阅读说明：本技术 一种核酸即时检验的方法 (Method for instant detection of nucleic acid ) 是由 汪杰 潘健 刘如明 郇伟伟 邓旭 于 2020-04-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种核酸即时检验的方法,涉及核酸检验技术领域。一种核酸即时检验的方法,所述即时检验的方法包括以下步骤待测样本加入蛋白酶K；再加入裂解液、羟基磁珠进行富集,富集后进行洗涤、干燥,使用等温扩增液重悬磁珠,静置后磁力架吸附磁珠,反应得到扩增富集磁珠；所述扩增富集磁珠与磁珠-COOH-NH2-RNA-FAM的扩增子富集液混合摇匀,孵育后吸附磁珠,去除上清液,加入的Cas13a核酸检测技术反应体系,反应观察荧光。运用不同表面修饰的磁珠,在核酸提取,扩增子富集,磁珠-RNA-荧光探针的荧光信号检测,辅助结合等温扩增和cas13a实现病原体核酸的即时检验。(The invention discloses a method for instantly testing nucleic acid, and relates to the technical field of nucleic acid testing. A method for the point-of-care testing of nucleic acid, the said method for point-of-care testing includes the following steps that protease K is added to the sample to be tested; adding lysis solution and hydroxyl magnetic beads for enrichment, washing and drying after enrichment, using isothermal amplification solution to resuspend the magnetic beads, standing, adsorbing the magnetic beads by a magnetic frame, and reacting to obtain amplified enriched magnetic beads; and mixing and shaking the amplification enrichment magnetic beads and the amplicon enrichment liquid of the magnetic beads-COOH-NH 2-RNA-FAM uniformly, adsorbing the magnetic beads after incubation, removing supernatant, adding a Cas13a nucleic acid detection technology reaction system, and reacting and observing fluorescence. Different surface modified magnetic beads are used for realizing the instant detection of pathogen nucleic acid in nucleic acid extraction, amplicon enrichment, magnetic bead-RNA-fluorescent probe fluorescent signal detection and auxiliary combination of isothermal amplification and cas13 a.)

一种核酸即时检验的方法

技术领域

本发明涉及高强纤维材料技术领域，具体是一种核酸即时检验的方法。

背景技术

现场快速检验(point-of-care testing,POCT)由中国医学装备协会POCT装备技术专业委员会在多次专家论证基础上统一命名，并将其定义为：在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。POCT含义可从两方面进行理解：空间上，在患者身边进行的检验，即“床旁检验”；时间上，可进行“即时检验”。

核酸的检测过程分为核酸提取，靶向PCR扩增及扩增子检测，这些过程以往的检测方法都是独立分开完成的。然而现有的核酸的现场快速检验由于过程繁琐以及对设备的依赖，如QPCR，RT-PCR，导致核酸的现场快速检验很难实现。

发明内容

本发明的目的在于提供一种核酸即时检验的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种核酸即时检验的方法，所述即时检验的方法包括以下步骤：

待测样本加入蛋白酶K；

再加入裂解液、羟基磁珠进行富集，富集后进行洗涤、干燥，使用等温扩增液重悬磁珠，静置后磁力架吸附磁珠，反应得到扩增富集磁珠；

所述扩增富集磁珠与磁珠-COOH-NH2-RNA-FAM的扩增子富集液混合摇匀，孵育后吸附磁珠，去除上清液，加入的Cas13a反应体系，反应观察荧光。

优选的，所述待测样本加入蛋白酶K具体为：

EP管中加入待测样本DEPC水补齐至预定体积，加入蛋白酶K。

优选的，加入裂解液、羟基磁珠后摇匀，室温静置5-10min。

优选的，所述富集后的样品放置磁力架吸附磁珠，移除上清液，加入漂洗液PW，重

悬磁珠，静置后移除反应液。

优选的，所述干燥后，使用等温扩增液重悬磁珠，静置5min后磁力架吸附磁珠，反

应20-30min。

优选的，所述孵育温度为37℃-40℃。

优选的，所述加入cas13a反应体系后反应时间为10-30min。

优选的，所述反应条件为在37℃-40℃下反应10-20min。

优选的，所述干燥后，使用等温扩增液重悬磁珠，静置5min后磁力架吸附磁珠，37℃-40℃下反应20-30min。

优选的，所述磁珠-COOH-NH2-RNA-FAM的扩增子富集液包括：磁珠-COOH-NH2-RNA-FAM和缓冲体系，所述缓冲体系为20mM Tris·Cl，1.0M NaCl，1mM EDTA，0.02％X-100；且，pH为7.8。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明结合多种磁珠的运用，可实现一管内的核酸提取-扩增-信号检测最大程度的优化了核酸提取的过程，结合cas13a和等温扩增技术，让核酸的即时检验成文可能，是等温扩增和cas13a技术运用于即时检验的技术支持。运用不同表面修饰的磁珠，在核酸提取，扩增子富集，磁珠-RNA-荧光探针的荧光信号检测，辅助结合等温扩增和cas13a实现病原体核酸的即时检验。检验过程简单，原场地检测减少生物传播危害。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示出了凝胶电泳检测结果；

