阅读说明：本技术 miR-1246作为诊断和治疗急性髓系白血病标志物的应用 (Application of miR-1246 as marker for diagnosing and treating acute myeloid leukemia ) 是由 李丽丽 刘佳利 黄娅 于 2020-04-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于诊断和治疗急性髓系白血病的miRNA标志物,具体所述miRNA为miR-1246。本发明公开了miR-1246在制备诊断急性髓系白血病的产品以及治疗急性髓系白血病的药物组合物中的应用。本发明同时公开了一种诊断急性髓系白血病的试剂盒以及治疗急性髓系白血病的药物组合物。本发明的试剂盒能够作为急性髓系白血病诊断的手段之一。本发明的药物组合物对急性髓系白血病有较好的抑制作用,在急性髓系白血病治疗中具有重要的参考和现实意义。(The invention discloses a miRNA marker for diagnosing and treating acute myelogenous leukemia, and particularly relates to miRNA miR-1246. The invention discloses application of miR-1246in preparation of a product for diagnosing acute myeloid leukemia and a pharmaceutical composition for treating acute myeloid leukemia. The invention also discloses a kit for diagnosing acute myeloid leukemia and a pharmaceutical composition for treating acute myeloid leukemia. The kit of the present invention can be used as one of the means for diagnosing acute myeloid leukemia. The pharmaceutical composition has a good inhibition effect on acute myeloid leukemia, and has important reference and practical significance in the treatment of acute myeloid leukemia.)

miR-1246作为诊断和治疗急性髓系白血病标志物的应用

技术领域

本发明涉及一种与急性髓系白血病相关的miRNA及其在急性髓系白血病中应用，所述的 miRNA为miR-1246。属于生物医药领域，具体属于分子生物学技术领域。

背景技术

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是由骨髓中未成熟髓系造血细胞引起的恶性肿瘤。这是一种高度异质性的疾病，患者人群多为老年患者，且死亡率很高。急性髓系白血病也是一种侵袭性血液肿瘤，具有多种基因型、表型、表观遗传特征和对抗白血病干预的净反应，对细胞毒性治疗具有耐药性。其特点是复发率高，这也急性髓系白血病治疗失败最主要的原因。尽管急性髓系白血病具有异质性，但它表现出避免程序性细胞死亡和抵抗细胞毒性刺激的共同特征。再生和静止的白血病干细胞(he self-renewableandquiescent leukemia stem cells，LSCs)，是急性髓系白血病细胞的一个罕见群体，也是急性髓系白血病细胞毒抗性的主要原因。为了根除LSCs从而控制急性髓系白血病，异基因造血细胞移植已经发展了几十年，并成功地用于急性髓系白血病的治疗。此外，一些新的免疫治疗方法，包括免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体T细胞和双特异性抗体治疗等，也逐步在当前的急性髓系白血病治疗中得到越来越多的使用。虽然近期一些治疗急性髓系白血病的新方法已被提出，但除了急性早幼粒细胞白血病，半数的急性髓细胞白血病是迄今为止无法治愈的。目前，与急性髓系白血病的发展和进展相关的详细和精确的机制仍不清楚，这妨碍了科学家们建立更好的策略来消除LSCs和治愈急性髓系白血病。

成人骨髓是造血的主要部位，为急性髓系白血病等恶性造血疾病的发生发展提供了研究方向。在生理状态下，骨髓微环境与造血干细胞之间的相互作用维持着干细胞腔室增殖、分化和稳态的微妙平衡。但在恶性情况下，急性髓系白血病细胞浸润骨髓，干扰正常造血干细胞-微环境稳态。最近的一些研究发现表明，将急性髓系白血病外泌体来源的microRNAs (miRNAs)传递到良性造血干细胞和祖细胞中可能导致细胞造血功能的丧失。miRNAs是一种小的非编码RNA，长度为20个核苷酸左右，与细胞增殖、分化、凋亡和癌变等多种生物学和病理过程息息相关；miRNAs参与了肿瘤发展的各个阶段，表明miRNA的异常表达在肿瘤发展过程中对已知癌基因或抑癌基因的表达起着重要的调节作用。此外，也有研究发现，恶性造血干细胞脱落外泌体，形成细胞内促衰老信号，增强耐药性。总的来说，这些成果为研究急性髓系白血病及其分泌的外泌体相关的潜在miRNAs的存在提供了新的视角，也为急性髓系白血病的诊断和/或治疗提供了新的研究思路。

