Nudt21基因在制备治疗肺癌药物中的应用

文档序号：1308679 发布日期：2020-08-11 浏览：5次 >En<

阅读说明：本技术 Nudt21基因在制备治疗肺癌药物中的应用 (Application of NUDT21 gene in preparation of lung cancer treatment drug ) 是由王立生肖凤君高川成徐芹芹吴祖泽于 2020-03-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供了NUDT21基因在制备治疗肺癌药物中的应用,涉及肺癌诊断和食疗技术领域,所述NUDT21基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过对临床小细胞肺癌标本进行免疫组织化学染色分析和体内体外实验及TCGA数据集证明NUDT21与肺癌密切相关,沉默NUDT21明显促进了肿瘤的生长,高表达NUDT21降低了肿瘤的生长进程,同时NUDT21影响肺癌患者的生存期。因此可将NUDT21作为肺癌的一个基因靶点,进一步提高对于肺癌尤其是小细胞肺癌的诊断和治疗效果,从而促进对肺癌的精准医疗。(The invention provides an application of an NUDT21 gene in preparing a medicine for treating lung cancer, and relates to the technical field of lung cancer diagnosis and dietary therapy, wherein the nucleotide sequence of the NUDT21 gene is shown as SEQ ID No. 1. Immunohistochemical staining analysis, in vivo and in vitro experiments and TCGA data sets of clinical small cell lung cancer specimens prove that the NUDT21 is closely related to lung cancer, silent NUDT21 obviously promotes the growth of tumors, high-expression NUDT21 reduces the growth process of the tumors, and the NUDT21 influences the survival time of lung cancer patients. Therefore, the NUDT21 can be used as a gene target of lung cancer, the diagnosis and treatment effects of the lung cancer, especially small cell lung cancer, are further improved, and accurate treatment of the lung cancer is promoted.)

NUDT21基因在制备治疗肺癌药物中的应用

技术领域

本发明属于肺癌诊断和治疗技术领域，具体涉及NUDT21基因在制备治疗肺癌药物中的应用。

背景技术

目前，肺癌的诊断与治疗尚面临着一些困难问题，尤其小细胞肺癌，小细胞肺癌(SCLC)与常见的腺癌相比，占全球肺癌疾病比例较小。但是每年报告统计的病例依然在40万例以上，并且这其中的大量人群治疗选择稀缺且疗效欠佳，最常用的化疗或放疗也存在一定局限性。

在肺癌原有的诊断与治疗中常借助放化疗，也有借助基因疗法进行治疗，但均存在许多不良反应和并发症，且不能对肺癌进行全面的诊断。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供NUDT21基因在制备治疗肺癌药物中的应用，将所述NUDT21基因作为肺癌的一个基因靶点，可以进一步提高其治疗效果，从而促进对肺癌的精准医疗。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了NUDT21基因在制备治疗肺癌药物中的应用，所述NUDT21基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，在低氧微环境中所述NUDT21通过调控GLS1可变剪接影响肺癌细胞A549的生长，所述肺癌包括小细胞肺癌。

本发明提供了NUDT21基因在制备治疗肺癌药物中的应用，所述NUDT21基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过对临床小细胞肺癌标本进行免疫组织化学染色分析，发现小细胞肺癌组织中NUDT21对比于边缘正常组织表达下调，并且TCGA数据集表明了NUDT21与肺癌患者生存期的相关性；在低氧微环境中NUDT21的表达受到调控，并且表现为HIF-1α介导NUDT21的表达；进一步在低氧微环境的实验表明缺氧改变NUDT21表达的变化导致糖代谢(图3中A、B)及谷氨酰胺代谢(图3中C)受到影响，谷氨酰胺酶的同种型(图3中D、E)也随之发生转变。通过体内体外实验证明NUDT21与肺癌密切相关，在无放化疗情况下，沉默NUDT21显著促进A549增殖并抑制凋亡，同时促进克隆形成。进一步分别将沉默NUDT21与高表达NUDT21的A549注入裸鼠体内，发现沉默NUDT21明显促进了肿瘤的生长，高表达NUDT21降低了肿瘤的生长进程。因此可将NUDT21作为肺癌的一个基因靶点，进一步提高对于肺癌尤其是小细胞肺癌的治疗效果，从而促进对肺癌的精准医疗。

