，而所述稍后的时间点可在治疗期间和/或治疗之后。如果治疗包括给予药物并且患者对所述治疗有反应，则可以继续给予药物，可以减少药物剂量，或者可以停止给予药物。如果治疗包括给予药物但患者对所述治疗无反应，则可以增加药物剂量，可以改变药物，或者可以改变疗法模式(例如，从给予药物改变为认知训练、运动疗法和/或心理疗法)。

如上所述，优选地，阿尔茨海默氏病的确定包括：诊断患者是否患有阿尔茨海默氏病，确定患者中是否存在阿尔茨海默氏病，确定患者中是否不存在阿尔茨海默氏病，确定患者是否处于阿尔茨海默氏病的风险中，和/或确定患者的阿尔茨海默氏病病程。因此，鉴于上述情况，优选将根据本发明的第一方面的方法指定为：

用于诊断/确定患者(怀疑受AD影响)是否患有AD的方法；

用于确定患者(怀疑受AD影响)中AD的存在的方法；

用于确定患者(怀疑受AD影响)中不存在AD的方法；

用于确定患者发展为AD的风险的方法；和/或

用于确定患者(具有/患有AD)的AD病程的方法。

在第二方面，本发明涉及用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的(体外)方法，所述方法包括以下步骤：

(i)确定分离自患者的血液样品中的至少3种miRNA(例如，至少3种、4种、5种、或6种miRNA或7种miRNA)(各自)的水平，其中，所述至少3种miRNA包含在集中，所述集选自于由以下所组成的组：

(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9；

(b)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4；

(c)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5；

(d)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6；

(e)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9；

(f)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：12；

(g)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQID NO：10；

(h)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8；

(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQID NO：13；

(j)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQID NO：11；

(k)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：11；

(l)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13；

(m)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(n)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(o)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12；

(p)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：12；

(q)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：14；

(r)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(s)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：15；

(t)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11；

(u)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQID NO：10；

(v)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：16；

(w)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17；

(x)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQID NO：17和SEQ ID NO：18；和

(y)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17；

以及

(ii)将包含在所述集中的至少三种miRNA(各自)的水平与所述至少三种miRNA的参比水平进行比较，其中，所述比较允许确定患者中的阿尔茨海默氏病。

应当注意，至少三种miRNA具有如根据(a)至(y)的集中所示的核苷酸序列。例如，根据(a)的集包含具有根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列的miRNA、具有根据SEQ ID NO：2的核苷酸序列的miRNA和具有根据SEQ ID NO：9的核苷酸序列的miRNA。

或者，上述集中所包含的根据SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：18的miRNA的核苷酸序列为与其具有至少90％、优选至少95％、更优选至少99％(即至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性的核苷酸序列。

确定miRNA水平的患者可为怀疑患有/具有AD的患者，或者为患有/具有AD的患者。在后一种情况下，可就AD对患者进行再次测试(例如，一段时间后)。

参比水平可为允许确定或不确定患者中的AD的任何水平。所述参比水平可获得自(对照)受试者(即不同于待测试/诊断的患者的受试者)或同一患者。在后一种情况下，可就AD再次测试患者，例如以纵向监测的形式。可确定患者当前受AD影响或仍未受AD影响。

优选地，参比水平为通过测量至少一个参比血液样品而确定的水平，所述至少一个参比血液样品来自

至少一名健康受试者，或

至少一名患有阿尔茨海默氏病的受试者。

优选地，参比水平为通过测量从至少一个健康(即未患有AD)的(对照)受试者(例如从至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个或1000个健康(即未患有AD)的(对照)受试者)分离的至少一个参比血液样品(例如至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个或1000个参比血液样品)而确定的水平。更优选地，参比水平为通过测量从2-500个健康(即未患有AD)的受试者分离的2-500个参比血液样品而确定的水平。甚至更优选地，参比水平通过测量从50-500个健康(即未患有AD)的受试者分离的50-500个参比血液样品来确定。最优选地，参比水平通过测量从100-500个健康(即未患有AD)的受试者分离的100-500个参比血液样品来确定。

每受试者中抽取一个参比血液样品进行分析是可行的。如果需要额外的参比血液样品(例如为了确定不同参比血液样品中的参比水平)，可对同一受试者进行(再次)测试。所述参比水平可为平均参比水平。所述平均参比水平可通过测量参比水平并计算其“平均”值(例如，平均值、中位值或众数值)来确定。优选地，参比血液样品与从患者分离的血液样品来自相同的来源(例如血细胞样品)。进一步优选地，参比水平获得自与待测试或诊断的患者相同性别(例如雌性/女性或者雄性/男性)和/或相似年龄/生命阶段(例如成年或老年)的受试者。

在一个实施方式中，阿尔茨海默氏病(AD)的确定包括诊断患者(怀疑具有AD)是否患有AD。在这种情况下，参比水平可为允许确定患者(怀疑具有AD)是否患有AD的任何水平。其可获得自(对照)受试者(即不同于待测试/诊断的患者的受试者)或同一患者。在后一种情况下，可就AD再次测试患者。特别是，参比水平为通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品而确定的水平(参见上文)。

优选地，

在另一实施方式中，阿尔茨海默氏病(AD)的确定包括确定患者(怀疑具有AD)中是否存在AD。在这种情况下，参比水平可为允许确定患者中是否存在AD的任何水平。其可获得自(对照)受试者(即不同于待测试患者的受试者)或同一患者。在后一种情况下，可就AD对患者进行再次测试。特别是，参比水平为通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品而确定的水平(参见上文)。

优选地，

在另一实施方式中，阿尔茨海默氏病(AD)的确定包括确定患者(怀疑具有AD)中是否不存在AD。在这种情况下，参比水平可为允许确定患者(怀疑具有AD)中是否不存在AD的任何水平。其可获得自(对照)受试者(即不同于待测试/诊断的患者的受试者)或同一患者。在后一种情况下，可就AD对患者进行再次测试。特别是，参比水平为通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品而确定的水平(参见上文)。

优选地，

具有选自于由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：18所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平低于参比水平(通过测量至少一个具有阿尔茨海默氏病的受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者中不存在阿尔茨海默氏病；和/或

具有选自于由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：17所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平高于参比水平(通过测量至少一个具有阿尔茨海默氏病的受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者中不存在阿尔茨海默氏病。

在这方面与参比水平“相当”的水平意味着该水平高于参比水平不超过15％，优选不超过10％，更优选不超过5％；或者该水平低于参比水平不超过15％，优选不超过10％，更优选不超过5％。

或者，在这方面与参比水平相当的水平意味着所检测的水平变化在测量精度之内。测量精度取决于所使用的测量方法。

特别地，miRNA的水平低于/高于参比水平至少0.4倍、至少0.5倍、至少0.6倍或至少0.7倍，优选至少0.8倍或至少0.9倍，更优选至少1.2倍或至少1.5倍，甚至更优选至少2.0倍或至少3.0倍。例如，miRNA的水平低于/高于参比水平至少0.4倍、至少0.5倍、至少0.6倍、至少0.7倍、至少0.8倍、至少0.9倍、至少1.0倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍或至少3.0倍。

在另一实施方式中，阿尔茨海默氏病(AD)的确定包括确定患者是否处于发展为AD的风险中。在这种情况下，参比水平可为允许确定患者是否处于发展为AD的风险中的任何水平。其可获得自(对照)受试者(即不同于待测试患者的受试者)或同一患者。在后一种情况下，可就AD对患者进行再次测试。特别是，参比水平为通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品而确定的水平(参见上文)。该确定可具有筛选方法的形式。所述筛选方法允许及早检测AD，并由此鉴别例如在不久的将来(例如在接下来的1、2、3、4或5年内)，具有发展为AD的倾向或可能性的患者(例如，基于其身体和/或生理状况)。

优选地，

特别是，所述确定包括：在第一时间点确定血液样品中的包含在集中的至少三种miRNA(各自)的水平，并在稍后的时间点确定至少一个另外的血液样品中的包含在集中的至少三种miRNA(各自)的水平，并比较在不同时间点确定的所述水平。

优选地，

具有选自于由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：18所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平

(i)随时间增加，表明患者的阿尔茨海默氏病恶化；

(ii)不随时间变化，表明患者的阿尔茨海默氏病未恶化/稳定；或

(iii)随时间减少，表明患者的阿尔茨海默氏病有所改善；

和/或

具有选自于由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：17所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平，

(i)随时间减少，表明患者的阿尔茨海默氏病恶化；

(ii)不随时间变化，表明患者的阿尔茨海默氏病未恶化/稳定；或

(iii)随时间增加，表明患者的阿尔茨海默氏病有所改善。

在第一时间点和稍后的时间点之间的时间段优选等于至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天(1周)、至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月(1年)、至少24个月(2年)、至少3年、至少4年、至少5年、至少6年、至少7年、至少8年、至少9年或至少10年。例如，可定期检查患者，例如，一年一次或一年两次。可在2、3、4、5、6、7、8、9或10个时间点(第一时间点和另外的时间点)对患者进行(再次)测试。

除了确定AD的病程外，还可监测该疾病的治疗。即，优选地，在确定AD病程的过程中，患者接受或已经接受了AD的治疗，特别是治疗性治疗。AD的治疗可选自于由给予药物、认知训练、运动疗法和心理疗法所组成的组。所述药物可选自于由抗痴呆剂、抗抑郁剂和精神安定药所组成的组。

患者可在完整的确定/监测过程中接受治疗(例如，给予药物)，或者可在第一时间点之前、之时或之后接受治疗(例如，给予药物)，并可在稍后的时间点进行再次测试。特别是，所述第一时间点可在治疗开始之前，而所述稍后的时间点可在治疗期间和/或治疗之后。如果治疗包括给予药物并且患者对所述治疗有反应，则可以继续给予药物，可以减少药物剂量，或者可以停止给予药物。如果治疗包括给予药物，但患者对所述治疗无反应，则可以增加药物剂量，可以改变药物，或者可以改变疗法模式(例如，从给予药物改变为认知训练、运动疗法和/或心理疗法)。

如上所述，优选地，阿尔茨海默氏病的确定包括：诊断患者是否患有阿尔茨海默氏病，确定患者中是否存在阿尔茨海默氏病，确定患者中是否不存在阿尔茨海默氏病，确定患者是否处于发展为阿尔茨海默氏病的风险中，和/或确定患者的阿尔茨海默氏病病程。因此，鉴于上述情况，优选将根据本发明的第二方面的方法指定为：