外泌体(exosomes)是一组由脂质双分子层包裹的小颗粒，其长度为30-140nm，由内源性来源，人体内多种体细胞细胞均可分泌外泌体。当外泌体由宿主细胞被分泌到受体细胞中时，受体细胞的生物学活性可以通过外泌体携带的小分子物质来调节。外泌体主要通过以下方式来介导细胞间通讯：一是通过与靶细胞膜蛋白结合，外泌体膜蛋白可以激活靶细胞内的信号通路；二是在细胞外基质中，被蛋白酶剪切后的外泌体膜蛋白可以作为配体与细胞膜上的受体结合，从而激活细胞内的信号通路；三是直接与靶细胞膜融合，非选择性的释放其所携带的信使RNA(mRNA)、蛋白质和大分子RNA，并在细胞间传递这些分子( C1.Exosomal RNA as biomarkers and the therapeutic potential of exosomevectors.Expert Opin Biol Ther.2012Jun；12Suppl 1:S189-97.)。调控型非编码RNAs(例如miRNAs、长链非编码 RNA、环状RNA等)在基因翻译和转录以及炎症、个体发生和血管生成等生理和病理过程起到重要作用，白血病细胞的增殖、分化和凋亡也会受到其影响，其中一些可能被用作预测预后的生物标志物。miRNAs在急性髓系白血病细胞增殖、分化和存活等几乎所有方面都发挥着重要作用。例如，高生物活性的miR-126促进LSCs的白血病形成，促进化疗耐药；也有研究显示，miR-34c-5p可以加速LSCs的衰老，从而为治疗急性髓系白血病提供了一种新的思路。因此，筛选和进一步研究含有特定miRNAs的外泌体可能是急性髓系白血病诊断和/ 或治疗的一个研究和发展方向。

外泌体分泌的miR-1246作为miRNA中的一员，能够增强了肝癌干细胞在自我更新、耐药、发生肿瘤和转移方面的侵袭性。且miR-1246表达下调后，肝癌细胞的迁移和侵袭会受到抑制。另外，miR-1246在前列腺癌细胞中的过表达明显抑制了移植瘤在体内的生长，增加了细胞凋亡，降低了前列腺癌细胞体外增殖、侵袭和迁移的能力；因此外泌体分泌的miR-1246是一种很有前途的前列腺癌生物标志物，具有预测疾病侵袭性的诊断潜力。因此，我们推测在急性髓系白血病中，外泌体分泌的miR-1246也有可能是一种很有前途的诊断和/或治疗急性髓系白血病生物标志物。本发明通过体内和体外实验从分子机制和应用方面证实了这一推测并以此为基础提出了一个针对急性髓系白血病的诊断试剂盒和治疗的药物组合。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种与急性髓系白血病发生发展相关的的miRNA标志物，所述标志物可以作为急性髓系白血病的特异性诊断标志物，应用于急性髓系白血病的发现；本发明的目的之二在于提供miRNA标志物在筛选治疗急性髓系白血病的候选药物中的应用。

为了研究与急性髓系白血病相关的miRNA在急性髓系白血病中的作用，从而筛选合适的miRNA。我们通过生物信息学技术及现代分子生物学技术从AML细胞外泌体中找到了可以作为急性髓系白血病标志物的miR-1246。

因此，本发明一方面提供了一种miRNA，和检测该miRNA表达水平的试剂在制备诊断急性髓系白血病的产品中的应用，其实，所述的miRNA为miR-1246。

优先地，本发明所述试剂为特异性扩增miR-1246的引物。

再一方面，本发明在miR-1246应用的基础上，提供了一种诊断急性髓系白血病的试剂盒，所述试剂盒包括检测miR-1246表达水平的试剂。

优选地，本发明所述试剂为特异性扩增miR-1246的引物。

优选地，本发明所述特异性扩增miR-1246的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2 所示。

