阅读说明：本技术 一种可检测多种dna糖基化酶活性的方法 (Method for detecting activity of various DNA glycosylases ) 是由 傅新元 闫娟 毛卓 郭剑南 杨盛莲 于 2019-01-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于检测DNA糖基化酶的检测体系,包括：(a)双链DNA探针,所述双链DNA探针包括T1和T2两条链,并且所述T1和T2两条链可形成双链DNA结构；其中,所述T1链包括：至少一个可被待测DNA糖基化酶识别的碱基、荧光基团和分离标签；并且所述荧光基团和分离标签分别位于所述至少一个可被DNA糖基化酶识别的碱基的两端；(b)可使核酸脱碱基位点的糖苷-磷酸键断裂的组分；和(c)带有分离结合标签的固相载体。本发明的检测体系通量高、需要样品量低、信号窗口大、操作简便、成本低、且能够检测多种DNA糖基化酶。(The invention relates to a detection system for detecting DNA glycosylase, which comprises: (a) a double-stranded DNA probe comprising two strands of T1 and T2, and the two strands of T1 and T2 may form a double-stranded DNA structure; wherein the T1 chain includes: at least one basic group, a fluorescent group and a separation label which can be recognized by the DNA glycosylase to be detected; and the fluorophore and the separation tag are located at both ends of the at least one base recognized by the DNA glycosylase, respectively; (b) a component that can cleave a glycoside-phosphate bond at an abasic site of a nucleic acid; and (c) a solid support bearing the separation-binding tag. The detection system has high flux, low sample quantity, large signal window, simple and convenient operation and low cost, and can detect various DNA glycosylases.)

一种可检测多种DNA糖基化酶活性的方法

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种可检测多种DNA糖基化酶活性的方法及其应用。

背景技术

BER(碱基切除修复)通路是修复由氧化、烷基化和脱氨基所引起的内源性DNA碱基损伤的主要途径。其中DNA糖基化酶是BER通路中的重要环节，包括：UDG(尿嘧啶DNA糖基化酶)、TDG(胸腺嘧啶DNA糖基化酶)和OOG1(8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶)等。DNA糖基化酶可以特异性切除受损或错配核苷酸上的N-β-糖苷键，在DNA链上形成脱碱基位点(AP位点)。接着AP核酸内切酶会把受损核苷酸的糖苷-磷酸键切开，并移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNA，并由DNA聚合酶I合成新的片段，最终由DNA连接酶把两者连成新的被修复DNA链，完成DNA损伤修复。

DNA糖基化酶的异常表达与人类疾病密切相关，因此对DNA糖基化酶活性的快速、准确、方便、高通量检测对于临床诊断和靶向抑制剂的研发具有重要意义。现有的传统方法如使用荧光标记底物的凝胶电泳法灵敏度偏低，需要样品量大，通量低，不适合定量分析；用放射同位素标记底物代替荧光标记底物可以提高灵敏度，降低样品量，但同位素标记会引起放射性污染；高效液相色谱法的定性和定量能力较强，需要的样品量不多，但样品的前处理复杂，通量同样不高；酶联免疫吸附法和免疫印迹法需要与蛋白结合的特异性抗体，操作步骤繁琐，不适合大量样品的检测；荧光方法依赖于用荧光团和猝灭剂进行外部标记，用于均相测定，适合高通量，但其信号窗口相对较小，且底物探针设计复杂费用高昂。

因此，本领域迫切需要开发一种通量高、需要样品量低、信号窗口大、操作简便、成本低的能够检测多种DNA糖基化酶的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种通量高、需要样品量低、信号窗口大、操作简便、成本低的能够检测多种DNA糖基化酶的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测DNA糖基化酶的检测体系，所述检测体系包括：

(a)双链DNA探针，所述双链DNA探针包括T1和T2两条链，并且所述T1和T2两条链可形成双链DNA结构；

其中，所述T1链包括：至少一个可被待测DNA糖基化酶识别的碱基、荧光基团和分离标签；

并且所述荧光基团和分离标签分别位于所述至少一个可被DNA糖基化酶识别的碱基的两端；

(b)可使核酸脱碱基位点的糖苷-磷酸键断裂的组分；和

(c)带有分离结合标签的固相载体。

在另一优选例中，所述检测体系中，所述(a)中，双链DNA探针的浓度为10-80nM，较佳地为20-50nM，更佳地为25-35nM，更佳地为30nM。

在另一优选例中，所述双链DNA探针的长度为5-200bp，较佳地为10-100bp，更佳地为15-70bp，更佳地为18-40bp。

在另一优选例中，所述可被待测DNA糖基化酶识别的碱基选自下组：尿嘧啶碱基、胞嘧啶碱基、胸腺嘧啶碱基、鸟嘌呤碱基、甲基化修饰的胞嘧啶碱基、5-羧基胞嘧啶、烷基腺嘌呤等。

在另一优选例中，所述可被待测DNA糖基化酶识别的碱基为尿嘧啶碱基。

在另一优选例中，所述至少一个可被待测DNA糖基化酶识别的碱基为一个尿嘧啶碱基。

在另一优选例中，所述至少一个可被待测DNA糖基化酶识别的碱基为一个尿嘧啶碱基，并且T2链上的相应位置为鸟嘌呤碱基。

在另一优选例中，所述荧光基团和分离标签各自独立地位于所述双链DNA探针的5’端、3’端和中部。

在另一优选例中，所述荧光基团包括可以用于与DNA探针交联的荧光基团。

在另一优选例中，所述荧光基团选自下组：FAM、FITC、BODIPY-FL、G-Dye100、FluorX、Cy3、Cy5、Texas Red等。

在另一优选例中，所述分离标签是指能够使连接于或包含所述分离标签的核酸序列从检测体系中被分离出来的标签。

在另一优选例中，所述分离标签选自下组：蛋白质、肽段或核酸片段。

在另一优选例中，所述分离标签选自下组：抗原、抗体、配体、受体、亲和素、生物素，或其组合。

在另一优选例中，所述分离标签为生物素。

在另一优选例中，所述T1链的序列为5’-FAM-S1-biotin-3’，并且所述T2链的序列为5’-S2-3’，其中，S1的序列如SEQ ID NO:1所示，S2的序列如SEQ ID NO:2所示。

在另一优选例中，所述检测体系中，所述(b)选自下组：碱性介质或脱碱基位点核酸内切酶(AP核酸内切酶)。

在另一优选例中，所述碱性介质为NaOH。

在另一优选例中，所述碱性介质在检测体系中的终浓度为100-300mM，较佳地为150-250mM，更佳地为200mM。

在另一优选例中，所述检测体系中，所述固相载体材质选自下组：金属、玻璃、胶体、塑料或其组合。

在另一优选例中，所述的固相载体材质包括：均聚物、共聚物、或其组合。

在另一优选例中，所述的固相载体材质选自下组：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、或其组合。

在另一优选例中，所述的固相载体材质选自下组：磁珠、微球、微孔板、板条、试管、或其组合。

在另一优选例中，所述的固相载体为磁珠。

在另一优选例中，所述检测体系的终体积为50-200μL，较佳地为60-150μL，更佳地为80-120μL，更佳地为100μL。

在另一优选例中，所述检测体系还包括反应缓冲液。

在另一优选例中，所述反应缓冲液包括：Tris-Cl pH8.0、EDTA、DTT等。

在另一优选例中，所述Tris-Cl pH8.0的终浓度为10-50mM，较佳地为15-30mM，更佳地为20mM。

在另一优选例中，所述EDTA的终浓度为0.5-2mM，较佳地为1mM。

在另一优选例中，所述DTT的终浓度为0.5-2mM，较佳地为1mM。

在另一优选例中，所述检测体系还包括待测DNA糖基化酶。

在另一优选例中，所述待测DNA糖基化酶选自下组：UDG、TDG、SMUG1、MBD4、OGG1、AAG，或其组合。

在另一优选例中，所述待测DNA糖基化酶选自下组：UDG、TDG或SMUG1。

在另一优选例中，所述待测DNA糖基化酶的浓度范围为1至500nM，较佳地为1至50nM，更佳地为1至20nM。

在另一优选例中，所述DNA糖基化酶选自下组：纯化的DNA糖基化酶及其溶解液、细胞裂解液、血液或其抽提物、体液或其抽提物，或其组合。

在另一优选例中，所述细胞裂解液包括癌症细胞裂解液。

在另一优选例中，所述癌症包括肺癌。

在另一优选例中，所述的检测包括：定性检测和定量检测。

在本发明的第二方面，提供了一种用于检测DNA糖基化酶的方法，包括步骤：

(I)提供如本发明第一方面所述的检测体系中的(a)和(b)，并且还包括待测DNA糖基化酶，进行充分反应；

(II)利用本发明第一方面中所述的分离标签，将带有分离标签的核酸片段从检测体系中分离；和

(III)将分离出带有分离标签的核酸片段后的检测体系进行荧光信号的测定。

在另一优选例中，所述方法的检测包括：定性检测和定量检测。

在另一优选例中，所述定性检测包括：对待检测样品中是否含有DNA糖基化酶的检测。

在另一优选例中，所述定量检测包括：对待检测样品中有活性的DNA糖基化酶的浓度的检测。

在另一优选例中，所述方法还包括进行空白样品的平行对照实验，所述空白样品中不包含DNA糖基化酶，且测得的荧光信号为A0。

在另一优选例中，若步骤(III)测得的信号A1/A0>1.1，则认为待检测样品中有DNA糖基化酶；若步骤(III)测得的信号A1/A0≤1.1，则认为待检测样品中没有DNA糖基化酶。