用于诊断/确定患者(怀疑受AD影响)是否患有AD的方法；

用于确定患者(怀疑受AD影响)中AD的存在的方法；

用于确定患者(怀疑受AD影响)中不存在AD的方法；

用于确定患者发展为AD的风险的方法；和/或

用于确定患者(具有/患有AD)的AD病程的方法。

在第三方面，本发明涉及至少三个多核苷酸(探针或引物，特别是引物对)用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的(体外)用途，所述至少三个多核苷酸用于检测分离自患者的血液样品中的包含在集中的至少3种miRNA(例如至少3种、4种、5种或6种miRNA或7种miRNA)，其中，第一miRNA具有根据SEQ ID NO：1(hsa-miR-363-3p)的核苷酸序列。

优选地，第二miRNA和第三miRNA具有选自于由SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：18所组成的组的核苷酸序列。

更优选地，第二miRNA具有根据SEQ ID NO：2(hsa-miR-28-3p)或SEQ ID NO：3(hsa-let-7e-5p)的核苷酸序列，并且其中在第二miRNA和第三miRNA不同的前提下，第三miRNA具有选自于由SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：18所组成的组的核苷酸序列。

甚至更优选地，第二miRNA具有根据SEQ ID NO：2的核苷酸序列，第三miRNA具有选自于由SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：15所组成的组的核苷酸序列。

甚至更优选地，第二miRNA具有根据SEQ ID NO：3的核苷酸序列，第三miRNA具有选自于由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：11、和SEQ ID NO：16-SEQ ID NO：18所组成的组的核苷酸序列。

特别优选地，第二miRNA具有根据SEQ ID NO：2(hsa-miR-28-3p)的核苷酸序列，第三miRNA具有根据SEQ ID NO：3(hsa-let-7e-5p)的核苷酸序列。

最优选地，至少三种miRNA包含在集中，所述集选自于由以下所组成的组：

(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9；

(b)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4；

(c)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5；

(d)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6；

(e)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9；

(f)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：12；

(g)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQID NO：10；

(h)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8；

(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQID NO：13；

(j)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQID NO：11；

(k)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：11；

(l)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13；

(m)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(n)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(o)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12；

(p)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：12；

(q)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：14；

(r)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(s)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：15；

(t)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11；

(u)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQID NO：10；

(v)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：16；

(w)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17；

(x)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQID NO：17和SEQ ID NO：18；以及

(y)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17。

检测miRNA的患者可为怀疑患有AD的患者或者患有AD的患者。

至少三个多核苷酸可为探针或引物，特别是引物对。

例如，三个多核苷酸探针用于检测分离自患者的血液样品中的包含在集中的三种miRNA，以确定患者中的阿尔茨海默氏病；或者三个引物对(多核苷酸对)用于检测分离自患者的血液样品中的包含在集中的三种miRNA，以确定患者中的阿尔茨海默氏病。

优选地，

(i)所述多核苷酸与上述(各)miRNA至少部分(反向)互补，优选(反向)互补；或者

(ii)所述多核苷酸与根据(i)的多核苷酸具有至少90％，优选至少95％，更优选至少99％(即至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性。

特别优选地，如(ii)中所定义的多核苷酸与根据(i)的多核苷酸在至少10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个核苷酸的连续延伸段(优选全长)上具有至少90％，优选至少95％，更优选至少99％(即至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性。

另外，在本发明的上下文中，如果如(ii)中定义的多核苷酸(即多核苷酸变体)在严格杂交条件下仍然能够通过一种或多种类型的化学键(通常通过互补碱基配对，通常通过氢键形成)结合、杂交或检测各自的靶核酸分子(即包含选自于由SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：18所组成的组的核苷酸序列的靶核酸分子)，则如(ii)中定义的多核苷酸(即多核苷酸变体)才被视为如(ii)中定义的多核苷酸(即多核苷酸变体)。技术人员可容易地评估如(ii)中定义的多核苷酸(即多核苷酸变体)是否仍然能够结合、杂交、识别或检测各自的靶核酸分子(即包含选自于由SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：18所组成的组的核苷酸序列的靶核酸分子)。确定在严格条件下是否仍然发生杂交的合适的分析是本领域众所周知的。然而，作为实例，确定杂交是否仍然发生的合适分析包括以下步骤：(a)将附着在生物芯片上的如(ii)中定义的多核苷酸与各自的靶核酸分子(即包含选自于由SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：18所组成的组的核苷酸序列的靶核酸分子)一起孵育；(b)洗涤生物芯片以除去非特异性结合；(c)使生物芯片经受检测系统；以及(d)分析多核苷酸是否仍能够与各自的靶核酸分子杂交。作为阳性对照，可使用如(i)中所定义的各自的非突变的多核苷酸。优选的严格杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，在42℃下孵育；或者，5×SSC、1％SDS，在65℃下孵育，在65℃下于0.2×SSC和0.1％SDS中洗涤；或者，6×SSPE、10％甲酰胺、0.01％吐温20、0.1×TE缓冲液、0.5mg/mL BSA、0.1mg/mL鲱鱼精子DNA，在42℃下孵育，在45℃下于05×SSPE和6×SSPE中洗涤。具有选自于由SEQ ID NO：19-SEQ ID NO：24所组成的组的核苷酸序列的miRNA的变体也是如此。

在一个优选的实施方式中，用于检测分离自患者的血液样品中的包含在集中的miRNA以确定患者中的阿尔茨海默氏病的的引物包括：

(i)miRNA特异性cDNA中用于miRNA(包含在从血液样品中分离出的总RNA级分中，优选包含在从全血或血细胞级分中分离的总RNA级分中)逆转录的miRNA特异性引物，例如具有根据SEQ ID NO：25-SEQ ID NO：35的核苷酸序列的茎环反向引物；和/或

(ii)引物集，所述集包含正向引物和通用反向引物，所述正向引物对由miRNA获得的cDNA具有特异性，所述通用反向引物用于通过实时聚合酶链式反应(RT-PCR)(例如实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR))扩增由miRNA获得的cDNA，例如，包含具有根据SEQ ID NO：36-SEQ ID NO：46的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物的引物集。

因此，

用于检测具有根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列的miRNA的引物优选包含具有根据SEQ ID NO：25的核苷酸序列的茎环反向引物，和/或具有根据SEQ ID NO：36的核苷酸序列的正向引物以及具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

用于检测具有根据SEQ ID NO：2的核苷酸序列的miRNA的引物优选包含具有根据SEQ ID NO：26的核苷酸序列的茎环反向引物，和/或具有根据SEQ ID NO：37的核苷酸序列的正向引物以及具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

用于检测具有根据SEQ ID NO：3的核苷酸序列的miRNA的引物优选包含具有根据SEQ ID NO：27的核苷酸序列的茎环反向引物，和/或具有根据SEQ ID NO：38的核苷酸序列的正向引物以及具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

用于检测具有根据SEQ ID NO：4的核苷酸序列的miRNA的引物优选包含具有根据SEQ ID NO：28的核苷酸序列的茎环反向引物，和/或具有根据SEQ ID NO：39的核苷酸序列的正向引物以及具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

用于检测具有根据SEQ ID NO：5的核苷酸序列的miRNA的引物优选包含具有根据SEQ ID NO：29的核苷酸序列的茎环反向引物，和/或具有根据SEQ ID NO：40的核苷酸序列的正向引物以及具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

用于检测具有根据SEQ ID NO：6的核苷酸序列的miRNA的引物优选包含具有根据SEQ ID NO：30的核苷酸序列的茎环反向引物，和/或具有根据SEQ ID NO：41的核苷酸序列的正向引物以及具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

用于检测具有根据SEQ ID NO：9的核苷酸序列的miRNA的引物优选包含具有根据SEQ ID NO：31的核苷酸序列的茎环反向引物，和/或具有根据SEQ ID NO：42的核苷酸序列的正向引物以及具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

用于检测具有根据SEQ ID NO：10的核苷酸序列的miRNA的引物优选包含具有根据SEQ ID NO：32的核苷酸序列的茎环反向引物，和/或具有根据SEQ ID NO：43的核苷酸序列的正向引物以及具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

用于检测具有根据SEQ ID NO：12的核苷酸序列的miRNA的引物优选包含具有根据SEQ ID NO：33的核苷酸序列的茎环反向引物，和/或具有根据SEQ ID NO：44的核苷酸序列的正向引物以及具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

用于检测具有根据SEQ ID NO：14的核苷酸序列的miRNA的引物优选包含具有根据SEQ ID NO：34的核苷酸序列的茎环反向引物，和/或具有根据SEQ ID NO：45的核苷酸序列的正向引物以及具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；和/或

用于检测具有根据SEQ ID NO：15的核苷酸序列的miRNA的引物优选包含具有根据SEQ ID NO：35的核苷酸序列的茎环反向引物，和/或具有根据SEQ ID NO：46的核苷酸序列的正向引物以及具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物。

在另一实施方式中，

a)用于检测具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9(Set-No.SA-1)的至少三种miRNA的引物包含具有根据SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31的核苷酸序列的茎环反向引物，以及具有根据SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：42的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

b)用于检测具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4(Set-No.SA-2)的至少三种miRNA的引物包含具有根据SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28的核苷酸序列的茎环反向引物，以及具有根据SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

c)用于检测具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5(Set-No.SA-3)的至少三种miRNA的引物包含具有根据SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29的核苷酸序列的茎环反向引物，以及具有根据SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：40的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

d)用于检测具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6(Set-No.SA-4)的至少三种miRNA的引物包含具有根据SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30的核苷酸序列的茎环反向引物，以及具有根据SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：41的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

e)用于检测具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：12(Set-No.SA-16)的至少三种miRNA的引物包含具有根据SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：33的核苷酸序列的茎环反向引物，以及具有根据SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

f)用于检测具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9(Set-No.SA-5)的至少三种miRNA的引物包含具有根据SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31的核苷酸序列的茎环反向引物，以及具有根据SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

g)用于检测具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：12(Set-No.SA-6)的至少三种miRNA的引物包含具有根据SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：33的核苷酸序列的茎环反向引物，以及具有根据SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

h)用于检测具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：12(Set-No.SA-13)的至少三种miRNA的引物包含具有根据SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33的核苷酸序列的茎环反向引物，以及具有根据SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；和/或

i)用于检测具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQID NO：12(Set-No.SA-15)的至少三种miRNA的引物包含具有根据SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33的核苷酸序列的茎环反向引物，以及具有根据SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物。

上述描述的多核苷酸(探针或引物，特别是引物对)可用于实施根据本发明的第一方面的方法。

特别优选地，阿尔茨海默氏病的确定包括：诊断患者是否患有阿尔茨海默氏病，确定患者中是否存在阿尔茨海默氏病，确定患者是否不存在阿尔茨海默氏病，确定患者是否处于发展为阿尔茨海默氏病的风险之中，和/或确定患者的阿尔茨海默氏病病程。因此，鉴于上述情况，优选将根据本发明第三方面的用途指定为以下用途：