再一方面，本发明根据miR-1246基因的用途，提供了一种用于制备治疗急性髓系白血病的药物组合物。

优选地，本发明所述药物组合物包括miR-1246基因的抑制剂。

再一方面，本发明还提供了一种基于miR-1246基因药物组合物，所述药物组合物为 miR-1246基因的抑制剂，所述抑制剂为miR-1246的si-miR-1246。

优选地，本发明所述的miR-1246基因的抑制剂为含有si-miR-1246的质粒转染AML细胞后获取的外泌体。

优先地，本发明所述的含有si-miR-1246的质粒转染AML细胞时的使用浓度为75nM。

优选地，本发明所述si-miR-1246的序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明通过生物信息学和现有的分子生物学的技术手段，从AML细胞外泌体中筛选到用于急性髓系白血病诊断和治疗的标志物miR-1246(miR-1246在AML外泌体中高表达)。在此基础上，本发明提供了检测miR-1246的试剂在制备诊断急性髓系白血病的产品中的应用。该应用包括诊断急性髓系白血病的试剂盒以及制备治疗急性髓系白血病的药物组合物。本发明的试剂盒能够作为急性髓系白血病诊断的手段之一。本发明的药物组合物对急性髓系白血病有较好的抑制作用，在急性髓系白血病治疗中具有重要的参考和现实意义。

附图说明

其中*表示P<0.05，具有显著性差异。

图1miR-1246在AML细胞来源外泌体中高表达。

其中图1A.芯片GSE55025的差异基因表达热图；图1B.芯片GSE55025的差异基因火山图；

图1C.芯片GSE55025中miR-1246的表达箱线图，左箱为正常细胞表达，右箱为外泌体表达；

图1D.CD34-PE和CD38-FITC抗体标记AML细胞系，流式细胞术分析CD34+CD38-(即LSCs)细胞数；图1E.qRT-PCR检测AML细胞系(KG1a和Molm-14)和LSCs中miR-1246 的表达情况；图1F.透射电镜(TEM)观察AML细胞来源外泌体形态；图1G.纳米颗粒追踪分析检测外泌体浓度和粒径大小；图1H.Western blotting检测外泌体特异标志蛋白CD63 和TSG101表达；图1I.qRT-PCR检测miR-1246在AML细胞系(KG1a和Molm-14)及其对应外泌体中的表达情况。

图2AML细胞外泌体靶向LSCs促进其存活。

其中图2A.荧光显微镜下观察LSCs吸收CFSE标记AML细胞外泌体(CFSE:green,DAPI: blue，×400)；图2B.MTS法检测AML细胞外泌体处理后LSCs细胞活力的变化；图2C.集落形成实验检测AML细胞外泌体对LSCs集落形成数的影响；图2D.流式细胞术检测AML 细胞外泌体对LSCs凋亡的影响；图2E.分化实验检测AML细胞外泌体处理后LSCs的分化能力变化。

图3AML细胞外泌体miR-1246能够靶向白血病干细胞(LSCs)促进其存活。

其中图3A.AML细胞经沉默或过表达miR-1246后提取外泌体，将外泌体与LSCs共培养， qRT-PCR检测各组LSCs中miR-1246的表达情况；图3B.MTS检测各组LSCs的增殖活力；

图3C.集落形成实验检测LSCs的细胞集落形成能力；图3D.流式细胞术检测LSCs的凋亡情况；图3E.分化实验检测LSCs的分化能力。

图4沉默miR-1246抑制AML干细胞移植瘤生长。

其中图4A、图4B.经皮下注射KG1a干细胞(KG1a-SCs)建立裸鼠皮下移植瘤模型，定点皮下注射溶媒对照和Exo-miR-1246inhibitor后实时观察各组小鼠成瘤体积和重量；图4C.提取各组小鼠肿瘤组织RNA，qRT-PCR检测各组肿瘤组织中miR-1246的表达情况。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中所涉及各种原料，如无特别说明，均为市售。