在另一优选例中，当所述方法用于定量检测DNA糖基化酶时，将浓度已知的不同浓度的DNA糖基化酶溶液替换所述待检测样品，进行步骤(I)至(III)的操作，并且还包括步骤：

(IV)构建荧光强度与已知的DNA糖基化酶的线性曲线；

(V)将待测DNA糖基化酶重复步骤(I)至(III)，将所得其荧光强度数值带入步骤(IV)所得的线性曲线，计算有活性的DNA糖基化酶的浓度。

在另一优选例中，所述步骤(I)中，所述待测DNA糖基化酶的浓度范围为1至500nM，较佳地为1至50nM，更佳地为1至20nM。

在另一优选例中，所述步骤(I)中，所述充分反应的时间为10-60min，较佳地为20-40min，更佳地为30min。

在另一优选例中，所述步骤(I)中，所述充分反应的温度为20-40℃，较佳地为22-30℃，更佳地为25℃。

在另一优选例中，所述步骤(I)中，所述的分离标签为生物素，并且所述步骤步骤(II)中，所述的分离结合标签为链霉亲和素。

在另一优选例中，所述步骤(II)中，所述分离包括子步骤：

(i)将如本发明第一方面所述的检测体系中的组分(c)加入步骤(I)的充分反应后的检测体系，进行充分结合，其中，所述分离结合标签是指可与所述分离标签特异性结合的标签；

(ii)向子步骤(i)的充分结合后的检测体系中，加入如本发明第一方面所述的检测体系中的组分(b)，进行核酸切割反应。

在另一优选例中，所述子步骤(i)中，所述固相载体材质选自下组：金属、玻璃、胶体、塑料或其组合。

在另一优选例中，所述子步骤(i)中，所述的固相载体材质包括：均聚物、共聚物、或其组合。

在另一优选例中，所述子步骤(i)中，所述的固相载体材质选自下组：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、或其组合。

在另一优选例中，所述子步骤(i)中，所述的固相载体材质选自下组：磁珠、微球、微孔板、板条、试管、或其组合。

在另一优选例中，所述子步骤(i)中，所述的固相载体为磁珠。

在另一优选例中，所述子步骤(i)中，所述充分结合的时间为0.5-2h，较佳地0.8-1.5h，更佳地1h。

在另一优选例中，所述子步骤(ii)中，所述碱性介质为NaOH。

在另一优选例中，所述碱性介质在检测体系中的终浓度为100-300mM，较佳地为150-250mM，更佳地为200mM。

在另一优选例中，所述子步骤(ii)中，所述核酸切割反应的时间为15-60min，较佳地为20-40min，更佳地为30min。

在另一优选例中，所述步骤(III)中，还包括将待测定荧光信号上清液转移至96孔板中。

在另一优选例中，所述步骤(III)的荧光信号的测定中，所述测定通过酶标仪进行。

在另一优选例中，所述检测体系中T1链所包括的荧光基团为FAM，并且所述步骤(III)的荧光信号的测定中，激发波长为485nm，发射波长为520nm。

在本发明第三方面，提供了一种用于检测DNA糖基化酶的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)第一容器以及位于第一容器中的如本发明第一方面所述的检测体系中的(a)；

(b)第二容器以及位于第二容器中的如本发明第一方面所述的检测体系中的(b)；和

(c)第三容器以及位于第三容器中的如本发明第一方面所述的检测体系中的(c)。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括使用说明书。

在本发明第四方面，提供了一种如本发明第一方面所述的检测体系的用途，用于检测DNA糖基化酶。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为本发明所述双链DNA探针用于检测多种糖基化酶的机理示意图。

图2为以G/U错配双链DNA探针为底物，不同浓度UDG处理后的荧光值及分析结果。

图3为以G/U错配双链DNA探针为底物，不同浓度TDG处理后的荧光值及分析结果。

图4为以G/U错配双链DNA探针为底物，不同浓度SMUG1处理后的荧光值及分析结果。

图5为Calu-1细胞中所含DNA糖基化酶酶活。黑色点及线为利用纯化TDG蛋白绘制的标准曲线，红色点为Calu-1细胞提取物在本方法中测定的荧光值。

图6为不同稀释浓度的Doxorubicin对TDG的酶活抑制效率。

图7为384孔板体系中，不同化合物对UDG的酶活抑制率，分别以30％及50％抑制率为阈值计算筛选阳性率，抑制率低于30％的值未在此显示。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量筛选，首次开发了一种通量高、需要样品量低、信号窗口大、操作简便、成本低的能够检测多种DNA糖基化酶的方法。具体地，本发明人将双链DNA探针的其中一条链中引入一个尿嘧啶，并且在该尿嘧啶碱基的两侧分别标记生物素和荧光基团，进而利用链霉亲和素磁珠和氢氧化钠溶液对荧光和生物素标记的酶切产物进行分离。结果表明，使用本发明的检测方法，可以有效的提高检测灵敏度，提高信号窗口，且方法安全、简单、通量高、易操作，通过简单更换底物探针可以适用于多种DNA糖基化酶如UDG、TDG、SMUG和OGG1等的酶活检测，且精确度高。在此基础上完成了本发明。