图2示出了荧光磁珠荧光检测结果。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述，以下实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

本发明实施例提供，一种核酸即时检验的方法，所述即时检验的方法包括以下步骤：

待测样本加入蛋白酶K；

再加入裂解液、羟基磁珠进行富集，富集后进行洗涤、干燥，使用等温扩增液重悬磁珠，静置后磁力架吸附磁珠，反应得到扩增富集磁珠；

所述扩增富集磁珠与磁珠-COOH-NH2-RNA-FAM的扩增子富集液混合摇匀，孵育后吸附磁珠，去除上清液，加入的cas13a反应体系，反应观察荧光。

上述实施例中：

核酸提取磁珠：

羟基磁珠表面修饰大量硅羟基，能在高盐、低pH条件下和溶液中的核酸通过疏水作用、氢键作用和静电作等发生特异性结合，而不与其它杂质(如蛋白)结合，可迅速从生物样品中分离核酸，操作安全简单，适合核酸的即时检验，对于磁珠的大小进行了优化，同时优化了裂解液的成分和反应过程，配合等温扩增体系，可以在核酸提取后直接是否核酸样本至等温扩增反应体系，完成此过程不需要更换反应管。

扩增子捕获磁珠：

等温扩增后如果要使用cas13a进行核酸的靶向酶活检测，必须要去除等温扩增反应液同时保留扩增产物，使用生物素修饰磁珠集合特定的buffer完成扩增子的液相到固相的转移，从而可以实现反应体系的更换，此过程仍然不需要更换反应管，此过程同步完成了磁珠-COOH-NH2-RNA-FAM的加入及FAM背景信号的去除。

磁珠-COOH-NH2-RNA-FAM cas13a信号检测磁珠：

实现核酸的即时检验，需要简便准确的信号检出系统，使用磁珠-COOH-NH2-RNA-FAM固相探针，把荧光信号固定到磁珠上，当荧光信号未被cas13a切割游离到液相的时候，使用可视化荧光检测设备是观察不到任何荧光信号的，背景很低，而且当扩增产物激活了cas13a酶切活性的时候，FAM从磁珠上游离被释放，得到足够被简易可视化荧光检测装置检测到的水平，完成核酸的及时检测，整个检测过程利用羟基磁珠提取核酸直接释放核酸至等温扩增体系，再使用扩增子捕获探针捕获扩增产物该过程同时加入磁珠-COOH-NH2-RNA-FAM，反应后吸附磁珠更换等温扩增反应液直接加入cas13a反应体系，再吸附磁珠直接检测荧光信号，整个过程样本未离开反应管，利用3种磁珠做到了极简且准确的核酸即时检验，

结合多种磁珠的运用，酸富集磁珠，富集目的核酸；固相RNA探针磁珠，固定RNA探针和淬灭探针荧光信号降噪；扩增子富集磁珠，固定等温扩增DNA产物，便于体系转换。实现一管内的核酸提取-扩增-信号检测最大程度的优化了核酸提取的过程，结合cas13a和等温扩增技术，让核酸的即时检验成文可能，是等温扩增和cas13a技术运用于即时检验的技术支持。运用不同表面修饰的磁珠，在核酸提取，扩增子富集，磁珠-RNA-荧光探针的荧光信号检测，辅助结合等温扩增和cas13a实现病原体核酸的即时检验。检验过程简单，原场地检测减少生物传播危害

一实施例中，所述待测样本加入蛋白酶K具体为：

EP管中加入待测样本DEPC水补齐至预定体积，加入蛋白酶K。

一实施例中，加入裂解液、羟基磁珠后摇匀，室温静置5-10min。

一实施例中，所述富集后的样品放置磁力架吸附磁珠，移除上清液，加入漂洗液PW，重悬磁珠，静置后移除反应液。

一实施例中，所述干燥后，使用等温扩增液重悬磁珠，静置5min后磁力架吸附磁珠，反应20-30min。

一实施例中，所述孵育温度为37℃-40℃下。

一实施例中，所述加入cas13a反应体系后反应时间为10-30min。

一实施例中，所述反应条件为在37℃-40℃下反应20min。

一实施例中，所述干燥后，使用等温扩增液重悬磁珠，静置5min后磁力架吸附磁珠，37℃-40℃下反应20-30min。

一实施例中，磁珠-COOH-NH2-RNA-FAM和缓冲体系，所述缓冲体系为20mM Tris·Cl，1.0M NaCl，1mM EDTA，0.02％X-100；且，pH为7.8。