本发明经过广泛而深入的研究，通过生物信息学技术和分子生物学技术，检测AML细胞外泌体中miRNA的表达水平，发现其中具有明显表达差异的miRNA片段，探讨其与急性髓系白血病的发生之间的关系，从而为急性髓系白血病的检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明发现AML细胞外泌体中miR-1246显著性上调，并且通过大量实验证明，采用该miRNA具有较高的阳性检出率；进一步的细胞实验证明，改变AML细胞外泌体的表达水平可以影响LSCs的生长，提示miR-1246可以作为药物靶标用于急性髓系白血病的精准治疗。

“生物标志物”与“标志物”可以等同替代，指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“生物标志物”)，例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因，以及编码和非编码DNA和RNA)。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。在本发明中，术语“生物标志物”指代与急性髓系白血病相关联的基因、基因的片段或变体。

在本发明的实施例中，一种代表性的人miR-1246基因的核苷酸序列SEQ ID NO.4所示。本发明的miR-1246核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

在本发明中，可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。本发明的miRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于 RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板 DNA进行测序。

本发明所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增 (NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用 RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片 (原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测miR-1246的表达。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含与一种或多种生物标志物的mRNA特异性结合的一种或多种探针。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含洗涤溶液。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、mRNA分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。举例说明，本发明提供的试剂盒是基于qRT-PCR实验来源的，本发明不仅提供了一种检测miR-1246的引物，还提供了具体的检测方法，在此基础上，本发明可以提炼出一种用于检测miR-1246表达水平的qRT-PCR检测试剂盒。

这样一种试剂盒可以采用例如试纸条、膜、芯片、盘、测试条、滤器、微球、载片、多孔板或光纤。所述试剂盒的固相支持物可以是例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球、多糖、毛细管、胶片、板或载片。所述生物样品可以是例如细胞培养物、细胞系、组织、口腔组织、胃肠组织、器官、细胞器、生物液体、血液样品、尿液样品或皮肤抑制剂和药物(组合物)。

基于发明人的发现，本发明提供了一种miR-1246的抑制剂，所述抑制剂的性质对本发明来说并不重要，只要它抑制miR-1246基因的功能性表达即可，举例来说，本发明的抑制剂可以是以miR-1246基因为靶序列、且能够抑制miR-1246基因的干扰分子，包括：shRNA(小发夹 RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA微小RNA、反义核酸的构建物。这些抑制剂作为对于下调miR-1246有用的物质，可用于治疗急性髓系白血病。

作为本发明的一种优选方式，所述miR-1246的抑制剂是一种miR-1246特异性的siRNA。如本文所用，所述的抑制剂为含有该siRNA的质粒转染AML细胞后获得的外泌体，从而获得能够靶向LSCs的稳定的药物组合物。在本发明的实施例中，该si-miR-1246在AML细胞中能够特异性的抑制miR-1246的表达，从而获得低表达或不表达miR-1246的AML细胞外泌体，从而获得能够靶向LSCs的稳定的药物组合物，以抑制LSCs的生长，从而达到抑制急性髓系白血病的发生和发展。

本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

本发明的药物组合物包括miR-1246的抑制剂以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。优先地，本发明使用AML细胞外泌体作为药物组合物的最终使用形式(该外泌体是通过含有si-miR1246的质粒转染AML细胞后获得的)，在本发明的实施例中，本发明的药物组合物靶向抑制LSCs的生长，从而达到抑制急性髓系白血病的发生和发展。另外，在本发明的另一实施例中，在裸鼠成瘤模型中，本发明的药物组合物具有良好的抑制急性髓系白血病发生和发展的作用。

当然，本发明的药物组合物还可与其他治疗急性髓系白血病的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实验方法