术语

双链DNA探针

如本文所用，术语“核酸探针”、“本发明核酸探针”、“双链DNA探针”等可互换使用，指本发明中用于检测DNA糖基化酶的双链DNA探针。

在本发明中，所述的双链DNA探针包括T1和T2两条链，并且所述T1和T2两条链可形成双链DNA结构；其中，所述的T1链包括：至少一个可被待测DNA糖基化酶识别的碱基、荧光基团和分离标签；并且所述荧光基团和分离标签分别位于所述至少一个可被DNA糖基化酶识别的碱基的两端。

在本发明中，所述的双链DNA探针在检测体系中的浓度为10-80nM，较佳地为20-50nM，更佳地为25-35nM，更佳地为30nM；所述双链DNA探针的长度为5-200bp，较佳地为10-100bp，更佳地为15-70bp，更佳地为18-40bp。

在本发明中，所述可被待测DNA糖基化酶识别的碱基选自但不限于下组：尿嘧啶碱基、胞嘧啶碱基、胸腺嘧啶碱基、鸟嘌呤碱基、甲基化修饰的胞嘧啶碱基、5-羧基胞嘧啶、烷基腺嘌呤等。在另一优选例中，所述可被待测DNA糖基化酶识别的碱基为尿嘧啶碱基。

在一个优选的实施方式中，所述至少一个可被待测DNA糖基化酶识别的碱基为一个尿嘧啶碱基。

在一个优选的实施方式中，所述至少一个可被待测DNA糖基化酶识别的碱基为一个尿嘧啶碱基，并且T2链上的相应位置为鸟嘌呤碱基。

在本发明中，所述荧光基团和分离标签各自独立地位于所述双链DNA探针的5’端、3’端和中部。

在本发明中，所述荧光基团可以是所有可用于与DNA探针交联的荧光基团。在另一优选例中，所述荧光基团选自下组：FAM、FITC、BODIPY-FL、G-Dye100、FluorX、Cy3、Cy5、Texas Red等。

在本发明中，所述分离标签是指能够使连接于或包含所述分离标签的核酸序列从检测体系中被分离出来的标签，可以选自：蛋白质、肽段或核酸片段。

在一个优选的实施方式中，所述分离标签选自但不限于下组：抗原、抗体、配体、受体、亲和素、生物素，或其组合。

在一个优选的实施方式中，所述分离标签为生物素。

在一个优选的实施方式中，所述双链DNA探针中，所述T1链的序列为5’-FAM-S1-biotin-3’，并且所述T2链的序列为5’-S2-3’，其中，S1的序列如SEQ ID NO:1所示，S2的序列如SEQ ID NO:2所示。

DNA糖基化酶

BER(碱基切除修复)通路是修复由氧化、烷基化和脱氨基所引起的内源性DNA碱基损伤的主要途径，而DNA糖基化酶是BER通路中的重要环节。DNA糖基化酶可以特异性切除受损或错配核苷酸上的N-β-糖苷键，在DNA链上形成脱碱基位点(AP位点)。接着AP核酸内切酶会把受损核苷酸的糖苷-磷酸键切开，并移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNA，并由DNA聚合酶I合成新的片段，最终由DNA连接酶把两者连成新的被修复DNA链，完成DNA损伤修复。

在本发明的一个实施方式中，使用NaOH溶液作为碱性介质或核酸变性剂，使脱碱基位点的的糖苷-磷酸键断裂。

已知的DNA糖基化酶包括：UDG(尿嘧啶DNA糖基化酶)、TDG(胸腺嘧啶DNA糖基化酶)、OGG1(8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶)、SMUG1(单链选择性单功能尿嘧啶DNA糖基化酶)、MBD4(甲基化CpG结合结构域蛋白4)、AAG(N-甲基嘌呤DNA糖基化酶，也称MPG)等。

UDG(尿嘧啶-DNA糖基化酶)的一个重要功能是通过切割N-糖基键并启动碱基切除修复(BER)途径从DNA分子中消除尿嘧啶来防止诱变。尿嘧啶碱基一般发生在胞嘧啶脱氨基或dUMP残基的错误掺入中。

TDG(胸腺嘧啶-DNA糖基化酶)通过水解DNA的糖-磷酸骨架和错配的胸腺嘧啶之间的碳-氮键从G/T错配中去除胸腺嘧啶部分。由于活性较低，该酶还可从C/T和T/T错配中去除胸腺嘧啶。TDG还可以用鸟嘌呤从错误配对中去除尿嘧啶和5-溴尿嘧啶。该酶在细胞防御由5-甲基胞嘧啶和胞嘧啶的自发脱氨作用引起的遗传突变中起重要作用。

