用于检测egfr基因突变的引物组及其应用方法

文档序号：1308681 发布日期：2020-08-11 浏览：5次 >En<

阅读说明：本技术 用于检测egfr基因突变的引物组及其应用方法 (Primer group for detecting EGFR gene mutation and application method thereof ) 是由赵方圆佟洪梅智慧芳倪君君于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了用于检测EGFR基因突变的引物组及其应用方法,该引物组包括下述4个引物对中的至少一个：用于检测EGFR基因第18号外显子的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示,下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示；用于检测EGFR基因第19号外显子的上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示,下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示；用于检测EGFR基因第20号外显子的上游引物的序列如SEQ ID NO.5所示,下游引物的序列如SEQ ID NO.6所示；用于检测EGFR基因第21号外显子的上游引物的序列如SEQ ID NO.7所示,下游引物的序列如SEQ ID NO.8所示。使得基因检测通量提高。(The invention provides a primer group for detecting EGFR gene mutation and an application method thereof, wherein the primer group comprises at least one of the following 4 primer pairs: the sequence of an upstream primer for detecting the 18 th exon of the EGFR gene is shown as SEQ ID NO.1, and the sequence of a downstream primer is shown as SEQ ID NO. 2; the sequence of the upstream primer for detecting the 19 th exon of the EGFR gene is shown as SEQ ID NO.3, and the sequence of the downstream primer is shown as SEQ ID NO. 4; the sequence of the upstream primer for detecting the No. 20 exon of the EGFR gene is shown as SEQ ID NO.5, and the sequence of the downstream primer is shown as SEQ ID NO. 6; the sequence of the upstream primer for detecting the 21 st exon of the EGFR gene is shown as SEQ ID NO.7, and the sequence of the downstream primer is shown as SEQ ID NO. 8. So that the gene detection flux is improved.)

用于检测EGFR基因突变的引物组及其应用方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及用于检测EGFR基因突变的引物组及其应用方法。

背景技术

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)在细胞信号传导通路中起重要作用，一旦被激活，可导致肿瘤细胞内酪氨酸蛋白激酶活化和受体自身磷酸化，从而促使细胞增生、分化、转移、血管生成及凋亡抑制。研究表明，在非小细胞型肺癌NSCLC等恶性肿瘤组织中，常因EGFR过表达、基因扩增或EGFR基因的活化突变等，导致EGFR活性异常增高，而EGFR基因突变主要集中在酪氨酸激酶区，即18-2l外显子。

目前，可针对EGFR基因的第18、19、20、21号外显子分别设计PCR检测试验。但是，由于每个PCR反应只能针对EGFR基因的一个外显子进行基因突变检测，故基因突变的检测通量低。

发明内容

本发明实施例提供了用于检测EGFR基因突变的引物组及其应用方法，能够提高EGFR基因突变的检测通量。

为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

多重PCR是在常规PCR基础上发展的一种新型扩增技术，可在一个反应体系中加入两对及以上的引物，同时扩增多个核酸片段。多重PCR在微生物、遗传病、肿瘤药物基因组学有着重要的应用。基于此，针对EGFR基因的第18、19、20、21号外显子来设计特异性扩增的上下游引物。

第一方面，本发明提供了用于检测EGFR基因突变的引物组，包括：下述4个引物对中的至少一个引物对：

用于检测EGFR基因第18号外显子的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示；

用于检测EGFR基因第19号外显子的上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示；

用于检测EGFR基因第20号外显子的上游引物的序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.6所示；

用于检测EGFR基因第21号外显子的上游引物的序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.8所示。

以相对最大程度提高EGFR基因突变的检测通量。

具体地，使用上述引物组进行多重PCR扩增反应时，EGFR基因的第18、19、20、21号外显子中的至少一个外显子可同时在一个扩增体系中进行扩增。通常情况下，利用上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2来扩增EGFR基因的第18号外显子时，相应扩增产物的片段长度为674bp；利用上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4来扩增EGFR基因的第19号外显子时，相应扩增产物的片段长度为424bp；利用上游引物SEQ ID NO.5和下游引物SEQ ID NO.6来扩增EGFR基因的第20号外显子时，相应扩增产物的片段长度为539bp；利用上游引物SEQ ID NO.7和下游引物SEQ ID NO.8来扩增EGFR基因的第21号外显子时，相应扩增产物的片段长度为264bp。

如此，利用上述引物组进行多重PCR扩增后，可产生不同长度的DNA片段，以便于后续可电泳分辨不同长度的片段。进而可对不同片段的DNA进行切胶回收，并进行序列的测定。

本发明还提供了试剂盒，该试剂盒包括SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8中所示的至少一个引物对。

