阅读说明：本技术 一种快速统计植物花粉-胚珠比的方法 (Method for rapidly counting plant pollen-ovule ratio ) 是由 裴男才 孙冰 史欣 李健容 罗中莱 于 2020-04-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种快速统计植物花粉-胚珠比的方法。该方法将花药材料置于离心管中,加入适当体积的I<Sub>2</Sub>-KI溶液,挤压和旋转捣碎后使用涡旋混合仪对管中的混悬液进行震荡,用I<Sub>2</Sub>-KI溶液定容至一定体积,再次充分涡旋混合；用移液器汲取花粉混悬液置于细胞计数板的测量室中,使用全自动细胞计数仪检测花粉混悬液浓度,得到所检测植物的单花花粉量；将子房材料放入培养皿,置于研究级体视显微镜下进行解剖统计胚珠数量,解剖时培养皿中加少量PBS；根据单花花粉量和胚珠数,准确计算花粉-胚珠比。本发明的统计方法单位时间处理样品数4-6个、准确性达95％以上,显著优于传统技术手段,适用于具有不同尺寸花粉的植物类群。(The invention discloses a method for rapidly counting the ratio of plant pollen to ovule. The method comprises placing anther material in a centrifuge tube, adding appropriate volume of I 2 Squeezing KI solution, rotary mashing, shaking the suspension in the tube with vortex mixer, and adding I 2 Fixing the volume of the KI solution to a certain volume, and fully mixing by vortex again; drawing the pollen suspension by a pipettor, placing the pollen suspension in a measuring chamber of a cell counting plate, and detecting the concentration of the pollen suspension by using a full-automatic cell counter to obtain the single pollen amount of the detected plant; placing the ovary material into a culture dish, placing the culture dish under a research grade stereoscopic microscope for dissection to count the number of ovules, and adding a small amount of PBS (phosphate buffer solution) into the culture dish during dissection; and accurately calculating the pollen-ovule ratio according to the amount of the single pollen and the number of ovules. The statistical method disclosed by the invention has the advantages that the number of processed samples per unit time is 4-6, the accuracy is more than 95%, the statistical method is obviously superior to the traditional technical means, and the statistical method is suitable for plant groups with pollen of different sizes.)

一种快速统计植物花粉-胚珠比的方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种快速统计植物花粉-胚珠比的方法。

背景技术

花粉-胚珠比(Pollen–ovule ratio，简称P/O ratio)指的是植物单花中花粉数与胚珠数的比值，通常被看作是描述有花植物繁育系统的一个保守性指标，也会受到繁育系统、传粉机制、生活型和花部结构等因素的影响。花粉-胚珠比是植物繁殖生物学研究中的重要参考指标，相应数值会随着进化分支和生长生境的不同而发生波动。因此，从更大的层面来看，相关研究可尝试突破常规的单个/少数几个物种的局限，逐步关注类群水平(如科、属)和群落水平(如具有较多共存物种的森林群落)等更高层级、更加复杂的综合研究，为当前(类群和群落水平)系统发育研究补充重要繁殖性状数据，搭建科/目层阶的系统发育进化树框架，这将有助于探索森林群落的繁殖性状基本格局和相应的网络进化过程。

绝大部分已有研究针对单个物种，仅有约不超过5％的研究案例同时包含2个以上的物种。此外，暂时未见有针对花粉胚珠比这一重要指标开展综述性或者系统性的研究。花粉胚珠比的统计方法主要有血球计数板法和显微镜-载玻片法，但已有方法效率较低、准确性稍差、适用性较窄。因此，花粉测算和胚珠计算在更多植物类群研究和实践应用受到一定的限制。

建立效率较高、准确性更好、适用性较广的植物花粉-胚珠比统计方法，将对开展植物繁殖生物学研究和实践应用起到重要的作用。

发明内容

为了解决上述存在问题，本发明提供了一种快速统计植物花粉和胚珠数量的方法，降低单位样品统计耗时，提高统计准确性，且操作简便通用性强。

本发明的目的在于提供一种快速统计植物花粉-胚珠比的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种快速统计植物花粉-胚珠比的方法，包括以下步骤：

(1)获取植物材料，固定、清洗和解剖分离；

(2)将解剖分离后的花药材料置于离心管中，加入适量的I₂-KI溶液；

(3)将离心管中的花药材料捣碎，然后涡旋震荡，使花粉与花药组织充分分离；使用镊子将管中的花药组织去除；用I₂-KI溶液定容至一定体积，再次充分涡旋混合；

(4)吸取适量花粉混悬液，置于细胞计数板的测量室中，使用全自动细胞计数仪检测花粉混悬液浓度；之后通过倍数转换计算，得到所检测植物的单花花粉量；

(5)将解剖分离后的子房材料放入培养皿中，置于体视显微镜下进行解剖，解剖时培养皿中加入少量PBS，统计胚珠数量；

(6)根据单花花粉量和胚珠数量，计算花粉-胚珠比。

上述步骤(1)中所述植物材料为发育阶段的花蕾，或从成熟花蕾中取出的雄蕊和雌蕊组织。

步骤(1)中所述植物材料的固定是使用50％乙醇：冰乙酸：甲醛按体积比18:1:1混合组成的FAA溶液固定，固定时间>48h。

步骤(2)和(3)中的I₂-KI溶液，I₂的浓度为1g/100mL，KI的浓度为8g/100mL。使用I₂-KI溶液稀释花粉，并兼具染色作用，便于使用自动细胞计数仪在花粉混悬液中快速辨识花粉粒，达到准确检测计数效果。

步骤(3)中是使用组织研磨杵将离心管中的花药材料捣碎，该组织研磨杵为聚丙烯材质，尖端圆锥状，带网纹。使用聚丙烯材质且头部具网纹的组织研磨杵对花药材料进行挤压和旋转捣碎，并使用涡旋混合仪对管中的混悬液进行震荡，使花粉与花药组织充分分离，并形成均匀的混悬液。

步骤(4)中的细胞计数板为透明塑料材质，测量室容积为20μL。

步骤(5)中的PBS浓度为0.1mol/L。使用0.1mol/L PBS浸没胚珠，便于实验操作并减少组织变形。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明的快速统计植物花粉-胚珠比的方法的可使单位时间处理样品数达4个以上，准确性达95％以上，明显提高了实验效率和准确性。

2、本发明可适用于具有较大尺寸(花粉平均直径大于35μm)、中等尺寸(花粉平均直径25-35μm)、较小尺寸(花粉平均直径小于25μm)等不同类型的植物花粉数量统计，显著了提高了方法的适用性。

3、本发明的统计方法经过改良，添加了0.1mol/L PBS磷酸缓冲液浸没胚珠处理后，便于实验操作并减少组织变形，工作效率和准确性也有显著提高。

附图说明

图1为野牡丹子房。解剖后，显示大量胚珠生长于胎座之上。

图2为具有较小尺寸的植物花粉显微图(野牡丹)。花粉数量多，且直径小；花粉平均直径：20.3μm。

图3为具有中等尺寸的植物花粉显微图(腊肠树)。花粉属于通常大小范围，形状为近圆形；花粉平均直径：31.2μm。

图4为具有较大尺寸的植物花粉显微图(栀子)。花粉数量较少，且直径大；花粉平均直径：44.7μm。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

本发明得到中国林科院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金青年人才项目(亚热带森林木本植物繁殖性状与群落谱系研究；编号：CAFYBB2017QB002)、广东省林业科技创新项目(岭南槭良种选育研究与示范；编号：2015KJCX017、2017KJCX022)和中国科学院植物资源保护与可持续利用重点实验室开放基金资助项目(南亚热带常绿阔叶林重要植物类群繁殖性状监测；编号：PCU201903)的支持。

实施例1

较小尺寸花粉，花粉平均直径小于25μm

(1)获取野牡丹(Melastoma malabathricum)植物材料(大花蕾)，使用FAA溶液(50％乙醇:冰乙酸:甲醛＝18:1:1，体积比)固定，固定时间>48h，清洗和解剖分离；

(2)将解剖分离后的花药材料置于容量为1.5mL的尖底带盖离心管中，加入适当体积的I₂-KI溶液(溶液中I₂的浓度为1g/100mL，KI的浓度为8g/100mL)；

(3)使用聚丙烯材质且头部具网纹的组织研磨杵对离心管中的花药材料进行挤压和旋转捣碎；之后使用涡旋混合仪对管中的混悬液进行震荡，使花粉与花药组织充分分离；使用镊子将管中较大的花药组织去除，以减少杂质；用I₂-KI溶液定容至一定体积(1mL)，再次充分涡旋混合，得到花粉混悬液；

(4)立即使用移液器吸取20μL花粉混悬液，置于透明塑料材质的专用细胞计数板的测量室(容积为20μL)中，使用全自动细胞计数仪(CountStar 2.0)检测花粉混悬液浓度，之后通过倍数转换计算，得到所检测植物的单花花粉量，结果显示花粉混悬液浓度为1.4×10⁶个/mL，野牡丹植物花粉显微图见图2；

(5)将解剖分离后的子房材料(如图1)放入培养皿，置于研究级体视显微镜(ZeissDV12)下进行解剖，解剖时培养皿中加少量浓度为0.1mol/L PBS(磷酸缓冲液)，统计胚珠数量，结果显示胚珠数平均值为1263，胚珠显微图见图1；

(6)根据单花花粉量和胚珠数，计算花粉-胚珠比(Pollen-Ovule Ratio)。

实施例2

中等尺寸花粉，花粉平均直径25-35μm

(1)获取腊肠树(Cassia fistula)植物材料(大花蕾)，使用FAA溶液(50％乙醇:冰乙酸:甲醛＝18:1:1，体积比)固定，固定时间>48h，清洗和解剖分离；

(2)将解剖分离后的花药材料置于容量为1.5mL的尖底带盖离心管中，加入适当体积的I₂-KI溶液(溶液中I₂的浓度为1g/100mL，KI的浓度为8g/100mL)；

(3)使用聚丙烯材质且头部具网纹的组织研磨杵对离心管中的花药材料进行挤压和旋转捣碎；之后使用涡旋混合仪对管中的混悬液进行震荡，使花粉与花药组织充分分离；使用镊子将管中较大的花药组织去除，以减少杂质；用I₂-KI溶液定容至一定体积(1mL)，再次充分涡旋混合，得到花粉混悬液；

(4)立即使用移液器吸取20μL花粉混悬液，置于透明塑料材质的专用细胞计数板的测量室(容积为20μL)中，使用全自动细胞计数仪(CountStar 2.0)检测花粉混悬液浓度，之后通过倍数转换计算，得到所检测植物的单花花粉量，结果显示花粉混悬液浓度为3.8×10⁴个/mL，腊肠树植物花粉显微图见图3；

(5)将解剖分离后的子房材料放入培养皿，置于研究级体视显微镜(Zeiss DV12)下进行解剖，解剖时培养皿中加少量浓度为0.1mol/L PBS(磷酸缓冲液)，统计胚珠数量，结果显示胚珠数平均值为93；

(6)根据单花花粉量和胚珠数，计算花粉-胚珠比(Pollen-Ovule Ratio)。

实施例3

较大尺寸花粉，花粉平均直径大于35μm

(1)获取栀子(Gardenia jasminoides)植物材料(大花蕾)，使用FAA溶液(50％乙醇:冰乙酸:甲醛＝18:1:1，体积比)固定，固定时间>48h，清洗和解剖分离；

(2)将解剖分离后的花药材料置于容量为1.5mL的尖底带盖离心管中，加入适当体积的I₂-KI溶液(溶液中I₂的浓度为1g/100mL，KI的浓度为8g/100mL)；