SMUG1(单链选择性单功能尿嘧啶DNA糖基化酶)，可从核染色质中的单链和双链DNA中去除尿嘧啶及5-羟甲基尿嘧啶，从而有助于碱基切除修复。一般来说对单链DNA的修复活性比双链DNA强。

MBD4(甲基化CpG结合结构域蛋白4)含有甲基-CpG结合结构域，其可以在体外从错配的CpG位点有效地去除胸腺嘧啶或尿嘧啶。此外，MBD4的甲基-CpG结合结构域优先结合5-甲基胞嘧啶CpG-TpG错配-甲基-CpG脱氨的主要产物。结合和催化的组合特异性表明该酶可以起到最小化甲基-CpG突变的作用。

AAG(N-甲基嘌呤DNA糖基化酶，也称MPG)是哺乳动物体内是唯一对3-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤和1，N6-乙烯基腺嘌呤具有活性的DNA糖基化酶。虽然AAG也具有去除8-氧鸟嘌呤DNA损伤的能力，但它不是8-氧鸟嘌呤修复的主要糖基化酶。

OGG1(8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶)从被氧化诱变的DNA中释放出游离的8-羟基鸟嘌呤，并在与胞嘧啶配对的8-羟基鸟嘌呤残基上的双链DNA中造成单链断裂。

在本发明的一个实施方式中，当所述双链DNA探针中，所述可被待测DNA糖基化酶识别的碱基为尿嘧啶碱基时，可用于UDG、TDG、SMUG1或MBD4的检测。

在本发明中，可根据不同DNA糖基化酶的不同识别位点，设计双链DNA探针中所述的可被待测DNA糖基化酶识别的碱基，以实现不同的DNA糖基化酶的检测。

本发明的检测体系

在本发明中，提供了一种用于检测DNA糖基化酶的检测体系，包括：(a)双链DNA探针，所述双链DNA探针包括T1和T2两条链，并且所述T1和T2两条链可形成双链DNA结构；其中，所述T1链包括：至少一个可被待测DNA糖基化酶识别的碱基、荧光基团和分离标签；并且所述荧光基团和分离标签分别位于所述至少一个可被DNA糖基化酶识别的碱基的两端；(b)可使核酸脱碱基位点的糖苷-磷酸键断裂的组分。

在本发明的检测体系中，所述的(b)可以是碱性介质或脱碱基位点核酸内切酶(AP核酸内切酶)。

在一个优选的实施方式中，所述碱性介质为NaOH，并且在检测体系中的终浓度为100-300mM，较佳地为150-250mM，更佳地为200mM。

在本发明中，所述的碱性介质NaOH溶液，同时可作为碱性介质，对脱碱基位点进行切割。

本发明中的碱性介质，相较于传统的脱碱基位点核酸内切酶(AP核酸内切酶)，可利用核酸变性以后粘度下降、浮力密度升高、沉降速度加快等特点，在分离步骤中更加高效的被分离。

在另一优选例中，所述的检测体系中还包括：(c)带有分离结合标签的固相载体。所述的(c)用于将带有分离标签的核酸片段从检测体系中分离。

其中，所述固相载体材质选自但不限于下组：金属、玻璃、胶体、塑料或其组合。在另一优选例中，所述的固相载体材质包括：均聚物、共聚物、或其组合。在另一优选例中，所述的固相载体材质选自下组：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、或其组合。在另一优选例中，所述的固相载体材质选自下组：磁珠、微球、微孔板、板条、试管、或其组合。

在一个优选的实施方式中，所述的固相载体为磁珠。

在本发明中，所述检测体系的终体积为50-200μL，较佳地为60-150μL，更佳地为80-120μL，更佳地为100μL。

在另一优选例中，所述检测体系还包括反应缓冲液，所述的反应缓冲液包括：Tris-Cl pH8.0、EDTA、DTT等。在一个优选的实施方式中，所述Tris-Cl pH8.0的终浓度为10-50mM，较佳地为15-30mM，更佳地为20mM。在一个优选的实施方式中，所述EDTA的终浓度为0.5-2mM，较佳地为1mM。在一个优选的实施方式中，所述DTT的终浓度为0.5-2mM，较佳地为1mM。

本发明的检测方法

在本发明中，提供了一种用于检测DNA糖基化酶的方法，其特征在于，包括步骤：(I)提供如本发明第一方面所述的检测体系中的组分(a)和(b)，并且还包括待测DNA糖基化酶，进行充分反应；(II)利用本发明第一方面中所述的分离标签，将带有分离标签的核酸片段从检测体系中分离；和(III)将分离出带有分离标签的核酸片段后的检测体系进行荧光信号的测定。

本发明的检测方法包括：定性检测和定量检测。

在本发明中，所述定性检测包括：对待检测样品中是否含有DNA糖基化酶的检测；所述定量检测包括：对待检测样品中有活性的DNA糖基化酶的浓度的检测。

在一个优选的实施方式中，所述方法还包括进行空白样品的平行对照实验，所述空白样品中不包含DNA糖基化酶，且测得的荧光信号为A0。使用待测DNA糖基化酶进行测定后所得的荧光信号为A1，若A1/A0>1.1，则认为待检测样品中有DNA糖基化酶；若A1/A0≤1.1，则认为待检测样品中没有DNA糖基化酶。

在另一优选例中，当所述方法用于定量检测DNA糖基化酶时，将浓度已知的不同浓度的DNA糖基化酶溶液替换所述待检测样品，进行步骤(I)至(III)的操作，并且还包括步骤：(IV)构建荧光强度与已知的DNA糖基化酶的线性曲线；(V)将待测DNA糖基化酶重复步骤(I)至(III)，将所得其荧光强度数值带入步骤(IV)所得的线性曲线，计算有活性的DNA糖基化酶的浓度。

在本发明中，所述待测DNA糖基化酶的浓度范围为1至500nM，较佳地为1至50nM，更佳地为1至20nM。

在另一优选例中，所述步骤(I)中，所述充分反应的时间为10-60min，较佳地为20-40min，更佳地为30min。在另一优选例中，所述步骤(I)中，所述充分反应的温度为20-40℃，较佳地为22-30℃，更佳地为25℃。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述步骤(I)中，所述的分离标签为生物素，并且所述步骤步骤(II)中，所述的分离结合标签为链霉亲和素。

在另一优选例中，所述步骤(II)中，所述分离包括子步骤：

(i)将带有分离结合标签的固相载体加入步骤(I)的充分反应后的检测体系，进行充分结合，其中，所述分离结合标签是指可与所述分离标签特异性结合的标签；(ii)向子步骤(i)的充分结合后的检测体系中，加入碱性介质，进行核酸切割反应。

在所述的子步骤(i)中，所述固相载体材质选自但不限于下组：金属、玻璃、胶体、塑料或其组合。在另一优选例中，所述的固相载体材质包括：均聚物、共聚物、或其组合。在另一优选例中，所述的固相载体材质选自下组：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、或其组合。在另一优选例中，所述的固相载体材质选自下组：磁珠、微球、微孔板、板条、试管、或其组合。

在一个优选的实施方式中，所述子步骤(i)中，所述的固相载体为磁珠。

在另一优选例中，所述子步骤(i)中，所述充分结合的时间为0.5-2h，较佳地0.8-1.5h，更佳地1h。

在一个优选的实施方式中，所述子步骤(ii)中，所述碱性介质为NaOH，在检测体系中的终浓度为100-300mM，较佳地为150-250mM，更佳地为200mM；并且反应的时间为15-60min，较佳地为20-40min，更佳地为30min。

在另一优选的实施方式中，所述步骤(III)中，还包括将待测定荧光信号上清液转移至96孔板中；所述步骤(III)的荧光信号的测定中，所述测定通过酶标仪进行。

在一个优选的实施方式中，所述检测体系中T1链所包括的荧光基团为FAM，并且所述步骤(III)的荧光信号的测定中，激发波长为485nm，发射波长为520nm。

在一个优选的实施方式中，将所述双链DNA探针与待检测样品在反应缓冲液中进行充分反应后，依次加入链霉亲和素磁珠和能够使核酸变性的NaOH溶液，于是脱碱基位点的双链DNA与链霉亲和素标记的磁珠结合；碱性介质对脱碱基位点进行切割，在该位点处留下一个核苷酸的缺口，从而使5’端带有FAM的DNA片段与3’端带有生物素的DNA片段断开，DNA双螺旋结构被碱性介质破坏从而导致FAM标记的DNA片段和生物素标记的DNA片段与其互补链分离；所述链霉亲和素标记的磁珠可以被磁力架吸附，带有荧光基团FAM的DNA片段释放至上清液中。带有生物素标记的核酸片段被结合到磁珠这一固相载体上，从而被吸附至管壁，随后从溶液中分离。

因此，被切开的核酸探针则留在原检测体系的溶液中，并且均带有荧光基团。因此，检测其荧光信号则可得到待测液中DNA糖基化酶的浓度。

本发明提供的检测方法对于DNA糖基化酶的异常表达早期诊断和靶向DNA糖基化酶的抑制剂研发对重要意义。

试剂盒

本发明提供了一种用于检测DNA糖基化酶的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：(a)第一容器以及位于第一容器中的如本发明第一方面所述的检测体系中的(a)；(b)第二容器以及位于第二容器中的如本发明第一方面所述的检测体系中的(b)；和(c)第三容器以及位于第三容器中的如本发明第一方面所述的检测体系中的(c)。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括使用说明书。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明设计了一种可检测多种DNA糖基化酶活性的方法，本发明技术方案中采用含有相应DNA糖基化酶识别位点的双链DNA荧光探针，该原理适用于各种DNA糖基化酶；

(2)操作简单，阳性率高：本方案中不需要额外的扩增步骤，传统的检测糖基化酶的方法往往结合复杂的扩增步骤，扩增过程中容易出现假阳性信号；本发明所用的方法不需要其它酶的参与；