用于诊断/确定患者(怀疑受AD影响)是否患有AD的用途；

用于确定患者(怀疑受AD影响)中AD的存在的用途；

用于确定患者(怀疑受AD影响)不存在AD的用途；

用于确定患者处于发展为AD的风险的用途；和/或

用于确定患者(具有/患有AD)的AD病程的用途。

在第四方面，本发明涉及至少三个多核苷酸(探针或引物，特别是引物对)用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的(体外)用途，所述至少三个多核苷酸用于检测分离自患者的血液样品中的至少三种miRNA(例如至少3种、4种、5种或6种miRNA或7种miRNA)，其中，所述至少三种miRNA包含在集中，所述集选自于由以下所组成的组：

(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9；

(b)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4；

(c)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5；

(d)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6；

(e)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9；

(f)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：12；

(g)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQID NO：10；

(h)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8；

(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQID NO：13；

(j)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQID NO：11；

(k)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：11；

(l)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13；

(m)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(n)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(o)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12；

(p)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：12；

(q)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：14；

(r)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(s)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：15；

(t)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11；

(u)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQID NO：10；

(v)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：16；

(w)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17；

(x)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQID NO：17和SEQ ID NO：18；以及

(y)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17。

应当注意，至少三种miRNA具有如根据(a)至(y)的集中所示的核苷酸序列。例如，根据(a)的集包含：具有根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列的miRNA，具有根据SEQ ID NO：2的核苷酸序列的miRNA和具有根据SEQ ID NO：9的核苷酸序列的miRNA。

检测miRNA的患者可为怀疑患有AD的患者或者患有AD的患者。

至少三个多核苷酸可为探针或引物，特别是引物对。

优选地，

(i)所述多核苷酸与上述(各)miRNA至少部分(反向)互补，优选(反向)互补；或者

特别优选地，(ii)中定义的多核苷酸与根据(i)的多核苷酸在至少10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个核苷酸的连续延伸段(优选全长)上具有至少90％，优选至少95％，更优选至少99％(即至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性。

关于多核苷酸变体，参照本发明的第三方面。

关于用于检测分离自患者的血液样品中的包含在集中的miRNA以确定患者中的阿尔茨海默氏病的特异性引物、特别是引物对(例如具有根据SEQ ID NO：25-SEQ ID NO：47的核苷酸序列的引物)，参照本发明的第三方面。

上述所述的多核苷酸(探针或引物，特别是引物对)可用于实施根据本发明的第二方面的方法。

特别优选地，阿尔茨海默氏病的确定包括：诊断患者是否患有阿尔茨海默氏病，确定患者中是否存在阿尔茨海默氏病，确定患者是否不存在阿尔茨海默氏病，确定患者是否处于发展为阿尔茨海默氏病的风险中，和/或确定患者的阿尔茨海默氏病病程。因此，鉴于上述情况，优选将根据本发明第四方面的用途指定为以下用途：

用于诊断/确定患者(怀疑受AD影响)是否患有AD的用途；

用于确定患者(怀疑受AD影响)中AD的存在的用途；

用于确定患者(怀疑受AD影响)不存在AD的用途；

用于确定患者处于发展为AD的风险的用途；和/或

用于确定患者(具有/患有AD)的AD病程的用途。

在第五方面，本发明涉及用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的试剂盒(的用途)，所述试剂盒包含：

(i)用于确定分离自患者的血液样品中的包含在集中的至少三种miRNA(例如至少3种、4种、5种或6种miRNA或7种miRNA)(各自)的水平的工具，其中，第一miRNA具有根据SEQID NO：1(hsa-miR-363-3p)的核苷酸序列或与其具有至少90％，优选至少95％，更优选至少99％(即至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性的核苷酸序列；以及

(ii)任选至少三个参比。

优选地，第二miRNA和第三miRNA具有选自于由SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：18所组成的组的核苷酸序列。或者，根据SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：18的miRNA的核苷酸序列为与其具有至少90％，优选至少95％，更优选至少99％(即至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性的核苷酸序列。

甚至更优选地，第二miRNA具有根据SEQ ID NO：2的核苷酸序列，第三miRNA具有选自于由SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：15所组成的组的核苷酸序列。

甚至更优选地，第二miRNA具有根据SEQ ID NO：3的核苷酸序列，第三miRNA具有选自于由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：11以及SEQ ID NO：16-SEQ ID NO：18所组成的组的核苷酸序列。

特别优选地，第二miRNA具有根据SEQ ID NO：2(hsa-miR-28-3p)的核苷酸序列，第三miRNA具有根据SEQ ID NO：3(hsa-let-7e-5p)的核苷酸序列。

最优选地，至少三种miRNA包含在集中，所述集选自于由以下所组成的组：

(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9；

(b)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4；

(c)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5；

(d)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6；

(e)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9；

(f)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：12；

(g)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQID NO：10；

(h)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8；

(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQID NO：13；

(j)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQID NO：11；

(k)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：11；

(l)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13；

(m)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(n)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(o)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12；

(p)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：12；

(q)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：14；

(r)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(s)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：15；

(t)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11；

(u)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQID NO：10；

(v)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：16；

(w)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17；

(x)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQID NO：17和SEQ ID NO：18；以及

(y)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17。

确定miRNA水平的患者可为怀疑患有AD的患者或者患有AD的患者。

特别地，试剂盒可用于实施根据本发明的第一方面的方法。

特别优选地，阿尔茨海默氏病的确定包括：诊断患者是否患有阿尔茨海默氏病，确定患者中是否存在阿尔茨海默氏病，确定患者是否不存在阿尔茨海默氏病，确定患者是否处于发展为阿尔茨海默氏病的风险中，和/或确定患者的阿尔茨海默氏病病程。因此，鉴于上述情况，优选将根据本发明的第五方面的试剂盒指定为

用于诊断/确定患者(怀疑受AD影响)是否患有AD的试剂盒；

用于确定患者(怀疑受AD影响)中AD的存在的试剂盒；

用于确定患者(怀疑受AD影响)不存在AD的试剂盒；

用于确定患者处于发展为AD的风险中的试剂盒；和/或

用于确定患者(具有/患有AD)的AD病程的试剂盒。

参比可为允许确定患者中AD的任何参比。特别是，参比可为允许以下的任何参比：诊断患者(怀疑具有AD)是否患有AD；确定患者(怀疑具有AD)中是否存在AD；确定患者中(怀疑具有AD)是否不存在AD；确定患者是否有发展为AD的倾向或将有可能(在(不久的)将来)发展为AD；和/或确定患者(具有AD)的AD病程。在这方面，在本发明的第一方面的上下文中提到的优选实施方式中也有所提及。

特别是，用于确定至少三种miRNA(各自)的水平的工具包括：

至少三个多核苷酸(多核苷酸探针)(对于每种待检测的miRNA而言，特异性的多核苷酸探针)，特别是根据本发明的第三方面所述；

至少三个引物对(对于每种待检测的miRNA而言，特异性的引物对)；和/或

至少三个多核苷酸(多核苷酸探针)(特别是根据本发明的第三方面所述)，以及至少三种能够结合所述多核苷酸(多核苷酸探针)和所述miRNA的杂交体的抗体(对于每种待检测miRNA而言，特异性的多核苷酸探针以及能够结合所述多核苷酸探针和所述miRNA的杂交体的抗体)。

在一个优选的实施方式中，用于确定分离自患者的血液样品中的包含在集中的(特定)miRNA水平的工具包括：

(i)miRNA特异性cDNA中用于miRNA(包含在从血液样品中分离的总RNA级分中，优选包含在从全血或血细胞级分中分离的总RNA级分中)逆转录的miRNA特异性引物，例如，具有根据SEQ ID NO：25-SEQ ID NO：35的核苷酸序列的茎环反向引物；和/或

因此，

另外地或可选地，试剂盒优选包含双标记探针，所述双标记探针具有选自于由SEQID NO：48-SEQ ID NO：58所组成的组的核苷酸序列。

在另一实施方式中，所述工具包括用于检测至少三种miRNA的水平的引物，其中，

a)用于检测具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9(Set-No.SA-1)的至少三种miRNA的水平的引物包含具有根据SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31的核苷酸序列的茎环反向引物，以及具有根据SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：42的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

b)用于检测具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4(Set-No.SA-2)的至少三种miRNA的水平的引物包含具有根据SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28的核苷酸序列的茎环反向引物，以及具有根据SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

c)用于检测具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5(Set-No.SA-3)的至少三种miRNA的水平的引物包含具有根据SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29的核苷酸序列的茎环反向引物，以及具有根据SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：40的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

d)用于检测具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6(Set-No.SA-4)的至少三种miRNA的水平的引物包含具有根据SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30的核苷酸序列的茎环反向引物，以及具有根据SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：41的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

e)用于检测具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：12(Set-No.SA-16)的至少三种miRNA的水平的引物包含具有根据SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：33的核苷酸序列的茎环反向引物，以及具有根据SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

f)用于检测具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9(Set-No.SA-5)的至少三种miRNA的水平的引物包含具有根据SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQID NO：30、SEQ ID NO：31的核苷酸序列的茎环反向引物，以及具有根据SEQ ID NO：36、SEQID NO：37、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

g)用于检测具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：12(Set-No.SA-6)的至少三种miRNA的水平的引物包含具有根据SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQID NO：29、SEQ ID NO：33的核苷酸序列的茎环反向引物，以及具有根据SEQ ID NO：36、SEQID NO：37、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；

h)用于检测具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：12(Set-No.SA-13)的至少三种miRNA的水平的引物包含具有根据SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33的核苷酸序列的茎环反向引物，以及具有根据SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物；和/或

i)用于检测具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQID NO：12(Set-No.SA-15)的至少三种miRNA的水平的引物包含具有根据SEQ ID NO：25、SEQID NO：26、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33的核苷酸序列的茎环反向引物，以及具有根据SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的通用反向引物。

所述工具允许确定分离自患者的血液样品中的至少三种miRNA(各自)的水平，从而确定患者中的AD。

特别是，

可确定患者(怀疑具有AD)是否患有AD；

可确定患者(怀疑具有AD)中是否存在AD；

可确定患者是否处于发展为AD的风险中；

可确定患者(怀疑具有AD)中是否不存在AD；和/或

可确定患者(具有AD)的AD病程。

至少三个多核苷酸(多核苷酸探针)可为微阵列/生物芯片的部分，或者可附着于基于珠的多重系统的珠。

至少三个多核苷酸(引物，特别是引物对)可为RT-PCR系统、PCR系统或下一代测序系统的部分。

所述工具可进一步包括微阵列、RT-PCT系统、PCR系统、流式细胞仪、Luminex系统和/或下一代测序系统。

试剂盒还可包含

(iii)容器，和/或

(iv)数据载体。

数据载体可为：非电子数据载体，例如图形数据载体，如信息单、信息表、条形码或存取代码；或者电子数据载体，例如软盘、光盘(CD)、数字通用盘(DVD)、微芯片或其它基于半导体的电子数据载体。存取代码可允许访问数据库，例如互联网数据库、集中式数据库或分散式数据库。存取代码还可允许访问应用软件或移动app，所述应用软件使计算机为计算机用户执行任务，所述移动app是设计为在智能手机和其它移动设备上运行的软件。