方法1：细胞培养和分选

人AML细胞系KG1a和Molm-14(ATCC,Manassas,VA)用含10％胎牛血清(FBS)和100U/mL青霉素和链霉素的DMEM培养基进行悬浮培养。由于白血病干细胞(Leukemia stemcells, LSCs)为CD34⁺CD38^-的KG1a细胞，所有KG1a细胞均为CD34⁺，因此LSCs通过CD38-FITC抗体和anti-FITC磁珠间接标记进行富集(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach，德国)。简单地说，细胞悬浮液以125g离心10分钟，用PBS洗涤。然后，细胞沉淀用分离缓冲液(含0.5％BSA的PBS) 悬浮，并与CD38^-FITC抗体孵育30分钟。PBS洗涤后，细胞沉淀在含有抗FITC微球的分离缓冲液中孵育15分钟。经过洗涤后，滤液(CD34⁺CD38^-细胞)使用MidiMACS分离器系统的LD柱收集。在整个分选过程中，将细胞置于4℃，并用流式细胞术进行分析。LSCs损耗后剩余细胞定义为AML细胞，用于共培养研究。

方法2：外泌体的分离、鉴定及标记

通过在4℃以1×10⁶g超速离心16小时(Beckman CoulterAvanti J-30I，USA)使FBS耗尽外泌体。在以下实验中使用除去外泌体的FBS以避免外泌体的影响。AML细胞系(KG1a 和Molm-14)在孵育48-72小时后，收获培养基并通过超速离心分离外泌体。简而言之，将细胞培养基依次在300g下离心10分钟，2,000g下15分钟和12,000g下30分钟以除去漂浮的细胞和细胞碎片。然后通过0.22μm的过滤器。将上清液在4℃下以1×10⁶g进一步超速离心2小时，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤，并在相同条件下进行第二次超速离心。最后用PBS约100ml重悬沉淀，置于-80℃保存备用或立即使用。

采用透射电镜(TEM)观察外泌体的形态。采用纳米颗粒跟踪分析法(Nanoparticletracking analysis)测定外泌体浓度和大小。将分离的外泌体以1:10稀释，并在NanosightNS300纳米粒子检测仪(Malvern,Westborough,MA,USA)上观察。对于外泌体蛋白质定量，将外泌体颗粒溶解在RIPA缓冲液中，并使用BCA蛋白质分析试剂盒(Thermo FisherScientific,Rockford, IL,USA)进行定量。外泌体蛋白印迹分析采用抗体如下：TSG101(ab125011,1:1000)、CD63 (ab134045,1:1000)、Histone(ab1791,1:1000)。

将外泌体使用CFSE(10μM；Thermo Fisher Scientific)在37℃标记30min。然后将标记的外泌体用PBS清洗后用100,000g离心1h以去除多余的染料。对于外泌体体外跟踪分析，将 CFSE标记的外泌体与LSCs在培养基中共同培养4h。最后用配备CCD的Olympus BX41显微镜(MagnaFire,Olympus)观察。

方法3：细胞的分组与转染

将培养好的AML细胞分为以下几组：i.inhibitor-NC(阴性对照组，转染空载质粒)、ii. miR-1246inhibitor(转染si-miR-1246质粒组，抑制miR-1246的表达)、iii.mimic-NC(阴性对照组，转染空载质粒)、iv.miR-1246mimic(转染miR-1246组，促进miR-1246的表达)。转染前24h将上述细胞接种于DMEM培养基的12孔板中，待细胞汇合度达到70％左右时，用无血清的DMEM培养基重悬后接种于12孔板中，并按照上述分组进行转染。转染后继续在37℃、5％CO₂条件下孵育6～8h，更换完全培养基后继续继续培养24～48h，进行后续实验。将上述各组转染成功的AML细胞用于外泌体分离。使用75nM miR-1246inhibitor或阴性对照、100nM miR-1246mimic或阴性对照，均购买于广州锐博生物技术有限公司。

方法4：细胞生存能力分析(Cell viability assay)