(3)使用聚丙烯材质且头部具网纹的组织研磨杵对离心管中的花药材料进行挤压和旋转捣碎；之后使用涡旋混合仪对管中的混悬液进行震荡，使花粉与花药组织充分分离；使用镊子将管中较大的花药组织去除，以减少杂质；用I₂-KI溶液定容至一定体积(1mL)，再次充分涡旋混合，得到花粉混悬液；

(4)立即使用移液器吸取20μL花粉混悬液，置于透明塑料材质的专用细胞计数板的测量室(容积为20μL)中，使用全自动细胞计数仪(CountStar 2.0)检测花粉混悬液浓度，之后通过倍数转换计算，得到所检测植物的单花花粉量，结果显示花粉混悬液浓度为1.6×10⁴个/mL，栀子植物花粉显微图见图4；

(5)将解剖分离后的子房材料放入培养皿，置于研究级体视显微镜(Zeiss DV12)下进行解剖，解剖时培养皿中加少量浓度为0.1mol/L PBS(磷酸缓冲液)，统计胚珠数量，结果显示胚珠数平均值为172；

(6)根据单花花粉量和胚珠数，计算花粉-胚珠比(Pollen-Ovule Ratio)。

下面对上述实施例1-3中针对具有不同尺寸花粉植物的单位时间处理样品数和准确性进行统计，并与常规统计方法(血球计数板法)所获得的单位时间处理样品数和准确性进行对比，以及与类似于实施例1-3的统计方法(显微镜-载玻片法)间的效果比较(如表1所示)。

1、上述常规统计方法(血球计数板法)为：

(1)获取植物材料(大花蕾)，使用FAA溶液(50％乙醇:冰乙酸:甲醛＝18:1:1，体积比)固定，固定时间>48h，清洗和解剖分离；

(2)将解剖分离后的花药材料置于容量为1.5mL的尖底带盖离心管中，加入适当体积的I₂-KI溶液(溶液中I₂的浓度为1g/100mL，KI的浓度为8g/100mL)；

(3)使用聚丙烯材质且头部具网纹的组织研磨杵对离心管中的花药材料进行挤压和旋转捣碎；之后使用涡旋混合仪对管中的混悬液进行震荡，使花粉与花药组织充分分离；使用镊子将管中较大的花药组织去除，以减少杂质；用I₂-KI溶液定容至一定体积(1mL)，再次充分涡旋混合，得到花粉混悬液；

(4)立即使用移液器吸取20μL花粉混悬液，置于血球计数板的测量室中，人工检测花粉混悬液浓度；之后通过倍数转换计算，得到所检测植物的单花花粉量；

(5)将解剖分离后的子房材料放入培养皿，置于常规显微镜下进行解剖，统计胚珠数量；

(6)根据单花花粉量和胚珠数，计算花粉-胚珠比(Pollen-Ovule Ratio)。

2、类似于实施例1-3的统计方法(显微镜-载玻片法)为：

步骤(1)、(2)、(3)同实施例3，步骤(4)、(5)、(6)为如下：

(4)立即使用移液器吸取1μL花粉混悬液置于载玻片上，在显微镜(Olympus BX-41；Olympus,Japan)下观察并统计花粉数，之后通过倍数转换计算，得到所检测植物的单花花粉量。

(5)将解剖分离后的子房材料放入培养皿，置于常规显微镜下进行解剖，统计胚珠数量；

(6)根据单花花粉量和胚珠数，计算花粉-胚珠比(Pollen-Ovule Ratio)。

表1本发明方法与常规统计方法、显微镜-载玻片法所获得的单位时间处理样品数和准确性的对比

注：较大尺寸花粉指的平均直径大于35μm、中等尺寸花粉指的平均直径25-35μm、较小尺寸花粉指的平均直径小于25μm。

从表1所统计的数据中可获知，本发明的统计方法单位时间处理样品数4-6个、准确性达95％以上。本发明的统计方法经过改良，添加了0.1mol/L PBS浸没胚珠处理后，工作效率和准确性也有显著提高，适用于具有不同尺寸花粉的植物类群。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。