所述数据载体可进一步包括至少三个参比，例如，在本文中确定其水平的至少三种miRNA(各自)的参比水平。在数据载体包含允许访问数据库的存取代码的情况下，可将所述至少三个参比存储在该数据库中。

数据载体还可包含关于如何执行根据本发明的第一方面的方法的信息或指令。

所述试剂盒还可包含从商业和用户角度出发期望的材料，包括用于确定上述水平的缓冲液、试剂和/或稀释剂。

在第六方面，本发明涉及用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的试剂盒，所述试剂盒包含：

(i)确定分离自患者的血液样品中的至少三种miRNA(例如至少3种、4种、5种或6种miRNA或7种miRNA)(各自)的水平的工具，其中，至少三种miRNA包含在集中，所述集选自于由以下所组成的组：

(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9；

(b)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4；

(c)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5；

(d)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6；

(e)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9；

(f)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：12；

(g)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQID NO：10；

(h)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8；

(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQID NO：13；

(j)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQID NO：11；

(k)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：11；

(l)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13；

(m)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(n)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(o)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12；

(p)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：12；

(q)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：14；

(r)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12；

(s)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：15；

(t)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11；

(u)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQID NO：10；

(v)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：16；

(w)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17；

(x)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQID NO：17和SEQ ID NO：18；和

(y)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17，

以及

(ii)任选至少三个参比。

应当注意，至少三种miRNA具有如根据(a)至(y)的集中所示的核苷酸序列。例如，根据(a)的集包含：具有根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列的miRNA、具有根据SEQ ID NO：2的核苷酸序列的miRNA和具有根据SEQ ID NO：9的核苷酸序列的miRNA。

确定miRNA水平的患者可为怀疑患有AD的患者或者患有AD的患者。

特别是，试剂盒可用于实施根据本发明的第二方面的方法。

特别优选地，阿尔茨海默氏病的确定包括：诊断患者是否患有阿尔茨海默氏病，确定患者中是否存在阿尔茨海默氏病，确定患者是否不存在阿尔茨海默氏病，确定患者是否处于发展为阿尔茨海默氏病的风险，和/或确定患者的阿尔茨海默氏病病程。因此，鉴于上述情况，优选将根据本发明的第六方面的试剂盒指定为

用于诊断/确定患者(怀疑受AD影响)是否患有AD的试剂盒；

用于确定患者(怀疑受AD影响)中AD的存在的试剂盒；

用于确定患者(怀疑受AD影响)中不存在AD的试剂盒；

用于确定患者处于发展为AD的风险中的试剂盒；和/或

用于确定患者(具有/患有AD)的AD病程的试剂盒。

所述参比可为允许确定患者中AD的任何参比。特别是，参比可为允许以下的任何参比：诊断患者(怀疑具有AD)是否患有AD；确定患者(怀疑具有AD)中是否存在AD；确定患者中(怀疑具有AD)是否不存在AD；确定患者是否有发展为AD的倾向或将有可能(在(不久的)将来)发展为AD；和/或确定患者(具有AD)的AD病程。在这方面，参照本发明的第二方面的上下文中提到的优选实施方式。

特别是，用于确定至少三种miRNA(各自)的水平的工具包含：

至少三个多核苷酸(多核苷酸探针)(对于每种待检测的miRNA而言，特异性的多核苷酸探针)，特别是根据本发明的第四方面所述；

至少三个引物对(对于每种待检测的miRNA而言，特异性的引物对)；和/或

至少三个多核苷酸(多核苷酸探针)(特别是根据本发明的第四方面所述)以及至少三种能够结合所述多核苷酸(多核苷酸探针)和所述miRNA的杂交体的抗体(对于每种待检测miRNA而言，特异性多核苷酸探针和能够结合所述多核苷酸探针和所述miRNA的杂交体的抗体)。

关于用于检测分离自患者的血液样品中的包含在集中的miRNA的水平以确定患者中的阿尔茨海默氏病的特异性引物、特别是引物对(例如，具有根据SEQ ID NO：25-SEQ IDNO：47的核苷酸序列的引物)，参照本发明的第五方面。对于具有根据SEQ ID NO：48-SEQ IDNO：58的核苷酸序列的双标记探针，也参照本发明的第五方面。

所述工具允许确定分离自患者的血液样品中的至少三种miRNA(各自)的水平，从而确定患者中的AD。

特别是，

可确定患者(怀疑具有AD)是否患有AD；

可确定患者(怀疑具有AD)中是否存在AD；

可确定患者(怀疑具有AD)中是否不存在AD；

可确定患者是否处于发展为AD的风险；和/或

可确定患者(具有AD)的AD病程。

至少三个多核苷酸(多核苷酸探针)可为微阵列/生物芯片的部分，或者可附着于基于珠的多重系统的珠。

至少三个多核苷酸(引物，特别是引物对)可为RT-PCR系统、PCR系统或下一代测序系统的部分。

所述工具可进一步包括微阵列、RT-PCT系统、PCR系统、流式细胞仪、Luminex系统和/或下一代测序系统。

所述试剂盒还可包含

(iii)容器，和/或

(iv)数据载体。

数据载体还可包含关于如何执行根据本发明的第二方面的方法的信息或指令。

所述试剂盒还可包含从商业和用户角度出发期望的材料，包括用于确定上述水平的缓冲液、试剂和/或稀释剂。

在第七方面，本发明涉及用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的(体外)方法，所述方法包括以下步骤：

(i)确定分离自患者的血液样品中的包含在集中的至少三种miRNA(例如至少3种、4种或5种miRNA或6种miRNA)(各自)的水平，其中，第一miRNA具有根据SEQ ID NO：8(hsa-miR-3909)的核苷酸序列或与其具有至少90％，优选至少95％，更优选至少99％(即至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性的核苷酸序列；以及

(ii)将包含在所述集中的至少三种miRNA(各自)的水平与所述至少三种miRNA的参比水平进行比较，其中，所述比较允许确定患者中的阿尔茨海默氏病。

优选地，第二miRNA和第三miRNA具有选自于由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所组成的组的核苷酸序列。或者，根据SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的miRNA的核苷酸序列与其具有至少90％，优选至少95％，更优选至少99％(即至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性的核苷酸序列。

更优选地，至少三种miRNA包含在集中，所述集选自于由以下所组成的组：

(a)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQID NO：18；

(b)SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；

(c)SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19；以及

(d)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8。

应当注意，至少三种miRNA具有如根据(a)至(d)的集中所示的核苷酸序列。例如，根据(d)的集包含：具有根据SEQ ID NO：3的核苷酸序列的miRNA、具有根据SEQ ID NO：6的核苷酸序列的miRNA、以及具有根据SEQ ID NO：8的核苷酸序列的miRNA。

确定miRNA水平的患者可为怀疑患有/具有AD的患者，或者为患有/具有AD的患者。在后一种情况下，可就AD对患者进行再次测试(例如，一段时间后)。

参比水平可为允许确定或不确定患者中的AD的任何水平。所述参比水平可获得自(对照)受试者(即不同于待测试/诊断的患者的受试者)或同一患者。在后一种情况下，可就AD对患者进行再次测试，例如以纵向监测的形式。可确定患者当前已受AD影响或仍未受AD影响。

优选地，参比水平为通过测量至少一个参比血液样品而确定的水平，所述至少一个参比血液样品来自

至少一名健康受试者，或

至少一名具有阿尔茨海默氏病的受试者。

在一个实施方式中，阿尔茨海默氏病(AD)的确定包括诊断患者(怀疑具有AD)是否患有AD。在这种情况下，参比水平可为允许确定患者(怀疑具有AD)是否患有AD的任何水平。参比水平可获得自(对照)受试者(即不同于待测试/诊断的患者的受试者)或同一患者。在后一种情况下，可就AD对患者进行再次测试。特别是，参比水平为通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品而确定的水平(参见上文)。

优选地，

具有选自于由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：18-SEQ ID NO：20所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平高于参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者患有阿尔茨海默氏病；和/或

具有选自于由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平低于参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者患有阿尔茨海默氏病。

在另一实施方式中，阿尔茨海默氏病(AD)的确定包括确定患者(怀疑具有AD)中是否存在AD。在这种情况下，参比水平可为允许确定患者(怀疑具有AD)中是否存在AD的任何水平。参比水平可获得自(对照)受试者(即不同于待测试患者的受试者)或同一患者。在后一种情况下，可就AD对患者进行再次测试。特别是，参比水平为通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品而确定的水平(参见上文)。

优选地，

具有选自于由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：18-SEQ ID NO：20所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平高于参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者中存在阿尔茨海默氏病；和/或

具有选自于由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平低于参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者中存在阿尔茨海默氏病。

在另一实施方式中，阿尔茨海默氏病(AD)的确定包括确定患者(怀疑具有AD)中是否不存在AD。在这种情况下，参比水平可为允许确定患者(怀疑具有AD)中是否不存在AD的任何水平。参比水平可获得自(对照)受试者(即不同于待测试患者的受试者)或同一患者。在后一种情况下，可就AD对患者进行再次测试。特别是，参比水平为通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品而确定的水平(参见上文)。

优选地，

具有选自于由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：18-SEQ ID NO：20所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平与参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品而确定)相当，表明患者中不存在阿尔茨海默氏病；

具有选自于由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQID NO：10和SEQ IDNO：11所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平与参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品而确定)相当，表明患者中不存在阿尔茨海默氏病；

具有选自于由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：18-SEQ ID NO：20所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平低于参比水平(通过测量至少一名具有阿尔茨海默氏病的受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者中不存在阿尔茨海默氏病；和/或

具有选自于由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平高于参比水平(通过测量至少一名具有阿尔茨海默氏病的受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者中不存在阿尔茨海默氏病。

在这方面，与参比水平“相当”的水平意味着：该水平高于参比水平不超过15％，优选不超过10％，更优选不超过5％；或者该水平低于参比水平不超过15％，优选不超过10％，更优选不超过5％。

或者，在这方面，与参比水平相当的水平意味着所检测的水平变化在测量精度之内。测量精度取决于所使用的测量方法。

在另一实施方式中，阿尔茨海默氏病(AD)的确定包括确定患者是否处于发展为AD的风险中。在这种情况下，参比水平可为允许确定患者是否处于发展为AD的风险中的任何水平。参比水平可获得自(对照)受试者(即不同于待测试患者的受试者)或同一患者。在后一种情况下，可就AD对患者进行再次测试。特别是，参比水平为通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品而确定的水平(参见上文)。该确定可具有筛选方法的形式。所述筛选方法允许及早检测AD，并由此鉴别例如在不久的将来(例如在接下来的1、2、3、4或5年内)，具有发展为AD的倾向或可能性的患者(例如，基于其身体和/或生理状况)。