取对数生长期LSCs接种于96孔板(100μL/well)中，培养至对数生长阶段。24h后对细胞进行转染，每组3个复孔。采用MTS细胞增殖与毒性检测试剂盒(BB-4203-3,BestBio)检测LSCs细胞增殖活力，即转染48h后每孔加入10μLMTS溶液，37℃孵育1-4h。利用多功能酶标仪检测490nm处各孔吸光值。同时设置空白孔(培养基和MTS溶液，无细胞)和对照孔(仅有细胞)，每组设置3-5个复孔。细胞活力(％)＝(实验组细胞OD-空白组细胞 OD)/(对照组细胞OD-空白组细胞OD)×100％。实验重复3次。

方法5：细胞分化分析(Differentiation assay)

在分化实验中，LSCs用含10％FBS并加入100ng/mL rhSCF(Recombinant humanstem cell factor，重组人干细胞因子),100ng/mL rhFlt3(ecombinant human solubleFlt3 ligand，重组人 Flt3配体),和100ng/mLrhTPO(Recombinant human plateletsetoid，重组人血小板生成素) 的IMDM培养基，在37℃、5％CO₂条件下培养24h。后用1μg/mL的AML细胞外泌体处理 7d。收集LSCs并用CD19-PE,CD33-APC,CD3-APC,and CD235a-FITC标记30min,然后用流式细胞术(FACS Calibur(BD))检测和分析(Cell Quest software(BD))。

方法6：细胞凋亡分析(Apoptosis analysis)

使用Annexin V和碘化丙啶(Propidium iodide)(Thermo Fischer Scientific)进行细胞凋亡分析。简单来说，收集LSCs并用PBS和结合缓冲液洗涤。然后与5μLAnnexin V避光孵育 15分钟。用PBS和结合缓冲液洗涤后添加5μL碘化丙啶。然后将细胞混合物置于2℃～8℃培养，并使用FACSAria II特殊顺序系统(BD Biosciences)进行流式细胞术分析。

方法7：qRT-PCR analysis

使用miRNeasy or RNeasy kits(Qiagen,Germantown,MD,USA)提取细胞或外泌体中的总 RNA。根据指导说明书通过SuperScript III First-Strand Synthesis kit(Invitrogen)with oligo(dT) Priming反转录为cDNA。然后使用SYBR Green PCR kit(Applied Biosystems)在96孔板和 ABI PRISM 7500实时PCR系统(Bio-tek)进行qRT-PCR反应。PCR条件为95℃ for 10min, 50cycles at 95℃ for 30s,60℃ for 30s,and 72℃for 1min。引物序列如表1所示，所有引物序列交由广州锐博生物技术有限公司合成。使用GAPDH作为内参。采用2^-ΔΔCT法计算相对表达量。对于miRNA定量，使用TaqMan assay kits(Applied Biosystems)进行反转录和qRT-PCR, 以U6 snRNA为内源性对照。

表1 qRT-PCR引物

方法8：Western blotting

严格按照说明书采用高效RIPA裂解液(R0010,Solarbio)提取组织或细胞总蛋白。4℃裂解15min后15000rpm/min离心15min，提取上清液采用BCA试剂盒(20201ES76，翊圣生物科技有限公司，中国)测定每个样品的蛋白浓度。根据不同浓度进行定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后采用湿转方法将蛋白转至PVDF膜上，5％BSA室温下封闭1h。滴加稀释的一抗(兔抗，均购自Cell Signaling Technology)：GAPDH(#5174,1:1000)。4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜5min×3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG(#7074,1:2000)稀释液室温下 1h。TBST洗膜5min×3次，加入显影液，显影。ImageJ 1.48u软件(National InstitutesofHealth) 进行蛋白定量分析，以各蛋白的灰度值与内参GAPDH的灰度比值进行蛋白定量分析。实验重复3次。