附图说明

图1为临床小细胞肺癌标本进行免疫组织化学染色分析图及肺癌患者生存期与NUDT21的相关性，其中：A表示组织中NUDT21染色的代表性图像；-为样本染色为阴性，+为弱染色的样品，++为中等染色样品，+++为染色强烈的样品；B表示15对样本的H-score分数统计；C表示Kaplan-Meier分析，NUDT21的表达与肺癌患者的生存率相关(中位生存率从46.881678009个月增加到78.61个月；NUDT21中无改变者：n＝2288，NUDT21中有改变者：n＝15)；图中*与对照组相比，p<0.05；

图2为低氧微环境中NUDT21的表达情况图，其中：A表示A549细胞在1％氧气条件下的不同时间内NUDT21的表达；B表示1％O₂培养A549细胞，western blot检测HIFs和NUDT21的表达；C表示A549在不同浓度DFO中培养2h对HIFs和NUDT21蛋白印迹表达的影响；D表示沉默HIF-1α对NUDT21表达的影响；E表示沉默HIF-2α对NUDT21表达的影响；图中****表示与之相比，p<0.0001；

图3为氧微环境中NUDT21的表达变情况对谷氨酰胺代谢的影响图，其中：A表示A549细胞在缺氧条件下培养24h和48h，用Q-PCR检测Gult1和3的表达；B表示用Q-PCR法检测NUDT21沉默后A549细胞Gult1和Gult3的表达；C表示A549细胞在缺氧条件下培养24小时和48小时，用Q-PCR法检测GLS1的表达；D表示在缺氧条件下，GAC和KGA的两个剪接变异体的GLS1在A549细胞中的表达；E表示在缺氧条件下，将培养的A549细胞培养24小时和48小时，westernblot检测NUDT21、GLS1及GAC、KGA亚型的表达；其中*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；

图4为NUDT21与肺癌关系图，其中：A表示用NUDT21沉默A549细胞，用Q-PCR和westernblot检测结果；B表示沉默NUDT21对A549细胞增殖的影响；C表示NUDT21对A549细胞凋亡的抑制作用；D表示沉默NUDT21后A549细胞克隆形成；E表示A549细胞在正常条件下和缺氧条件下培养15h，缺氧条件下A549细胞的迁移能力更强，图中*与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图5为异种移植模型实验结果图，其中：A表示Q-PCR检测A549细胞中NUDT21的表达；B表示分别于注射A549细胞后1天、7天、14天和21天监测肿瘤生长；C表示实验期间小鼠体重的变化；D表示实验结束后，每组切除肿瘤后的重量变化；E表示各组肿瘤体积比较；F表示免疫组化检测各组NUDT21(70x)的表达；图中***p<0.001；

图6为NUDT21基因的表达蛋白结构图，其中(左)为NUDT21(CPSF5)结构，(右)为其组成的CFIm结构。

具体实施方式

本发明提供了NUDT21基因在制备治疗肺癌药物中的应用，所述NUDT21基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述肺癌优选包括小细胞肺癌。本发明所述NUDT21(又称CPSF5或CFIm25)作为3'UTR缩短的主要调节剂，是高度保守的CFIM组分，参与了真核细胞前mRNA聚集的早期阶段，同时NUDT21受低氧诱导因子HIF-1a介导(如图2所示)并可以通过调节可变剪接与选择性聚腺苷酸化来调控肺癌的发生发展，同时参与肺癌细胞的生存代谢。

本发明所述NUDT21基因为mRNA前体3’端修饰因子，使NUDT水解酶蛋白超家族的一员，具有NUDIX水解酶结构域，其作用类似于真正的RNA结合蛋白。本发明所述NUDT21基因的表达蛋白NUDT21(图6)能够结合特定的RNA序列，但由于缺少了四个必需的谷氨酸残基中的两个，导致催化功能和金属结合确实，因此不能进行RNA切割。

在本发明中，低氧环境条件下，小细胞肺癌组织中NUDT21基因的表达下调。且大部分小细胞肺癌组织样本中NUDT21基因的免疫组化检测H-SCORE评分为阴性，部分H-SCORE评分为弱阳性，少数H-SCORE评分为中度阳性，在小细胞肺癌组织穿刺的边缘正常组织中NUDT21基因的免疫组化检测H-SCORE评分为强阳性。因此在小细胞肺癌组织穿刺的边缘正常组织中NUDT21基因的H-SCORE评分高于小细胞肺癌组织，同时TCGA数据集表明肺癌患者的生存期与NUDT21密切相关。沉默NUDT21基因可能是促进肿瘤生长和肿瘤转移的潜在靶标。