优选地，

具有选自于由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：18-SEQ ID NO：20所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平高于参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者处于发展为阿尔茨海默氏病的风险中；和/或

具有选自于由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平低于参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者处于发展为阿尔茨海默氏病的风险中。

在另一实施方式中，阿尔茨海默氏病(AD)的确定包括确定患者(具有AD)中AD的病程。在这种情况下，参比水平可为允许确定患者(具有AD)的AD病程的任何水平。参比水平可获得自(对照)受试者(即不同于待测试/诊断的患者的受试者)或同一患者。在后一种情况下，可再次测试患者的AD。可确定患者中AD是否恶化，患者中AD是否未恶化/是否稳定，或者患者中AD是否改善。特别是，参比水平为通过测量来自至少一名具有AD的受试者的至少一个参比血液样品而确定的水平(参见上文)。

优选地，

具有选自于由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：18-SEQ ID NO：20所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平

(i)随时间增加，表明患者的阿尔茨海默氏病恶化；

(ii)不随时间变化，表明患者的阿尔茨海默氏病未恶化/稳定；或

(iii)随时间减少，表明患者的阿尔茨海默氏病有所改善；

和/或

具有选自于由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平

(i)随时间减少，表明患者的阿尔茨海默氏病恶化；

(ii)不随时间变化，表明患者的阿尔茨海默氏病未恶化/稳定；或

(iii)随时间增加，表明患者的阿尔茨海默氏病有所改善。

如上所述，检测到水平随时间减少/增加(取决于所检测的miRNA)表明患者中的AD恶化。优选地，所述随时间减少/增加为至少0.4倍、至少0.5倍、至少0.6倍或至少0.7倍。更优选地，所述随时间减少/增加为至少0.8倍或至少0.9倍。甚至更优选地，所述随时间减少/增加为至少1.2倍或至少1.5倍。最优选地，所述随时间减少/增加为至少2.0倍或至少3.0倍。例如，可在1年(12个月)或2年(24个月)内确定所述减少/增加。

如上所述，检测到水平随时间减少/增加(取决于所检测的miRNA)表明患者中的AD改善。优选地，所述随时间减少/增加为至少0.4倍、至少0.5倍、至少0.6倍或至少0.7倍。更优选地，所述随时间减少/增加为至少0.8倍或至少0.9倍。甚至更优选地，所述随时间减少/增加为至少1.2倍或至少1.5倍。最优选地，所述随时间减少/增加为至少2.0倍或至少3.0倍。例如，可在1年(12个月)或2年(24个月)内确定所述减少/增加。

患者可在完整的确定/监测过程中接受治疗(例如，给予药物)，或者可在第一时间点之前、之时或之后接受治疗(例如，给予药物)，并可在稍后的时间点进行再次测试。特别是，所述第一时间点可在治疗开始之前，而所述稍后时间点可在治疗期间和/或治疗之后。如果治疗包括给予药物并且患者对所述治疗有反应，则可以继续给予药物，可以减少药物剂量，或者可以停止给予药物。如果治疗包括给予药物，但患者对所述治疗无反应，则可以增加药物剂量，可以改变药物，或者可以改变疗法模式(例如，从给予药物改变为认知训练、运动疗法和/或心理疗法)。

如上所述，优选地，阿尔茨海默氏病的确定包括：诊断患者是否患有阿尔茨海默氏病；确定患者中是否存在阿尔茨海默氏病；确定患者中是否不存在阿尔茨海默氏病；确定患者是否处于发展为阿尔茨海默氏病的风险中；和/或确定患者的阿尔茨海默氏病病程。因此，鉴于上述情况，优选将根据本发明的第二方面的方法指定为如下方法：

用于诊断/确定患者(怀疑受AD影响)是否患有AD的方法；

用于确定患者(怀疑受AD影响)中AD的存在的方法；

用于确定患者(怀疑受AD影响)中不存在AD的方法；

用于确定患者处于发展为AD的风险中的方法；和/或

用于确定患者(具有/患有AD)的AD病程的方法。

在第八方面，本发明涉及用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的(体外)方法，该方法包括以下步骤：

(i)确定分离自患者的血液样品中的至少三种miRNA(例如至少3种、4种、或5种miRNA或6种miRNA)(各自)的水平，其中，至少三种miRNA包含在集中，所述集选自于由以下所组成的组：

(a)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQID NO：18；

(b)SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；

(c)SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19；和

(d)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8；

以及

(ii)将包含在所述集中的至少三种miRNA(各自)的水平与所述至少三种miRNA的参比水平进行比较，其中，所述比较允许确定患者中的阿尔茨海默氏病。

确定miRNA水平的患者可为怀疑患有/具有AD的患者，或者为患有/具有AD的患者。在后一种情况下，可对患者进行AD再次测试，(例如，一段时间后)。

参比水平可为允许确定或不确定患者中的AD的任何水平。参比水平可获得自(对照)受试者(即不同于待测试/诊断的患者的受试者)或同一患者。在后一种情况下，可对患者进行AD再次测试，例如以纵向监测的形式。可确定患者当前已受AD影响或仍未受AD影响。

优选地，参比水平为通过测量至少一个参比血液样品而确定的水平，所述至少一个参比血液样品来自

至少一名健康受试者；或

至少一名具有阿尔茨海默氏病的受试者。

优选地，阿尔茨海默氏病的确定包括：诊断患者是否患有阿尔茨海默氏病；确定患者中是否存在阿尔茨海默氏病；确定患者中是否不存在阿尔茨海默氏病；确定患者是否处于发展为阿尔茨海默氏病的风险中；和/或确定患者的阿尔茨海默氏病病程。因此，鉴于上述情况，优选将根据本发明的第八方面的方法指定为以下方法：

用于诊断/确定患者(怀疑受AD影响)是否患有AD的方法；

用于确定患者(怀疑受AD影响)中AD的存在的方法；

用于确定患者(怀疑受AD影响)中不存在AD的方法；

用于确定患者处于发展为AD的风险中的方法；和/或

用于确定患者(具有/患有AD)的AD病程的方法。

关于诊断患者是否患有阿尔茨海默氏病、确定患者中是否存在阿尔茨海默氏病、确定患者中是否不存在阿尔茨海默氏病和/或确定患者中阿尔茨海默氏病的病程的优选实施方式，参照本发明的第七方面。

在第九方面，本发明涉及至少三个多核苷酸(探针或引物，特别是引物对)用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的(体外)用途，所述至少三个多核苷酸用于检测分离自患者的血液样品中的包含在集中的至少三种miRNA(例如至少3种、4种、或5种miRNA或6种miRNA)，其中，第一miRNA具有根据SEQ ID NO：8(hsa-miR-3909)的核苷酸序列。

优选地，第二miRNA和第三miRNA具有选自于由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所组成的组的核苷酸序列。或者，根据SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的miRNA的核苷酸序列为与其具有至少90％，优选至少95％，更优选至少99％(即至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性的核苷酸序列。

更优选地，至少三种miRNA包含在集中，所述集选自于由以下所组成的组：

(a)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQID NO：18；

(b)SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；

(c)SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19；以及

(d)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8。

检测miRNA的患者可为怀疑患有AD的患者或者患有AD的患者。

至少三个多核苷酸可为探针或引物，特别是引物对。

优选地，

(i)所述多核苷酸与上述(各)miRNA至少部分(反向)互补，优选(反向)互补；或者

特别优选地，如(ii)中定义的多核苷酸与根据(i)的多核苷酸在至少10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个核苷酸的连续延伸段(优选全长)上具有至少90％，优选至少95％，更优选至少99％(即至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性。

关于多核苷酸变体，参照本发明的第三方面。

上述多核苷酸(探针或引物，特别是引物对)可用于实施根据本发明的第七方面的方法。

特别优选地，阿尔茨海默氏病的确定包括：诊断患者是否患有阿尔茨海默氏病；确定患者中是否存在阿尔茨海默氏病；确定患者是否不存在阿尔茨海默氏病；确定患者是否处于发展为阿尔茨海默氏病的风险中；和/或确定患者的阿尔茨海默氏病病程。

在第十方面，本发明涉及至少三个多核苷酸(探针或引物，特别是引物对)用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的(体外)用途，所述至少三个多核苷酸用于检测分离自患者的血液样品中的至少三种miRNA(例如至少3种、4种或5种miRNA或6种miRNA)，其中，至少三种miRNA包含在集中，所述集选自于由以下所组成的组：

(a)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQID NO：18；

(b)SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；

(c)SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19；以及

(d)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8。

检测miRNA的患者可为怀疑患有AD的患者或者患有AD的患者。

至少三个多核苷酸可为探针或引物，特别是引物对。

优选地，

(i)所述多核苷酸与上述(各)miRNA至少部分(反向)互补，优选(反向)互补；或者

关于多核苷酸变体，参照本发明的第三方面。

上述多核苷酸(探针或引物，特别是引物对)可用于实施根据本发明的第八方面的方法。

在第十一方面，本发明涉及用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的试剂盒(的用途)，所述试剂盒包含：

(i)确定分离自患者的血液样品中的包含在集中的至少三种miRNA(例如至少3种、4种、或5种miRNA或6种miRNA)(各自)的水平的工具，其中，第一miRNA具有根据SEQ ID NO：8(hsa-miR-3909)的核苷酸序列或与其具有至少90％、优选至少95％、更优选至少99％(即至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性的核苷酸序列；以及

(ii)任选至少三个参比。

优选地，第二miRNA和第三miRNA具有选自于由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所组成的组的核苷酸序列。或者，根据SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的miRNA的核苷酸序列为与其具有至少90％，优选至少95％，更优选至少99％(即至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性的核苷酸序列。

更优选地，至少三种miRNA包含在集中，所述集选自于由以下所组成的组：

(a)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQID NO：18；

(b)SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；

(c)SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19；以及

(d)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8。

确定miRNA水平的患者可为怀疑患有AD的患者或者患有AD的患者。

特别是，该试剂盒可用于实施根据本发明的第七方面的方法。

所述参比可为允许确定患者中AD的任何参比。特别地，参比可为允许以下的任何参比：诊断患者(怀疑具有AD)是否患有AD；确定患者(怀疑具有AD)中是否存在AD；确定患者中(怀疑具有AD)是否不存在AD；确定患者是否有发展为AD的倾向或将有可能(在(不久的)将来)发展为AD；和/或确定患者(具有AD)的AD病程。在这方面，还参照在本发明的第七方面的上下文中提到的优选实施方式。