(3)高通量，成本低：本方案中方法可以被应用于高通量筛选体系，可以做384孔板水平的筛选，成本低于1元/孔。

(4)本发明中的碱性介质，同时也可作为核酸变性剂，相较于传统的脱碱基位点核酸内切酶(AP核酸内切酶)，可利用核酸变性以后粘度下降、浮力密度升高、沉降速度加快等特点，使得被切开的核酸片段在分离步骤中更加高效的被分离。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

如无特别说明，实施例所用的材料和试剂均为市售产品。

实验试剂和仪器

实验试剂：

DNA寡核苷酸是由捷瑞生物工程有限公司(上海)合成和纯化的。尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG),单链选择性单功能尿嘧啶DNA糖基化酶(SMUG1)和烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(AAG)购自NEB(美国，麻省)，胸腺嘧啶糖基化酶(TDG)由大肠杆菌中过表达并纯化所得；链霉亲和素磁珠购于Thermo Fisher有限公司(美国，麻省)，磁力架购自博尔希(深圳)，氢氧化钠购自国药集团；溶液制备时所用超纯水均来自Millipore Milli-Q水净化系统。

实验仪器：

荧光检测使用肯帝Infinite-200荧光光谱仪进行测定(瑞士，肯帝公司)；激发波长为485nm，发射波长为520nm；激发的狭缝宽度为20nm，发射的狭隙宽度为10nm。

实施例1：纯的UDG活性检测

首先设计一个含有尿嘧啶碱基的双链DNA探针T1-T2，其中T1链的核苷酸序列为：5’-FAM-TAA UGT GAA TGG AGC TGA AAT-biotin-3’(SEQ ID NO:1)；T2链的核苷酸序列为5’-ATT TCA GCT CCA TTC ACG TTA-3’(SEQ ID NO:2)，T1链和T2链互补形成双链DNA探针T1-T2。

将双链DNA探针T1-T2及不同浓度(0nM，15nM，30nM，60nM，120nM)的UDG分别加入到反应缓冲液中，反应缓冲液的组成为：20mM Tris-Cl pH8.0，1mM EDTA，1mM DTT；终体积为100μL，体系中双链DNA探针T1-T2的浓度为30nM,体系在25℃下孵育30分钟，使碱基切除反应发生，然后将1μL链霉亲和素磁珠加入反应液与生物素标记的DNA充分结合1小时，将NaOH加入到反应液中至终浓度200mM，室温孵育30分钟，在磁力架的作用下链霉亲和素磁珠被吸附至管壁，将上清液转移至新的96孔板中，置入Tecan酶标仪中进行荧光测定。

构建荧光强度与UDG浓度之间的线性曲线，结果如图2所示，R²＝0.9902，UDG蛋白浓度在0～120nM之间与荧光值呈线性关系。证明本方法可检测低至15nM的UGD蛋白。

实施例2：纯的TDG活性检测

首先设计一个含有尿嘧啶碱基的双链DNA探针T1-T2，其中T1链的核苷酸序列为：5’-FAM-TAA UGT GAA TGG AGC TGA AAT-biotin-3’(SEQ ID NO:1)；T2链的核苷酸序列为5’-ATT TCA GCT CCA TTC ACG TTA-3’(SEQ ID NO:2)，T1链和T2链互补形成双链DNA探针T1-T2。

将双链DNA探针T1-T2及不同浓度(0nM，1.85nM，5.56nM，16.67nM，50nM)的TDG分别加入到反应缓冲液中，反应缓冲液的组成为：20mM HEPES pH7.5，100mM NaCl，0.2mM EDTA，2.5mM MgCl₂；终体积为100μL，体系中双链DNA探针T1-T2的浓度为30nM,体系在25℃下孵育30分钟，使碱基切除反应发生，然后将1μL链霉亲和素磁珠加入反应液与生物素标记的DNA充分结合1小时，将NaOH加入到反应液中至终浓度200mM，室温孵育30分钟，在磁力架的作用下链霉亲和素磁珠被吸附至管壁，将上清液转移至新的96孔板中，置入Tecan酶标仪中进行荧光测定。

构建荧光强度与TDG浓度之间的线性曲线，结果如图3所示，R²＝0.9968，TDG蛋白浓度在0～50nM之间与荧光值呈线性关系。证明本方法可检测低至1.85nM的TGD蛋白。

实施例3：纯的SMUG1活性检测

首先设计一个含有尿嘧啶碱基的双链DNA探针T1-T2，其中T1链的核苷酸序列为：5’-FAM-TAA UGT GAA TGG AGC TGA AAT-biotin-3’(SEQ ID NO:1)；T2链的核苷酸序列为5’-ATT TCA GCT CCA TTC ACG TTA-3’(SEQ ID NO:2)，T1链和T2链互补形成双链DNA探针T1-T2；

将双链DNA探针T1-T2及不同浓度(0nM，12.5nM，25nM，50nM，100nM)的SMUG1分别加入到反应缓冲液中，反应缓冲液的组成为：10mM Tris-Cl pH7.0，10mM MgCl₂，1mM DTT；终体积为100μL，体系中双链DNA探针T1-T2的浓度为30nM,体系在25℃下孵育30分钟，使碱基切除反应发生，然后将1μL链霉亲和素磁珠加入反应液与生物素标记的DNA充分结合1小时，将NaOH加入到反应液中至终浓度200mM，室温孵育60分钟，在磁力架的作用下链霉亲和素磁珠被吸附至管壁，将上清液转移至新的96孔板中，置入Tecan酶标仪中进行荧光测定。

构建荧光强度与TDG浓度之间的线性曲线，结果如图4所示，R²＝0.9945，SMUG蛋白浓度在0～100nM之间与荧光值呈线性关系。证明本方法可检测低至12.5nM的SMUG蛋白。

实施例4：肺癌(Calu-1)细胞裂解液中的TDG活性检测

采用本发明的检测方法对Calu-1细胞裂解液中的TDG活性进行了分析检测，具体步骤如下：

Calu-1细胞样品通过离心分离(5min，1000rpm，4℃)并通过裂解缓冲液(20mMTris-Cl pH 8.0，1.5mM MgCl₂，10mM KCl，1mM DTT，1mM EDTA)重悬；混合液在冰上静置10min并以3500rpm的速度进行离心分离10分钟，将上清液去除，用细胞核裂解液(20mMTris-Cl pH 8.0，420mM NaCl，10mM KCl，1mM DTT，1mM EDTA)重悬沉淀并在冰上静置20min，以12000rpm的速度进行离心分离20分钟，所述上清液即为Calu-1核细胞裂解液；Calu-1核细胞裂解液可以直接进行TDG活性检测，无需进一步处理；检测方法和实施例2中纯的TDG活性检测方法相同。

如图5所示，将测定的荧光值带入绘制好的TDG蛋白浓度-荧光值线性曲线中，通过计算得到10⁷个Calu-1细胞中大概含有相当于9.12nM的TDG蛋白。

实施例5：TDG的活性抑制检测

Doxorubicin是一种和双链DNA结合的小分子化合物，其与DNA结合以后可以影响TDG对双链DNA的识别能力。50nM TDG与不同浓度Doxorubicin混合并于37℃下孵育30min；双链DNA探针T1-T2被加入到混合物中得到终体积为100μL的体系，于25℃孵育30min；然后将1μL链霉亲和素磁珠加入混合体系中，充分反应1小时；将NaOH加入到反应液中至终浓度200mM，室温孵育1小时，在磁力架的作用下链霉亲和素磁珠被吸附至管壁，将上清液转移至新的96孔板中并置入Tecan酶标仪中进行荧光测定；所有实验均重复两次。

测定的荧光值扣除本底以后，以溶剂对照组荧光值为100％，不同浓度Doxorubicin的荧光值相对于溶剂对照组计算为活性比例。如图6所示，系统的相对荧光随Doxorubicin的浓度的增加而减小，IC₅₀＝2.12nM。结果表明本方法可用于检测TDG的活性抑制剂。

实施例6：DNA糖基化酶抑制剂的高通量筛选

本方法可应用于384孔板体系进行DNA糖基化酶抑制剂的高通量筛选，以UDG为例，UDG以50nm/L的终浓度与反应缓冲液(20mM HEPES pH 7.5，100mM NaCl，0.2mM EDTA，2.5mMMgCl₂)混合，通过移液工作站加入到384孔板中，每孔中混合物的体积为19.6μL，排布于384孔板的化合物(1mM)通过移液工作站加入到含有TDG混合液的384孔板中(0.4μL化合物/孔)，化合物的终浓度为20μM；酶与化合物在室温预孵育30min，并加入10μL双链DNA探针至终浓度30nm/L，25℃孵育30分钟，产生脱碱基位点；链霉亲和素磁珠被加入混合液(0.6μL/孔)并孵育1小时，加入NaOH溶液至终浓度200mM并孵育30min；链霉亲和素磁珠被磁力架吸附，上清溶液被转移至新的384孔板，将384孔板置入Tecan酶标仪中进行荧光测定。

测定的荧光值扣除本底以后，以溶剂对照组荧光值为100％，抑制率为0％，计算不同化合物荧光值相对溶剂对照组的抑制率。如图7所示，若以30％酶活抑制率为阈值可得到1.5％筛选阳性率，若以50％酶活抑制率为阈值则可得到0.9％筛选阳性率。本实验证明此方法可用于高通量筛选DNA糖基化酶抑制剂。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海仕谱生物科技有限公司

<120> 一种可检测多种DNA糖基化酶活性的方法

<130> P2018-1971

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

taaugtgaat ggagctgaaa t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

atttcagctc cattcacgtt a 21