下面结合实施例对本发明提供的NUDT21基因在制备治疗肺癌药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.细胞系和化合物

在补充有10％FCS的RPMI-1640培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)中培养的人肺泡基底上皮细胞A549。将人胚胎肾HEK293T细胞保存在补充有10％FCS的DMEM中(ATCC，Manassas，VA，美国)。去铁胺(DFO)购自Sigma。

2.Real-Time Reverse Transcript Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)

从A549细胞中用Trio Reagent(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取总RNA。具体条件及参数根据说明书中的方案，使用TransScript One-Step gDNARemoval and cDNASynthesis SuperMix(北京全式金，China)说明书，将2μg总RNA逆转为cDNA。通过使用SYBR-Green I作为双链DNA特异性结合染料，在7500检测系统中进行实时PCR。靶基因的mRNA和管家基因GAPDH mRNA在单独的管中定量。该值代表靶基因表达的相对水平，其中A549细胞在1％氧气条件下的不同时间内NUDT21的表达如图2中A所示，分别为：0h 0.017684，4h0.01937，8h 0.02313，24h 0.01462，48h 0.00883；沉默HIF-1α对NUDT21表达的影响如图2中D所示，分别为正常情况下(CON)HIF-1a为0.01154，NUDT21为0.01558，沉默后(Sh-HIF1α)HIF-1a为0.00126，NUDT21为0.03987；沉默HIF-2α对NUDT21表达的影响如图2中E所示，分别为正常情况下HIF2-a为0.01154，NUDT21为0.02590，沉默后HIF2-a为0.00126，NUDT21为0.03065；

A549细胞在缺氧条件下培养24h和48h，用Q-PCR检测Gult1和3的表达量如图3中A所示，其中Gult1在0、24、48h的表达量分别为0.00027、0.00083、0.00070；Gult3在0、24、48h的表达量分别为0.0011、0.0122、0.0108；检测NUDT21沉默后A549细胞Gult1和Gult3的表达量如图3中B所示，其中正常情况下Gult1的表达量为0.00012，Gult3的表达量为0.00051；NUDT21沉默后的表达量分别为0.0009和0.0007；A549细胞在缺氧条件下培养24小时和48小时，用Q-PCR法检测GLS1的表达量如图3中C所示，其中GLS1在0、24、48h的表达量分别为0.01285、0.00836、0.005216；在缺氧条件下，GAC和KGA的两个剪接变异体的GLS1在A549细胞中的表达如图3中D所示，正常情况为68.778，低氧(Hypoxia)为37.9596。

其中，进行RT-PCR所使用的引物如表1所示。

表1 RT-PCR所使用的引物

3.载体Vectors及慢病毒介导的shRNA转导

根据PLKO.1-puro载体(Addgene，Cambridge，MA，USA)的方案构建靶向NUDT21(PLKO.1-shNUDT21)的慢病毒短发夹RNA(shRNA)载体。

将正向寡核苷酸(SEQ ID NO.20):5'CCGGCAGTGTAGAATAAATGTGGTACTCGAGTACCACATTTATTCTACACTGTTTTTG3'；

和反向寡核苷酸(SEQ ID NO.21)：5'CAAAAACAGTGTAGAATAAATGTGGTACTCGAGTACCACATTTATTCTACACTGCCGG3'

在PCR仪中95℃退火4分钟并插入PLKO.1-puro载体中。

对照载体PLKO.1-shScramble也购自addgene(购买网址：www.addgene.org)。

HIF-1α与HIF-2α慢病毒载体由本实验室保存。使用磷酸盐共沉淀试剂盒(Promega，Madison，WI，USA)共转染PLKO.1-shNUDT21或PLKO.1-shScramble，包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G后，在293T细胞中产生慢病毒，收集含有病毒颗粒的上清液，将病毒纯化并通过PEG浓缩，然后用HT1080细胞测定病毒滴度。用MOI为10的慢病毒转导A549细胞并使用流式细胞术通过GFP+细胞测定转导效率。

结果如图4中A和图5中A所示(图4A：干涉NUDT21慢病毒转染A549细胞后检测干涉结果，图5A：干涉NUDT21及高表达NUDT21慢病毒转染A549细胞后检测干涉及高表达结果)。

4.慢病毒感染A549细胞后的生物学分析

4.1.细胞增殖实验

在96孔板中铺入5000个/孔密度的A549细胞，分别在24h、48h、72h、96h后加入10μL/孔CCK8，等待3h后测定A549细胞增殖情况(表2)，结果如图4中B所示，A549细胞干涉NUDT21后增殖能力更强。

表2 A549细胞增殖情况

4.2.细胞凋亡实验

采用AnnexinV-APC染色测定细胞凋亡。将指数生长的A549细胞以2.0×105个细胞/孔的密度接种到6孔板中。细胞贴壁后，以10倍感染复数(MOI)用PLKO.1-shNUDT21或PLKO.1-shScramble感染细胞。48h后，收集细胞，用APC缀合的膜联蛋白-V和PI(SungeneBiotech Co.，Ltd.，Tianjin，China)标记，并在FACSCalibur(BD Bioscience，San Jose，CA，USA)上通过流式细胞术分析(结果如表3所示)，结果如图4中C所示，A549细胞干涉NUDT21后抑制凋亡。

表3细胞凋亡实验结果

4.3.细胞克隆形成实验

用PLKO.1-shNUDT21或PLKO.1-shScramble转导A549细胞。在24孔板中每孔加入500个细胞，放于37℃和5％CO₂的潮湿培养箱中孵育一周后，使用倒置显微镜计数形成的细胞集落数(CON平均为33.7，Sh-NUDT21平均为63)，结果如图4中D所示，A549细胞干涉NUDT21促进克隆形成。

5.Western-Blotting

使用的抗体是兔抗人NUDT21单克隆抗体(Abcam，Cambridge，MA，USA)，兔抗人HIF-1α、HIF-2α单克隆抗体(Cell Signaling Technology，CST，Danvers，MA，USA)，兔抗人GLS1单克隆抗体(Abcam)。从A549细胞制备各条件下的蛋白质提取物。

将蛋白质在12％SDS-PAGE凝胶上分离并转移到硝酸纤维素膜上。然后将膜用5％脱脂牛奶在PBS中封闭2h，用初级抗体标记，再用辣根过氧化物酶偶联的二级抗体(中山金桥生物技术，中国北京)进行标记。最后使用化学发光液(Pirece Biotechnology，IL，USA)进行抗体的检测。与相对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(Cell Signaling Technology，CST)标准化表达水平，结果如图2中BCDE、图3中E及图4中A所示。

6.Transwell assay

将5.0×10⁴的A549细胞加入24孔板，分别在21％O₂、37℃、5％CO₂和1％O₂、37℃、5％CO₂培养箱孵育15h后，通过transwell检测处理的A549细胞的迁移能力。

通过将插入物的底部合并到下部隔室中的培养基中，将transwell插入物添加到孔中。然后，将细胞接种到transwell插入物中。孵育15h后，将迁移的细胞固定，染色并计数(CON(对照组)分别为52、47、59，Hypoxia(低氧实验组)分别为83、95、91)，结果如图4中E所示，低氧环境中A549迁移能力更强。

7.免疫组织化学染色及获得NUDT21与生存相关的数据库信息

将小细胞肺癌肿瘤穿刺及边缘组织用石蜡包埋固定做成切片，进一步用抗体标记检测切片的表达水平(该实验符合卫生部《涉及人的生物医学研究伦理审查办法(试行)》及赫尔辛基宣言关于生物人体试验的相关规定，经青海省人民医院医学伦理委员会同意并开展研究)。

组织切片扫描仪型号Pannoramic MIDI，厂家：3D HISTECH.将组织切片上机后切片会在扫描仪的镜头下逐步移动，边移动边成像进而将组织切片上所有的组织信息都扫描成像，成像后用Pannoramic viewer软件打开并可以1-400倍任意倍数放大后进行观察。Quant center是与Pannoramic viewer配套的分析软件，扫描完成后进入Quant center中的densito quant软件自动识别并设置组织切片上所有的深棕色为强阳性，棕黄色为中度阳性，浅黄色为弱阳性，蓝色细胞核为阴性。进而对每个组织进行识别分析出强阳性，中度阳性，弱阳性及阴性的面积(单位：像素)，阳性的百分比，及最后进行H-score的评分即histochemistry score(组织化学评分)的缩写，它是处理免疫组化结果的一种组织学评分方法，将每张切片内阳性的细胞数量及其染色强度转化为相应的数值，达到对组织染色半定量的目的。

H-SCORE＝∑(PI×I)＝(percentage of cells of weak intensity×1)+(percentage of cells ofmoderate intensity×2)+percentage of cells of strongintensity×3),式中pi表示阳性细胞数量占切片中所有细胞数量的百分数；i代表着色强度，结果如图1中A和B所示，NUDT21在SCLC样本中低表达。

癌症基因组图谱(TCGA)NUDT21和肺癌患者生存期信息从cbioportal数据库下载(http://www.cbioportal.org/)。数据集包括肺癌患者样本的数量，并提供临床生存信息和微阵列数据。kaplan-meier图用于显示NUDT21表达变化对患者生存的影响，结果如图1中C所示，患者中位生存率从46.881678009个月增加到78.61个月。

8.异种移植模型

为建立小鼠肿瘤模型，北京军事医学研究院辐射医学研究所已通过实验动物伦理审查并编号(审查编号：IACUC-AMMS-13-2017-027)。将小鼠随机分为4组(每组n＝6)，并且将沉默NUDT21(Sh-NUDT21)、高表达NUDT21(H-NUDT21)及分别的对照组(Sh-CON、H-CON)肺癌A549细胞(图5中A)接种到6周龄BALB/c-nu小鼠右腹部皮下，每只小鼠注射2×10⁶细胞悬浮于100μL无菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。通过使用测径器在不同实验时间点测量肿瘤宽度(W)和长度(L)来监测肿瘤生长(图5中B，干涉NUDT21生长更快)。使用公式计算肿瘤体积(V)：V＝0.52(椭圆体)×L×W²(图5中E)。同时用电子称量仪在不同实验时间点称量小鼠体重监测体重变化(图5中C)。在实验结束时，通过安乐死方式处死所有小鼠，切除肿瘤，称重，干涉NUDT21组重量大于其余组(图5中D)并保存用于进一步免疫组织化学分析检测对应组肿瘤中NUDT21的表达，检测结果与转导干涉或高表达NUDT21慢病毒后一致(图5中F)。

其中小鼠体重变化如表4所示，

表4小鼠体重变化

小鼠肿瘤生长过程如表5所示，

表5小鼠肿瘤生长过程

小鼠肿瘤体重如表6所示，

表6小鼠肿瘤体重

9、NUDT21基因的表达蛋白结构图谱

NUDT21(CPSF5)结构(图6【左】)及NUDT21所组成的CFI m结构(图6【右】)信息通过National centerfor biotechnology information数据库获取(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/structure)；其中包括了NUDT21及CFI m的详细结构。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

青海省人民医院

<120> NUDT21基因在制备治疗肺癌药物中的应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 813

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gttcgttgca acaaattgat gagcaatgct tttttataat gccaactttg tacaaaaaag 60

ttggcatgtc tgtggtaccg cccaatcgct cgcagaccgg ctggccccgg ggggtcactc 120

agttcggcaa caagtacatc cagcagacga agcccctcac cctggagcgc accatcaacc 180

tgtaccctct taccaattat acttttggta caaaagagcc cctctacgag aaggacagct 240

ctgttgcagc cagatttcag cgcatgaggg aagaatttga taaaattgga atgaggagga 300

ctgtagaagg ggttctgatt gtacatgagc accggctacc ccatgtgtta ctgctgcagc 360

tgggaacaac tttcttcaaa ctacctggtg gtgaacttaa cccaggagaa gatgaagttg 420

aaggactaaa acgcttaatg acagagatac tgggtcgtca ggatggagtt ttgcaagact 480

gggtcattga cgattgcatt ggtaactggt ggagaccaaa ttttgaacct cctcagtatc 540

catatattcc tgcacatatt acaaagccta aggaacataa gaagttgttt ctggttcagc 600

ttcaagaaaa agccttgttt gcagtcccta aaaattacaa gctggtagct gcaccattgt 660

ttgaattgta tgacaatgca ccaggatatg gacccatcat ttctagtctc cctcagctgt 720

tgagcaggtt caattttatt tacaaatgcc caactttctt gtacaaagtt ggcattataa 780

gaaagcattg cttatcaatt tgttgcaacg aac 813

<210> 2

<211> 21

<212> DNA