特别地，用于确定至少三种miRNA(各自)的水平的工具包括：

至少三个多核苷酸(多核苷酸探针)(对于每种待检测的miRNA而言，特异性的多核苷酸探针)，特别是根据本发明的第九方面所述；

至少三个引物对(对于每种待检测的miRNA而言，特异性的引物对)；和/或

至少三个多核苷酸(多核苷酸探针)(特别是根据本发明的第九方面所述)以及至少三种能够结合所述多核苷酸(多核苷酸探针)和所述miRNA的杂交体的抗体(对于每种待检测miRNA而言，特异性的多核苷酸探针和能够结合所述多核苷酸探针和所述miRNA的杂交体的抗体)。

所述工具允许确定分离自患者的血液样品中的至少三种miRNA(各自)的水平，从而确定患者中的AD。

特别是，

可确定患者(怀疑具有AD)是否患有AD；

可确定患者(怀疑具有AD)中是否存在AD；

可确定患者(怀疑具有AD)中是否不存在AD；

可确定患者是否处于发展为AD的风险中；和/或

可确定患者(具有AD)的AD病程。

至少三个多核苷酸(多核苷酸探针)可为微阵列/生物芯片的部分，或者可附着于基于珠的多重系统的珠。

至少三个多核苷酸(引物，特别是引物对)可为RT-PCR系统、PCR系统或下一代测序系统的部分。

所述工具可进一步包括微阵列、RT-PCT系统、PCR系统、流式细胞仪、Luminex系统和/或下一代测序系统。

试剂盒还可包含

(iii)容器，和/或

(iv)数据载体。

所述数据载体可进一步包含至少三个参比，例如，在本文中确定其水平的至少三种miRNA(各自)的参比水平。在数据载体包含允许访问数据库的存取代码的情况下，可将所述至少三个参比存储在该数据库中。

数据载体还可包含关于如何执行根据本发明的第七方面的方法的信息或指令。

所述试剂盒还可包含从商业和用户角度出发期望的材料，包括用于确定上述水平的缓冲液、试剂和/或稀释剂。

在第十二方面，本发明涉及用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的试剂盒(的用途)，所述试剂盒包含：

(i)确定分离自患者的血液样品中的至少三种miRNA(例如至少3种、4种或5种miRNA或6种miRNA)(各自)的水平的工具，其中，所述至少三种miRNA包含在集中，所述集选自于由以下所组成的组：

(a)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQID NO：18；

(b)SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；

(c)SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19；和

(d)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8；

以及

(ii)任选至少三个参比。

确定miRNA水平的患者可为怀疑患有AD的患者或者患有AD的患者。

特别是，该试剂盒可用于实施根据本发明的第八方面的方法。

特别是，用于确定至少三种miRNA(各自)的水平的工具包括：

至少三个多核苷酸(多核苷酸探针)(对于每种待检测的miRNA而言，特异性的多核苷酸探针)，特别是根据本发明的第十方面所述；

至少三个引物对(对于每种待检测的miRNA而言，特异性的引物对)；和/或

至少三个多核苷酸(多核苷酸探针)(特别是根据本发明的第十方面所述)以及至少三种能够结合所述多核苷酸(多核苷酸探针)和所述miRNA的杂交体的抗体(对于每种待检测miRNA而言，特异性的多核苷酸探针和能够结合所述多核苷酸探针和所述miRNA的杂交体的抗体)。

所述工具允许确定分离自患者的血液样品中的至少三种miRNA(各自)的水平，从而确定患者中的AD。

特别是，

可确定患者(怀疑具有AD)是否患有AD；

可确定患者(怀疑具有AD)中是否存在AD；

可确定患者(怀疑具有AD)中是否不存在AD；

可确定患者是否处于发展为AD的风险中；和/或

可确定患者(具有AD)的AD病程。

至少三个多核苷酸(多核苷酸探针)可为微阵列/生物芯片的部分，或者可附着于基于珠的多重系统的珠。

至少三个多核苷酸(引物，特别是引物对)可为RT-PCR系统、PCR系统或下一代测序系统的部分。

所述工具可进一步包括微阵列、RT-PCT系统、PCR系统、流式细胞仪、Luminex系统和/或下一代测序系统。

所述试剂盒还可包含

(iii)容器，和/或

(iv)数据载体。

数据载体可包含关于如何执行根据本发明的第八方面的方法的信息或指令。

在第十三个方面，本发明涉及用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的(体外)方法，所述方法包括以下步骤：

(i)确定分离自患者的血液样品中的至少3种miRNA(例如，至少3种、4种、5种miRNA或6种miRNA)(各自)的水平，其中，所述至少3种miRNA包含在集中，所述集选自于由以下所组成的的组：

(a)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：10；和

(b)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24；

以及

(ii)将包含在所述集中的至少三种miRNA(各自)的水平与所述至少三种miRNA的参比水平进行比较，其中，所述比较允许确定患者中的阿尔茨海默氏病。

应当注意，至少三种miRNA具有如根据(a)和(b)的集中所示的核苷酸序列。

或者，根据SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的miRNA的核苷酸序列为与其具有至少90％，优选至少95％，更优选至少99％(即至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性的核苷酸序列。

确定miRNA水平的患者可为怀疑患有/具有AD的患者或者患有/具有AD的患者。在后一种情况下，可就AD对患者进行再次测试(例如，一段时间后)。

优选地，参比水平为通过测量至少一个参比血液样品而确定的水平，所述至少一个参比血液样品来自

至少一名健康受试者，或

至少一名具有阿尔茨海默氏病的受试者。

在一个实施方式中，阿尔茨海默氏病(AD)的确定包括诊断患者(怀疑具有AD)是否患有AD。

优选地，

具有选自于由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：22所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平高于参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者患有阿尔茨海默氏病；和/或

具有选自于由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：23和SEQ ID NO：24所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平低于参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者患有阿尔茨海默氏病。

在另一实施方式中，阿尔茨海默氏病(AD)的确定包括确定患者(怀疑具有AD)中是否存在AD。

优选地，

具有选自于由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：22所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平高于参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者中存在阿尔茨海默氏病；和/或

具有选自于由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：23和SEQ ID NO：24所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平低于参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者中存在阿尔茨海默氏病。

在另一实施方式中，阿尔茨海默氏病(AD)的确定包括确定患者(怀疑具有AD)中是否不存在AD。

优选地，

具有选自于由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：22所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平与参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)相当，表明患者中不存在阿尔茨海默氏病；

具有选自于由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：23和SEQ ID NO：24所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平与参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)相当，表明患者中不存在阿尔茨海默氏病；

具有选自于由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：22所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平低于参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者中不存在阿尔茨海默氏病；和/或

具有选自于由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：23和SEQ ID NO：24所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平高于参比水平(通过测量来自至少一名具有阿尔茨海默氏病的受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者中不存在阿尔茨海默氏病。

在另一实施方式中，阿尔茨海默氏病(AD)的确定包括确定患者是否处于发展为AD的风险中。

优选地，

具有选自于由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：22所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平高于参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者处于发展为阿尔茨海默氏病的风险中；和/或

具有选自于由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：23和SEQ ID NO：24所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平低于参比水平(通过测量来自至少一名健康受试者的至少一个参比血液样品来确定)，表明患者处于发展为阿尔茨海默氏病的风险中。

上面(例如，在本发明的第一方面的上下文中)描述了术语“与…相当(comparablewith)”的含义。

在另一实施方式中，阿尔茨海默氏病(AD)的确定包括确定患者(具有AD)中AD的病程。

优选地，

具有选自于由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：22所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平：

(i)随时间增加，表明患者的阿尔茨海默氏病恶化；

(ii)不随时间变化，表明患者的阿尔茨海默氏病未恶化/稳定；或

(iii)随时间减少，表明患者的阿尔茨海默氏病有所改善；

和/或

具有选自于由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：23和SEQ ID NO：24所组成的组的核苷酸序列的miRNA的水平：

(i)随时间减少，表明患者的阿尔茨海默氏病恶化；

(ii)不随时间变化，表明患者的阿尔茨海默氏病未恶化/稳定；或

(iii)随时间增加，表明患者的阿尔茨海默氏病有所改善。

上面(例如，在本发明的第一方面的上下文中)描述了术语“不随时间变化”的含义。

如上所述，检测到水平随时间增加/减少(取决于所检测的miRNA)表明患者的AD改善。优选地，所述随时间增加/减少为至少0.4倍、至少0.5倍、至少0.6倍或至少0.7倍。更优选地，所述随时间增加/减少为至少0.8倍或至少0.9倍。甚至更优选地，所述随时间增加/减少为至少是1.2倍或至少1.5倍。最优选地，所述随时间增加/减少为至少2.0倍或至少3.0倍。例如，可在一年(12个月)或两年(24个月)内确定所述增加/减少。

在第十四方面，本发明涉及至少三个多核苷酸(探针或引物，特别是引物对)用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的(体外)用途，所述至少三个多核苷酸用于检测分离自患者的血液样品中的至少三种miRNA(例如至少3种、4种或5种miRNA或6种miRNA)，其中，至少三种miRNA包含在集中，所述集选自于由以下所组成的组：

(a)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：10，以及

(b)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24。

检测miRNA的患者可为怀疑患有AD的患者或者患有AD的患者。

至少三个多核苷酸可为探针或引物，特别是引物对。

优选地，

(i)所述多核苷酸与上述(各)miRNA至少部分(反向)互补，优选(反向)互补；或者

关于多核苷酸变体，参照本发明的第三方面。

上述多核苷酸(探针或引物，特别是引物对)可用于实施根据本发明的第十三方面的方法。

在第十五方面，本发明涉及用于确定患者中的阿尔茨海默氏病的试剂盒(的用途)，所述试剂盒包含：

(i)确定分离自患者的血液样品中的至少三种miRNA(例如至少3种、4种或5种miRNA或6种miRNA)(各自)的水平的工具，其中，至少三种miRNA包含在集中，所述集选自于由以下所组成的组：

(a)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：10；和

(b)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24；

以及

(ii)任选至少三个参比。

确定miRNA水平的患者可为怀疑患有AD的患者或者患有AD的患者。

特别是，该试剂盒可用于实施根据本发明的第十三方面的方法。

特别是，用于确定至少三种miRNA(各自)的水平的工具包括：

至少三个多核苷酸(多核苷酸探针)(对于每种待检测的miRNA而言，特异性的多核苷酸探针)，特别是根据本发明的第十四方面所述；

至少三个引物对(对于每种待检测的miRNA而言，特异性的引物对)；和/或

至少三个多核苷酸(多核苷酸探针)(特别是根据本发明的第十四方面所述)，以及至少三种能够结合所述多核苷酸(多核苷酸探针)和所述miRNA的杂交体的抗体(对于每种待检测miRNA而言，特异性多核苷酸探针和能够结合所述多核苷酸探针和所述miRNA的杂交体的抗体)。