方法9：裸鼠移植瘤实验

NOD/SCID/IL2rγ(null)mice(NSG)(6-9week-old)(湖南斯莱克景达)。所有老鼠均皮下注射相应浓度为0.5×10⁵的LSCs细胞。提取经转染miR-1246inhibitor的AML细胞外泌体，定点皮下注射至小鼠，实验分组如下：i.Control(空白对照组，不注射AML细胞外泌体)、ii. Exo-inhibitor-NC(阴性对照组，注射正常AML细胞外泌体，其miR-1246的正常表达)、iii. Exo-miR-1246inhibitor(实验组，注射转染si-miR-1246质粒的AML细胞外泌体，其miR-1246 表达被抑制)。实时测量和记录裸鼠移植瘤体积变化，用V＝A×B²/2(mm³)方程计算肿瘤体积，其中A为最大直径，B为垂直直径。当肿瘤体积达到1,000mm³时,处死小鼠，切除肿瘤并称重.提取肿瘤组织总RNA和蛋白质，检测各组肿瘤组织中miR-1246表达情况。本研究符合动物保护和使用原则，并经实验动物伦理委员会审核通过。

实施例1：miR-1246在AML细胞来源外泌体中高表达

通过分析GSE55025芯片筛选出在AML细胞外泌体中具有表达差异的miRNA，其中有53 个高表达miRNA，45个低表达miRNA，差异miRNA中miR-1246的差异显著性最高，利用R语言绘制出表达热图和火山图(图1A-B)。从箱线图中可以看出miR-1246在AML细胞外泌体中具有显著的高表达(图1C)。推测miR-1246可能与白血病进程相关。因此，我们选择miR-1246作为我们研究的对象。

白血病干细胞(LSCs)在AML发病进程中起着重要作用，能够介导AML的复发和耐药等。而AML细胞外泌体作用于LSCs的研究还较为少见，为了研究AML细胞外泌体是否能够作用LSCs并影响其生物学功能，首先，我们先采用磁珠分选法从AML细胞系(KG1a和 Molm-14)中分选出LSCs。通过检测LSCs在AML细胞系(KG1a和Molm-14)中的比例来确定 LSCs是否成功分选，采用CD34-PE和CD38-FITC抗体对AML细胞系和分选磁珠分离的LSCs (KG1a-SCs和Molm-14-SCs)进行染色，并进行流式分析。如图1D显示，经过微球筛选，95％以上的细胞为CD34⁺CD38^-。利用qRT-PCR检测了AML细胞系(KG1a和Molm-14)和LSCs (KG1a-SCs和Molm-14-SCs)中miR-1246的表达情况，结果发现，与AML细胞系相比，LSCs 中miR-1246的表达显著下调(图1E)。紧接着，进一步验证miR-1246在AML分泌外泌体中的表达情况，将AML细胞系产生外泌体进行分离纯化，然后进行TEM、Nanoparticle tracking analysis和Westernblotting分析鉴定，观察发现，AML细胞系分泌外泌体的大小在50-150nm之间，且表达外泌体特异标志蛋白(图1F-H)。利用qRT-PCR检测外泌体中miR-1246的表达情况，结果发现miR-1246在AML细胞系来源外泌体中的表达显著高于AML细胞系(图1I)，与芯片结果一致。

以上结果表明，miR-1246在AML细胞来源外泌体中高表达，且在LSCs中低表达。

实施例2：AML细胞来源外泌体靶向白血病干细胞(LSCs)促进其存活

通过上述结果，我们猜想AML细胞来源外泌体是否能够进入LSCs中影响LSCs的体外生物学功能和造血分化，最终影响白血病的发展。将CFSE标记的AML细胞来源外泌体与LSCs共培养4h后，荧光显微镜下观察外泌体被LSCs内吞情况，发现外泌体能够被LSCs所内化(图2A)，表明AML细胞外泌体能够靶向LSCs。