第二方面，基于上述内容，本发明提供了一种第一方面所述的用于检测EGFR基因突变的引物组的应用方法，包括：

设计第一方面所述的引物组；

从待测样本中提取DNA作为扩增模板；

配制包含所述引物组和所述扩增模板的多重聚合酶链式反应PCR反应体系；

对所述多重PCR反应体系进行多重PCR扩增反应，得到PCR产物；

根据所述PCR产物，确定所述待测样本的EGFR基因的第18、19、20、21号外显子的基因突变情况。

在本发明一个实施例中，所述根据所述PCR产物，确定所述待测样本的EGFR基因的第18、19、20、21号外显子的基因突变情况，包括：

电泳检测所述PCR产物，获得所述PCR产物的扩增片段大小；

当所述PCR产物的扩增片段大小正确时，对所述PCR产物进行序列测定，获得所述待测样本的EGFR基因的第18、19、20、21号外显子的基因突变情况。

具体地，可用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分辨不同长度的DNA片段。

需要说明的是，该应用方法为非诊断目的的方法。

在本发明一个实施例中，所述多重PCR反应体系还包括：DNA聚合酶、所述DNA聚合酶对应的PCR缓冲液、4种脱氧核糖核苷三磷酸dNTP的混合物和超纯水；

具体地，DNA聚合酶的用量为0.5-5U，以在保证脱氧核苷酸能够加到扩增模板上的同时，避免DNA聚合酶过量造成浪费。

具体地，每种dNTP的终浓度为50-500μM，所述引物组中每条引物的终浓度为20-300nM。

针对DNA聚合酶的用量来说，0.5-5U是指在0.5U到5U范围内的任一用量值，比如，0.5U、1U、1.5U、2U、2.5U、3U、3.5U、4U、4.5U以及5U。

针对每种dNTP的终浓度来说，50-500μM是指50μM到500μM范围内的任一浓度，比如，50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM以及500μM。

针对每条引物的终浓度来说，20-300nM是指20nM到300nM范围内的任一浓度，比如，20nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM以及300nM。

具体地，所述DNA聚合酶，包括：Taq聚合酶、KOD FX聚合酶、Pfu聚合酶或Phusion聚合酶。PCR缓冲液即为与所选的DNA聚合酶相对应的浓缩缓冲液。其中，PCR缓冲液的浓缩程度可选用2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×或10×。

在本发明一实施例中，所述PCR反应体系的反应条件如表1：

表1

表1中还示出了PCR产物的保存在2～8℃条件下。

针对PCR反应条件中预变性的温度来说，92-96℃是指92℃到96℃范围内的任一温度，比如，92℃、93℃、94℃、95℃以及96℃。

针对PCR反应条件中预变性的时间来说，1～10min是指1min到10min内的任一时间，比如，1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min以及10min。

针对PCR反应条件中变性反应的温度来说，92-98℃是指92℃到98℃范围内的任一温度，比如，92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97以及98℃。

针对PCR反应条件中变性的时间来说，5～20s是指5s到20s范围内的任一时间，比如，5s、8s、10s、14s、17s以及20s。

针对PCR反应条件中退火反应的温度来说，52～68℃是指52℃到68℃范围内的任一温度，比如，52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃以及68℃。

针对PCR反应条件中退火反应的时间来说，10～60s是指10s到60s范围内的任一时间，比如，10s、15s、20s、25s、30s、32s、38s、40s、45s、50s、53s、56s以及60s。

针对PCR反应条件中延伸反应的温度来说，68～72℃是指68℃到72℃范围内的任一温度，比如，68℃、69℃、70℃、71℃以及72℃。

针对PCR反应条件中延伸反应的时间来说，0.5～5min是指0.5min到10min内的任一时间，比如:0.5min、1min、1.5min、2min、2.5min、3min、3.5min、4min、4.5min以及5min。

针对PCR反应条件中终延伸反应的温度来说，68～72℃指68℃到72℃范围内的任一温度，比如，68℃、69℃、70℃、71℃以及72℃。

针对PCR反应条件中终延伸反应的时间来说，0～30min是指0min到30min范围内的任一时间，比如，0min、5min、10min、15min、20min、25min以及30min。

具体地，从待测样本中提取DNA的方式，包括：手工提取或试剂盒提取，再对提取处理的DNA进行处理，得到DNA。

具体地，待测样本为含有人类DNA的血液、细胞、组织或口腔拭子样本。

具体地，SEQ ID NO.1至8所示的任一引物，可在制备用于检测EGFR基因的第18、19、20和21号外显子的热点突变位点的试剂或试剂盒中的应用。

同现有技术相比，本发明至少可以具有以下有益效果：

(1)提高检测通量：普通PCR每个反应只针对一个外显子，而本发明的多重PCR可以同时检测至少2个外显子，通过一次反应可以对EGFR基因的第18、19、20、21号外显子中的至少一个外显子的热点突变位点进行检测。如此，可以同时检测90多例样本，不仅提高了检测效率，也很大程度的节约了成本费用。

(2)降低成本：本发明可以将PCR反应体系由4个体系/程序缩减至1个体系/程序，故减少了DNA聚合酶、dNTP等试剂和耗材的使用量，可大幅度降低检测成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一实施例提供的琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图2是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对一突变位点的部分核苷酸碱基序列；

图3是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对另一突变位点的部分核苷酸碱基序列；

图4是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对又一突变位点的部分核苷酸碱基序列。

具体实施方式

非特殊说明，本发明实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。以下实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