所述工具允许确定分离自患者的血液样品中的至少三种miRNA(各自)的水平，从而确定患者中的AD。

特别是，

可确定患者(怀疑具有AD)是否患有AD；

可确定患者(怀疑具有AD)中是否存在AD；

可确定患者(怀疑具有AD)中是否不存在AD；

可确定患者是否处于发展为AD的风险中；和/或

可确定患者(具有AD)的AD病程。

至少三个多核苷酸(多核苷酸探针)可为微阵列/生物芯片的部分，或者可附着于基于珠的多重系统的珠。

至少三个多核苷酸(引物，特别是引物对)可为RT-PCR系统、PCR系统或下一代测序系统的部分。

所述工具可进一步包括微阵列、RT-PCT系统、PCR系统、流式细胞仪、Luminex系统和/或下一代测序系统。

试剂盒还可包含

(iii)容器，和/或

(iv)数据载体。

数据载体可包含关于如何执行根据本发明的第十三方面的方法的信息或指令。

根据本发明的第一、第二、第七、第八或第十三方面的至少三种miRNA(各自)的水平的确定可通过用于确定核苷酸序列(例如miRNA)水平的任何方便的工具进行。为了该目的，可使用定性检测方法、半定量检测方法和定量检测方法。定量检测方法是优选的。多种技术是本领域技术人员众所周知的。例如，至少三种miRNA(各自)的水平可在根据本发明的第一、第二、第七、第八或第十三方面的方法中通过核酸杂交、核酸扩增、聚合酶延伸、测序、质谱、免疫化学方法或它们的任意组合来确定。

优选地，

(i)使用微阵列/生物芯片或者使用原位杂交进行核酸杂交；

(ii)使用实时PCR(RT-PCR)或实时定量PCR(RT-qPCR)进行核酸扩增；

(iii)测序为下一代测序；或者

(iv)免疫化学方法为酶联免疫吸附测定(ELISA)。

例如，可使用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)(例如实时定量PCR(RT-qPCR))来进行核酸扩增。实时聚合酶链反应(RT-PCR)可包括以下步骤：(i)从分离自患者的血液样品中提取总RNA；(ii)使用miRNA特异性引物通过RNA逆转录(RT)反应获得cDNA样品；(iii)设计miRNA特异性cDNA正向引物，并提供通用反向引物，以通过聚合酶链式反应(PCR)扩增cDNA；(iv)添加荧光探针进行PCR；以及(v)检测和比较相对于分离自(对照)受试者的参比血液样品中的miRNA水平，分离自患者的血液样品中的miRNA的水平的变化。

有多种通过实时聚合酶链式反应(RT-PCR)(例如实时定量PCR(RT-qPCR))确定miRNA水平的试剂盒和方案可用。例如，可根据制造商的建议使用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)进行miRNA的逆转录。

例如，可使用微阵列/生物芯片或原位杂交来进行核酸杂交。例如，对于核酸杂交，将本文描述的与待检测的相应miRNA互补的多核苷酸(探针)连接至固相以产生微阵列/生物芯片。然后将所述微阵列/生物芯片与分离(例如提取)自血液样品的miRNA一起孵育，所述miRNA可被标记或不被标记。在将标记的miRNA与微阵列/生物芯片上的互补多核苷酸序列杂交后，可对杂交的成功进行控制，并且可通过标记的杂交信号确定杂交的强度，从而确定所述血液样品中每个被测miRNA的水平。

或者，可使用免疫化学方法(例如使用ELISA)确定miRNA水平。所述方法可包括以下步骤：(i)从血液样品中分离miRNA；(ii)使多核苷酸探针与miRNA(互补)杂交以获得所述多核苷酸探针和所述miRNA的杂交体；(iii)使所述杂交体与能够特异性结合所述多核苷酸探针和所述miRNA的杂交体的抗体结合；以及(iv)检测结合抗体的杂交体。

在根据本发明的第一、第二、第七、第八或第十三方面的方法中，miRNA的水平优选为所述miRNA的表达水平。

在根据本发明的第一、第二、第七、第八或第十三方面的方法中，患者进一步优选为哺乳动物，优选为人。

在根据本发明的第一、第二、第七、第八或第十三方面的方法中，血液样品还优选为全血样品或血液级分。血液级分更优选为血清、血浆或血细胞/细胞级分。甚至更优选地，血液级分为血细胞/细胞级分。最优选地，血细胞/细胞级分包括红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)；或基本上由红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)组成；或由红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)组成。

在根据本发明的第三、第四、第九、第十或第十四方面的用途中，血液样品优选为全血样品或血液级分。血液级分更优选为血清、血浆或血细胞/细胞级分。甚至更优选地，血液级分为血细胞/细胞级分。最优选地，血细胞/细胞级分包括红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)；或基本上由红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)组成；或由红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)组成。

在根据本发明的第五、第六、第十一、第十二或第十五方面的试剂盒中，优选地，所述工具用于确定全血样品或血液级分中的至少三种miRNA(各自)的水平。血液级分更优选为血清、血浆或血细胞/细胞级分。甚至更优选地，血液级分为血细胞/细胞级分。最优选地，血细胞/细胞级分包括红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)；或基本上由红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)组成；或由红细胞、白细胞和/或血小板(例如，红细胞、白细胞和血小板)组成。

本发明的各种修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的，这并未脱离本发明范围。尽管结合具体的优选实施方式描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应不适当地限制于此类特定实施方式。实际上，本发明旨在覆盖用于实施本发明的所描述的方式的各种修改，所述修改对于相关领域中的本领域技术人员是显而易见的。

附图说明

以下附图仅为对本发明的说明，而不应解释为以任何方式限制如所附权利要求所指示的本发明的范围。

图1：用于确定患者中的阿尔茨海默氏病(AD)的miRNA列表。实验细节：SEQ ID NO：序列标识号；miRNA：根据miRBase的miRNA的标识符；核苷酸序列：各miRNA的序列。

图2：标签中的标志物的性能。列出的是当前(V21)miRBase标识，后跟SEQ ID和第一人群(来自美国患者的样品)中的显著性值、第一人群的AUC、第二人群(来自德国患者的样品)中的p值和第二人群的AUC。AUC值>0.5被认为代表上调的miRNA；AUC值<0.5被认为代表下调的miRNA。低于α水平0.05的双尾t检验p值被认为是显著的。

图3：标签的性能。提供的是标签中所有miRNA的列表、标签中所有miRNA的SEQ ID、标签复杂性(标签中miRNA的数量)以及性能的最坏情况估计。结果以如下方式确定：特异性、敏感性和精度这三个性能值没有显著差异(即特异性＝敏感性＝精度)。

图4：用于逆转录的茎环反向引物。为了确定本文所指定的miRNA的水平，可首先使用具有选自于由SEQ ID NO：25-SEQ ID NO：35所组成的组的核苷酸序列的茎环反向引物，通过逆转录酶由总RNA将miRNA转录成miRNA特异性互补DNA(cDNA)。然后，将miRNA特异性cDNA用作实时聚合酶链式反应(RT-PCR)(特别是实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR))的模板(请参见下面的图5)。实验细节：SEQ ID NO：各miRNA的序列标识号；miRNA：根据miRBase的miRNA的标识符；SEQ ID NO：茎环反向引物的序列识别号，茎环反向引物的核苷酸序列。

图5：RT-PCR(特别是RT-qPCR)的正向引物。然后，可将产生的miRNA特异性cDNA用作RT-PCR(特别是RT-qPCR)的模板。示出了具有选自于由SEQ ID NO：36-SEQ ID NO：46所组成的组的核苷酸序列的合适的正向引物。实验细节：SEQ ID NO：miRNA的序列标识号；miRNA：根据miRBase的miRNA的标识符；SEQ ID NO：正向引物的序列标识号，正向引物的核苷酸序列。

图6：RT-PCR(特别是RT-qPCR)的反向引物。然后，可将产生的miRNA特异性cDNA用作RT-PCR(特别是RT-qPCR)的模板。示出了具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的合适的通用反向引物。例如，为了扩增具有根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列的miRNA，可使用具有根据SEQ ID NO：36的核苷酸序列的正向引物和具有根据SEQ ID NO：47的核苷酸序列的反向引物。

图7：示出了双标记探针。双标记探针是用两种不同染料标记的单链寡核苷酸。报告子染料位于5'端，淬灭分子位于3'端。淬灭分子通过荧光共振能量转移(FRET)抑制报告子的自然荧光发射。引物被聚合酶延伸，探针与特异性核苷酸模板结合。水解作用将报告子从探针/靶标杂合体中释放出来，导致荧光增强。测量的荧光信号与靶miRNA的量成正比。实验细节：SEQ ID NO：miRNA的序列标识号；miRNA：根据miRBase的miRNA的标识符；SEQ IDNO：双标记探针的序列标识号；双标记探针：双标记探针的序列，具有56-FAM＝5'6-FAM(荧光素)，3IABLFQ＝lowa黑色荧光素淬灭剂。

实施例

下面给出的实施例仅用于说明目的，绝不以任何方式限制上述发明。

实施例1：美国人群分析

患者详情

我们通过NGS或者通过RT-qPCR或者通过两种方法分析了总共215名患者和健康对照的外周血中的miRNA表达。具体而言，我们从患有AD的患者(n＝106)和健康对照(C)(n＝22)获得了收集于PAXgene Blood RNA管(PreAnalytiX)中的2.5mL血液。来自AD患者的样品源于Biorepository和Tissue Bank PrecisionMed(San Diego，CA，USA)(n＝97)和University Clinic of Erlangen(Germany)(n＝9)，来自健康对照的样品源自PrecisionMed(San Diego，CA，USA)。通过使用最新标准诊断AD患者。具体而言，为了被包括在可信的AD组中，患者满足NINCDS-ADRDA(National Institute of Neurological andCommunicative Disorders and Stroke and the Alzheimer disease and RelatedDisorders Association)的以下标准：MMSE>14且<26；两个或多个认知领域的缺陷；记忆和其它认知功能的逐步恶化；无意识障碍；在40岁-90岁之间发作，最常在65岁以后发作；并且没有全身性疾病或可能导致认知的逐步退化的其它脑疾病。此外，还提供了与AD相匹配的MRI或CT报告。AD患者的MMSE中位评分为18.9(3.4)。

RNA分离

对包含在PAXgene Blood RNA管中的全血样品进行离心，以将细胞级分与细胞外级分(血清和血浆)分离。弃去细胞外级分。按照制造商的建议，使用PAXgene Blood miRNA试剂盒(Qiagen)从血细胞中分离出包含miRNA在内的总RNA。分离的RNA储存在-80℃直至使用。使用Bioanalyzer 2100(Agilent)分析RNA完整性，并使用NanoDrop 2000(ThermoScientific)测量浓度和纯度。

文库制备和下一代测序

我们首先通过下一代测序(NGS)分析来自AD患者(n＝48)和健康对照(n＝22)的样品。对于文库制备，每样品使用200ng总RNA，这是通过Bioanalyzer 2100(Agilent)上的RNA6000Nano Chip确定的。按照TruSeq Small RNA Sample Prep试剂盒(Illumina)的方案进行制备。使用DNA 1000Chip在Bioanalyzer上测量制备好的文库的浓度。然后将文库以等量的六个样品的批次合并，并使用cBot(Illumina)在单个读段流动池的每一个泳道中以9pmol的浓度聚集。在HiSeq 2000(Illumina)上进行50个循环的测序。使用CASAVAv.1.8.2.对原始测序数据进行多路分解并生成fastq文件。

NGS数据分析

首先使用FASTX-Toolkit中的fastx_clipper程序通过剪切3'接头序列，对原始的Illumina读段进行预处理。剪裁后，短于18nt的读段被移除。将剩余的读段减少为独特的读段，并且每个样品的频率也会降低，从而使映射(mapping)步骤的时间效率更高。对于剩余步骤，我们使用了miRDeep2通道( MR，Mackowiak SD，Li N，Chen W，RajewskyN：miRDeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genesin seven animal clades.Nucleic Acids Res 2012，40：37-52)。这些步骤由以下构成：针对基因组(hg19)映射所述读段；针对miRBase版本v18中的miRNA前体序列映射所述读段；汇总样品计数；以及预测新的miRNA。由于miRDeep2通道预测我们的案例中每样品的新miRNA，然后我们按如下方式合并了miRNA：首先，我们提取每样品中的新miRNA，其信噪比>10。随后，我们仅合并位于同一染色体上的那些新miRNA，并且它们的成熟形式都共享至少11个核苷酸的重叠。其余推定的新miRNA用BLAST(v 2.2.24，Altschul SF，Gish W，Miller W，Myers EW，Lipman DJ：Basic local alignment search tool.JMolecular Biol 1990，215：403-410)针对已知的来自多种来源的miRNA和ncRNA序列(miRBase v18，Kozomara A，Griffiths-Jones S：miRBase：integrating microRNA annotation and deep-sequencingdata.Nucleic Acids Res 2011，39：D152-15)、snoRNA-LBME-db(Lestrade L，Weber MJ：snoRNA-LBME-db，a comprehensive database of human H/ACA and C/D boxsnoRNAs.Nucleic Acids Res 2006，34：D158-162)、来自Ensembl'Homo_sapiens.GRCh37.67.ncrna.fa'，NONCODE v3.0的ncRNA(Bu D,Yu K,Sun S,Xie C,Skogerbo G,Miao R,Xiao H,Liao Q,Luo H,Zhao G,Zhao H,Liu Z,Liu C,Chen R,ZhaoY：NONCODE v3.0：integrative annotation of long noncoding RNAs.Nucleic AcidsRes 2012,40:D210-215)进行映射。我们排除了与任何ncRNA序列具有大于其长度的90％(允许1个错配)对齐的序列。所有NGS数据均可在GEO数据库(GSE46579)中公开获得。

生物信息学分析

对于NGS分析，我们排除了每组所有样品(AD或对照)中总读段计数<50的miRNA，因为它们被认为含量很低。我们使用标准分位数归一化对读段计数进行归一化。接下来，我们使用Wilcoxon-Mann-Whitney(WMW)测试计算了每种miRNA的接收者工作特征曲线下面积(AUC)、倍数变化和显著性值(P值)。使用Benjamini-Hochberg方法就多个测试对所有显著性值进行了调整(Benjamini Y，Drai D，Elmer G，Kafkafi N，Golani I：Controlling thefalse discovery rate in behavior genetics research.Behav Brain Res 2001，125：279-284；Hochberg Y：A sharper bonferroni procedure for multiple tests ofsignificance.Biometrica 1988，75：185-193)。使用免费可得的工具R(Team R：R：ALanguageand Environment for Statistical Computing.Vienna：R Foundation forStatistical Computing 2008)进行了生物信息学分析。为了分类的目的，我们使用了R包e1071中的支持向量机(SVM)。如果没有另外说明，我们使用线性核在10次交叉验证中以100次重复来计算分组分类(group-wise classifications)。此外，我们使用与对照相同的参数计算了排列的类标签(permuted class labels)的分类。如果组大小不平衡，我们将在每个重复中从较大组中随机选择样品，以匹配较小组中的样品大小。结果在图2中示出(ttestad1 vs con1，auc ad1 vs con1)。

实施例2：德国人群分析

患者和miRNA分析

我们在PAXgene Blood RNA(PreAnalytiX)管中收集了来自AD患者(n＝49)和健康对照(n＝55)的2.5mL血液。分析程序如下进行：简而言之，我们对PAXgene Blood RNA管中包含的全血样品进行离心，以将细胞级分与细胞外级分(血清和血浆)分离。我们弃去了细胞外级分。按照制造商的说明，使用PAXgene Blood miRNA试剂盒(Qiagen)从管中的血细胞分离总RNA。为了制备测序文库，使用200ng的总RNA(使用Bioanalyzer 2100[Agilent]通过RNA 6000Nano Chip定量)。根据TruSeq Small RNA Sample Prep试剂盒(Illumina)的方案进行制备。使用Bioanalyzer(DNA 1000Chip)测量制备好的文库的浓度。然后以9pmol的浓度聚集文库，一个泳道中六个样品。在HiSeq 2000仪器(Illumina)上进行50个循环的测序，并使用CASAVA版本1.8.2对原始测序数据进行解复用。

统计分析

如上所述，在R(版本3.0.2)中进行下游分析之前，通过miRDeep2对所有290个样品进行处理。对于所有样品一起，进行了分位数归一化，并排除了在少于五个样品中具有5个读段的所有miRNA，以使噪声最小化。此过程产生了580miRNA的集，用于进一步研究。在适用的情况下，使用Benjamini-Hochberg校正就多次测试对P值进行调整。对于假设检验，我们计算了未配对的双尾t检验。由于并非所有的miRNA都呈正态分布，因此我们还计算了非参数Wilcoxon Mann-Whitney(WMW)检验(未配对、双尾)。除假设检验外，还针对每种miRNA计算了接收者工作特征曲线下面积(AUC)。为了关联两个人群中的AUC，以0到1之间的间隔提供AUC。AD中表达较高的miRNA的AUC为0.5，而对照中表达较高的miRNA的AUC为0.5，同等丰度的miRNA的AUC约为0.5。为了计算AUC的置信区间(CI)，使用pROC包执行了1000个bootstrap样品。作为进一步的统计方法，我们进行了分层聚类，如在Heatplus R包中实施(将读段计数转换为z分数，并依赖Euclidian距离完成了完整的链接聚类(linkageclustering))。我们还进行了主成分分析(PCA)，在prcomp R包中实施；并以散点图显示了第一主成分与第二主成分。最后，将方差分析(ANOVA)应用于两个组：AD和未受影响的对照。

为了结合多种miRNA的预测能力，进行了机器学习。详细而言，使用径向基函数作为内核的支持向量机进行了训练并使用对完整数据集的五重交叉验证进行评价。为了说明不同交叉验证运行之间的差异，对测试和训练数据中的20个随机分区重复了该过程。为了选择相对于AD而言最有用的miRNA，基于P值进行了逐步向前特征选择。在此，在每次迭代中，选择交叉验证的训练部分中P值最低的k个特征(k在2个至500个特征之间变化)，然后在测试样品部分进行评价。为了检查潜在的过度训练，进行了20次重复的排列测试。在此，使用随机排列的类别标签执行完整的子集选择步骤以及分类。结果在图2中示出(ttest ad2vs con2，auc ad2 vs con2)。

实施例3：美国和德国人群的组合分析

在本发明中，开发了来自阿尔茨海默氏病(AD)患者和未受影响个体(UI)的两种人群的标签。对于AD样品和UI样品，生成了全血miRNA谱。如上所述对AD样品和UI进行测序和预处理(美国人群：实施例1；德国人群：实施例2)。该研究的目的是计算具有足够复杂性的标签。为此，不仅计算了交叉验证(重新采样)误差，而且还计算了盲测误差，其中，将基于在美国获得的特征的模型应用于预测德国人群。由于考虑所有潜在特征的naive brute-fore实施方式将对应于过度训练并且无论如何都不可行(对于816种miRNA，存在超过180亿个4-miRNA特征)，应用了简单的遗传算法。该算法允许最多运行10000次迭代，或者在收敛后停止。作为分类方法，使用了具有类权重的径向基函数支持向量机。对于每个标签，计算了重采样误差和盲测性能。对于由3到7个标志物组成的最佳标签，各自的性能率在图3示出。交叉验证和盲测误差显示出0.55的合理相关性，但同时强调了在重采样精度方面，具有最佳性能的标签不一定是盲测精度中最好的。就这一点而言，由hsa-let-7a-5p、hsa-miR-6783-3p和hsa-miR-151a-3p组成的最佳标签的重采样精度为94.7％，而盲测精度仅为57.7％。遗传算法产生的最佳精度具有81.6％的重采样精度和76.9％的盲测精度(请参阅SA-1)。

因此，我们的新标签是在不同国家和不同种族背景的人群中均持有的第一稳定的阿尔茨海默氏病标签。

序列表

<110> 蜂鸟诊断有限责任公司等

<120> 作为用于阿尔茨海默病的生物标志物的miRNA

<130> 505-64 PCT

<150> EP17198253

<151> 2017 10 25

<160> 58

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

aauugcacgg uauccaucug ua 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

cacuagauug ugagcuccug ga 22

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

ugagguagga gguuguauag uu 22

<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

ccuccguguu accuguccuc uag 23

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

cuuucagucg gauguuuaca gc 22

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

uuccugggcu ucuccucugu ag 22

<210> 7

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

cuuucagucg gauguuugca gc 22

<210> 8

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

uguccucuag ggccugcagu cu 22

<210> 9

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

cuauacgacc ugcugccuuu cu 22

<210> 10

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

uuaucagaau cuccaggggu ac 22

<210> 11

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

ucucugggcc ugugucuuag gc 22

<210> 12

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

uuggcugguc ucugcuccgc ag 22

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

ucacagugaa ccggucucuu u 21

<210> 14

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

cuccguuugc cuguuucgcu g 21

<210> 15

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 15

uccgucucag uuacuuuaua gc 22

<210> 16

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

cuagacugaa gcuccuugag g 21

<210> 17

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 17

cugcccuagu cuagcugaag cu 22

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<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

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<213> 智人(Homo sapiens)

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<213> 智人(Homo sapiens)

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<213> 智人(Homo sapiens)

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<213> 智人(Homo sapiens)

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<213> 智人(Homo sapiens)

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

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<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

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<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

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<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

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<212> DNA

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