为了进一步研究AML细胞外泌体对LSCs体外生物学现象及细胞分化的影响，我们接下来利用MTS法检测AML细胞外泌体处理后LSCs的细胞活力，集落形成实验检测对LSCs集落形成数的影响。结果显示，相比于PBS组，LSCs的增殖活力和细胞集落数均与AML细胞外泌体剂量呈正相关，其中Exo为外泌体(exosome)简称(图2B-C)。流式细胞术检测 AML细胞外泌体对LSCs凋亡情况的影响，结果发现，AML细胞外泌体能够显著抑制LSCs 凋亡(图2D)。分化实验检测AML细胞外泌体处理后LSCs的分化能力变化，结果显示，LSCs 的分化能力与外泌体剂量呈负相关，即CD19,CD3,and CD235a阳性细胞明显降低，CD33阳性细胞明显增加(图2E)。

以上结果表明，AML细胞外泌体促进LSCs的细胞活力和克隆形成、抑制其凋亡及造血分化。

实施例3：AML细胞外泌体miR-1246靶向白血病干细胞(LSCs)促进其存活

其中，Exo-mimic-NC、Exo-miR-1246mimic、Exo-inhibitor-NC、Exo-miR-1246inhibitor 表示AML细胞转染inhibitor-NC(阴性对照组，转染空载质粒)、miR-1246inhibitor(转染 si-miR-1246质粒组，抑制miR-1246的表达)、mimic-NC(阴性对照组，转染空载质粒)、 miR-1246mimic(转染miR-1246组，促进miR-1246的表达)后所获得的相对应的AML细胞外泌体与LSCs共培养后所对应的组别。具体外泌体制备方法详见本发明的方法3所述。

为了验证AML细胞外泌体是否通过传递miR-1246从而影响LSCs的体外生物学特性和造血分化。我们将AML细胞沉默或过表达miR-1246后分离外泌体，将分离外泌体与LSCs共培养后，首先qRT-PCR检测各组LSCs中miR-1246的表达情况，发现，相比于Exo-mimic-NC共培养组，Exo-miR-1246mimic共培养组LSCs中miR-1246表达显著升高；相比于 Exo-inhibitor-NC共培养组，Exo-miR-1246inhibitor共培养组中miR-1246表达显著降低(图3A)。此外，检测各组LSCs的增殖活力、凋亡情况、集落形成数、分化能力。MTS法检测细胞增殖活力、集落形成实验检测细胞集落数、流式细胞术检测细胞凋亡情况以及分化实验检测细胞分化能力，结果显示，相比于Exo-mimic-NC组，Exo-miR-1246mimic组LSCs的细胞增殖活力和集落数显著升高，凋亡和分化能力显著降低；相比于Exo-inhibitor-NC组， Exo-miR-1246inhibitor组LSCs的细胞增殖活力和集落数显著降低，凋亡和分化能力显著增加(图3B-E)。

上述结果表明，AML外泌体中miR-1246能够靶向LSCs从而促进其存活。

实施例4：沉默miR-1246抑制AML干细胞移植瘤生长

为了验证miR-1246是否能够在体内抑制AML干细胞的体内成瘤，我们将KG1a-SCs经皮下注射至裸小鼠建立皮下移植瘤模型，通过定点皮下注射生理盐水对照、Exo-inhibitor-NC 以及Exo-miR-1246inhibitor，实时观察并记录小鼠肿瘤形成情况。结果显示，相比于生理盐水对照组，Exo-inhibitor-NC组肿瘤体积和重量均明显升高，而与Exo-inhibitor-NC组相比， Exo-miR-1246inhibitor组小鼠成瘤的肿瘤体积和重量均明显降低(图4A-B)。提取各组小鼠肿瘤组织RNA和蛋白质，利用qRT-PCR检测肿瘤组织中miR-1246的表达情况，发现，相比于生理盐水对照组，Exo-inhibitor-NC组miR-1246显著升高，而Exo-miR-1246inhibitor组较 Exo-inhibitor-NC组肿瘤组织中miR-1246显著降低(图4C)。

以上结果表明，miR-1246能够抑制AML干细胞体内成瘤。

上述说明并非对发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

<110> 湖南省科域生物医药科技有限公司

<120> miR-1246作为诊断和治疗急性髓系白血病标志物的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> si-miR-1246序列【人工序列(Aruificial Sequence)】

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<212> DNA

<213> miR-1246基因的核苷酸序列

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