本发明实施例运用不同表面修饰的磁珠，在核酸提取，扩增子富集，磁珠-RNA-荧光探针的荧光信号检测，辅助结合等温扩增和cas13a实现病原体核酸的即时检验。

下面结合具体的实施例进行详细的说明：

新冠肺炎(COVID-19)的病原体SRAS-CoV-2单链RNA病毒，为了模拟核酸微量提取环境，我们在200ul的牛血清中加入50fM含SRAS-CoV-2S蛋白序列的假病毒作为模拟样本。

待检测核酸序列为：

GCACACGCCUAUUAAUUUAGUGCGUGAUCUCCCUCAGGGUUUUUCGGCUUUAGAACCAUUGGUAGAUUUGCCAAUAGGUAUUAACAUCACUAGGUUUCAAACUUUACUUGCUUUACAUAGAAGUUAUUUGACUCCUGGUGAUUCUUCUUCAGGUUGGACAGCUGGUGCUGCAGCUUAUUAUGUGGGUUAUCUUCAACCUAGGACUUUUCUAUUAAAAUAUAAUGAAAAUGGAACCAUUACAGAUGCUGUAGACUGUGCACUUGACCCUC；

等温扩增引物：

T7-CoV-2S-F：GAAATTAATACGACTCACTATAGGgcacacgcctattaatttagtgcg；

T7-CoV-2S-R：Bio-gagggtcaagtgcacagtctaca；

备注：正向引物TAATACGACTCACTATAGG序列为T7启动子序列，扩增产物体外转染RNA使用，反向引物5’端生物素标记富集扩增子使用；

Cas13a靶向引导crRNA序列：

CoV-2S-CrRNA1：

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCAGCACCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG；

CoV-2S-CrRNA2：

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCCGAAAAACCCUGAGGGAGAUCACGCA；

备注：为防止病毒突变脱靶，设计了2条CrRNA导向序列：

探针引物：5’-/56-FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3NH2/-3’；

探针引物与COOH修饰磁珠偶链后形成淬灭的固相FAM-RNA-NH2-COOH-磁珠，该固相磁珠可被激活后的Cas13a-CrRNA从RNA序列的位置切断，释放FAM荧光信号。

具体流程为：

第一部分：核酸提取

裂解

EP管中加入待测样本DEPC水补齐至200ul，加入50ul蛋白酶K，室温等待10min，具体的最佳条件为50℃反应20min；具体的蛋白酶K为100ug/ml蛋白酶K。、

富集

加入400ul裂解液，加入50ul Magbeads磁珠(加之前混匀)，摇匀，室温静置5-10min。

具体的，裂解液1000ul配方为：50％PEG 8000为100ul、0.5M的EDTA为20ul、1％的TX 100为10ul、1M的Nacl为5ul、1M的Kcl为5ulDEPC水为850ul。

洗涤

将上一步样品放置磁力架吸附磁珠，移除上清，加入600ul PW，重悬磁珠，静置1-2min后移除反应液。具体的，清洗液PW1000ul的为配方：1M的Tris-Hcl20ul、0.5M的EDTA为10ul、异丙醇为70ul、DEPC水为100ul、无水乙醇为800ul。

干燥

使用吸水滤纸移除残余液体，具体的滤纸可以DEPC处理，室温静置待磁珠表面完全干燥，必须完全干燥，否则影响后续反应，此过程大致需要10-30min，请耐心等待。

洗脱

使用等温扩增液重悬磁珠，静置5min后磁力架吸附磁珠，37℃-40℃反应10-30min。

第二部分：扩增子富集及加入磁珠-COOH-NH2-RNA-FAM

加入500ul含扩增富集磁珠(5ug)和磁珠-COOH-NH2-RNA-FAM(5ug)的扩增子富集液，混匀后孵育37分钟后吸附磁珠，去除上清，加入50ul的cas13a反应体系，反应10-30min后观察荧光。具体的，5ug扩增富集磁珠与扩增子富集液混合，5ug磁珠-COOH-NH2-RNA-FAM与扩增子富集液混合，再将两者混合。

具体的，说明书附图1为凝胶电泳检测结果，泳道1为对照扩增组，泳道2-5阴性组，泳道6为阳性质粒对照组，泳道7-10为阳性假病毒组(依次10倍比稀释)；

说明书附图2为荧光显像检测结果，等温扩增产物T7体外转录后按照实验说明书步骤加入磁珠及扩增扩增产物，1号样本为Rnase对照组，2好样本为缺少crRNA对照组，3号样本为完全组分实验组，4号样本为缺少cas13a酶对照组。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。