设计并合成引物组

步骤1.1：基于EGFR基因的第18、19、20和21号外显子，设计特异性扩增基因突变位点区域的上下游引物。

对于设计引物，采用Primer Quest和Primer Premier 5.0对引物进行设计及二聚体、茎环错配分析，在包含突变位点的两端设计引物，4对引物的退火温度基本保持一致。

本实施例所提供的引物组覆盖了EGFR基因的第18、19、20和21号外显子的热点突变位点。由于小的序列变化会导致引物扩增效率显著降低、特异性变差，故分别针对不同位点/外显子分别设计多重PCR引物组，并在经过预实验筛选后，综合产物片段长度和位点/外显子包含情况，选取了如下述表2所示的扩增效果最佳的引物组。

表2

步骤1.2：合成步骤1.1中设计好的引物组。

实施例2

从待测样本中提取DNA

步骤2.1：待测样本可以为：用新鲜外周血分离的血清、血浆样本或收集的肿瘤组织样本、用口腔拭子收集口腔脱落细胞或新鲜外周血样本。

步骤2.2：采用凯杰QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(55114)，或，采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)，或，从待测样本中提取DNA(ctDNA)，或，肿瘤DNA，并采用NP80-touch(德国IMPLEN)测定DNA的浓度及纯度，保存DNA。

实施例3

配制PCR反应体系

步骤3.1：以步骤2.2中所得的DNA为扩增模板，并采用步骤1.2中合成的引物组，配制多重PCR反应体系。

本实施例采用东洋纺(TOYOBO)公司KOD FX酶系(货号：KFX-101)中DNA聚合酶及缓冲液为基本原料，在酶系说明书中扩增体系的基础上，通过调整引物浓度、dNTP浓度、缓冲液浓度、酶用量，来配制多重PCR扩增体系，这一反应体系的具体组成如下述表3所示。

可以理解的是，反应体系等比例放大/缩小均在本发明实施例的保护范围内；更换其他DNA聚合酶系，经过适当比例调整也可以达到扩增目的。

表3

试剂成分	体积
		2×PCR buffer for KOD FX	26μl
2mM dNTP	5μl
		Primer Mix(每种引物1.25μM)	5μl
KOD FX(1U/μl)	1μl
		DNA	1μl
超纯水	12μl

其中，各引物等摩尔混合，引物总浓度是10μM；DNA模板量可调整，本实施例中DNA可采用5ng。

步骤3.2：按照下述表4所示的多重PCR反应条件，设置PCR仪器的程序，并对步骤3.1中配制的多重PCR反应体系，进行多重PCR扩增反应，得到PCR产物。

表4

需要说明的是，得到的PCR产物可以在4℃条件下保存待用。

实施例4

电泳检测

步骤4.1：琼脂糖凝胶电泳检测步骤3.2中得到的PCR产物，获得PCR产物片段的大小。

检测结果如图1所示，图1中示出的YL-1911、YL-1912、YL-1913、N-1806、N-THM和“空”字标识，主要用于区分不同样本的PCR产物，图1的最左侧列展示了用于表征长度的标尺条，图1的最右侧列展示了空白对照组的PCR产物的电泳结果，中间各列展示了不同待测样本的PCR产物的电泳结果。

根据图1中各个PCR产物亮带所在位置与左侧标尺条的对比，可以识别出各个PCR产物亮带所对应的是哪一外显子的扩增产物。比如，自下向上的4条亮带，通常是分别对应于EGFR基因的21、19、20、18号外显子的PCR扩增产物。

请参考图1，根据空白组的电泳结果可知，环境因素对待测样本的电泳检测结果无不良影响。根据各个样本的PCR产物的电泳结果可知，存在的4个亮带分别对应于EGFR基因的21、19、20、18号外显子的PCR扩增产物，亮带数量与理论保持一致；4个亮带清晰且间隔明显，不同亮带间无重叠、无拖影等，亮带效果良好。如此，可以说明利用步骤1.1中设计的PCR扩增引物组进行PCR扩增时，仅生成了预期的目标产物，而未生成其他无关产物，引物组设计合理。

实施例5

步骤5.1：在确定步骤4.1获得的PCR产物片段的大小正确后，将步骤3.2中得到的PCR产物送至测序公司进行序列测定，得到.ab1格式的测序结果。

步骤5.2：通过Chromas序列分析软件分析步骤5.1中得到的测序结果，获得EGFR基因的21、19、20、18号外显子的热点突变位点的基因突变情况。

部分测序结果如图2至图4所示。

请参考图2，图2示出了EGFR基因第18号外显子上c.2156G>Ap.Gly719Ala位点及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图2中的框线部分，可知该样本DNA在第2156位碱基处由G突变成A。

请参考图3，图3示出了EGFR基因第19号外显子上c.del2235-2249 p.delGlu746-Ala750位点及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图3中的框线部分，可知该样本DNA在第2235-2249位碱基处并未发生碱基缺失。

请参考图4，图4示出了EGFR基因第21号外显子上c.2582T>Ap.Leu861Gln位点及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图2中的框线部分，可知该样本DNA在第2582位碱基处由T突变成A。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。

最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京和合医学诊断技术股份有限公司

<120> 用于检测EGFR基因突变的引物组及其应用方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA