生物标志物及其应用

文档序号：1320934 发布日期：2020-07-14 浏览：5次 >En<

阅读说明：本技术 生物标志物及其应用 (Biomarkers and uses thereof ) 是由高山蒋思远于 2020-03-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种生物标志物及其应用。该生物标志物能够用于评估IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用,生物标志物包括HUNK,IGF1R抑制剂包括BMS。上述生物标志物能够用于有效评估BMS抑制剂对IGF1R抑制作用。(The invention relates to a biomarker and application thereof. The biomarkers can be used to assess the inhibitory effect of IGF1R inhibitors on IGF1R, the biomarkers including HUNK and IGF1R inhibitors including BMS. The biomarkers can be used for effectively evaluating the inhibition effect of the BMS inhibitor on IGF 1R.)

生物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种生物标志物及其应用。

背景技术

胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factors，IGFs)是一类具有广泛生物学功能的细胞因子。IGFs包括IGF-1和IGF-2两类生长因子，都是与胰岛素结构类似进化上保守的活性肽。其中，在大多数细胞和组织中，IGF-1促进细胞增殖、分化和生存，影响胰岛素的代谢。胰岛素样生长因子1受体(IGF-1receptor，IGF1R)介导IGF-1的作用。

IGF1R是受体酪氨酸激酶(receptortyrosine kinase，RTKs)家族中一员，其中包括胰岛素、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)和血小板衍生生长因子(platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)受体等。IGF1R是一个异四聚体跨膜蛋白，由两个α-亚基和两个β-亚基组成，α-亚基与β-亚基之间由3个二硫键结合在一起。IGF1R抑制剂对IGF1R具有抑制作用。其中，通过评估IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用，有利于筛选适合的IGF1R抑制剂。然而，现有技术中缺乏有效地评估IGF1R抑制剂的抑制作用的方式，尤其难于评估BMS抑制剂的抑制作用，不能满足实际需要。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够用于有效评估BMS抑制剂对IGF1R抑制作用的生物标志物及其应用。

一种生物标志物，能够用于评估IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用，所述生物标志物包括HUNK，所述IGF1R抑制剂包括BMS。

本研究对IGF1R抑制剂进行了大量的研究，意料不到的发现，HUNK基因的表达量影响BMS-754807抑制剂对IGF1R抑制剂的作用，因此，HUNK能够作为生物标志物以有效评估BMS-754807抑制剂对IGF1R抑制作用。

在其中一个实施例中，所述生物标志物还包括AGAP3及IGF2R中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述生物标志物还包括JIP4、ARF6、p-MKK4、MKK4、p-JNK、JNK、p-c-Jun及c-Jun中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述IGF1R抑制剂还包括OSI-906。

上述生物标志物在制备检测所述IGF1R抑制剂的抗肿瘤效果的检测试剂盒或者检测所述IGF1R抑制剂的抗肿瘤效果的检测装置中的应用。

在其中一个实施例中，所述肿瘤为结肠癌。

一种提高IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用的方法，包括如下步骤：敲除机体的生物标志物基因，以提高IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用，所述生物标志物包括HUNK，所述IGF1R抑制剂包括BMS-754807；

或，包括如下步骤：给机体施加抑制生物标志物基因表达的抑制剂，以提高IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用，所述生物标志物包括HUNK，所述IGF1R抑制剂包括BMS-754807。

一种抗肿瘤药物组合物，包括HUNK抑制剂及IGF1R抑制剂，所述IGF1R抑制剂包括BMS-754807。

在其中一个实施例中，所述HUNK抑制剂包括拉帕替尼及星形孢菌素中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述IGF1R抑制剂还包括OSI-906；

及/或，所述肿瘤为结肠癌。

一种检测IGF1R抑制剂的抗肿瘤效果的检测试剂盒，包括与生物标志物特异性结合的检测物，所述生物标志物包括HUNK，所述IGF1R抑制剂包括BMS-754807。

在其中一个实施例中，所述与生物标志物特异性结合的检测物包括扩增所述HUNK基因的引物对。

在其中一个实施例中，扩增所述HUNK基因的引物对的碱基序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示。

附图说明

图1为实施例1中不同浓度的OSI-906处理下野生型的SW480人结肠癌细胞和HUNK基因敲除的SW480人结肠癌细胞的相对细胞增殖量的对比图；

图2为实施例1中不同浓度的OSI-906处理下基因敲减的空白对照SW480人结肠癌细胞、野生型SW480人结肠癌细胞的第一个HUNK靶点敲减后的细胞、野生型SW480人结肠癌细胞的第二个HUNK靶点敲减后的细胞的相对细胞增殖量的对比图；

图3为实施例1中不同浓度的OSI-906处理下过表达HUNK的空白对照HT-29人结肠癌细胞、过表达HUNK的HT-29人结肠癌细胞的相对细胞增殖量的对比图；

图4为实施例1中不同浓度的BMS-754807处理下野生型的SW480人结肠癌细胞和HUNK基因敲除的SW480人结肠癌细胞的相对细胞增殖量的对比图；

图5为实施例1中不同浓度的BMS-754807处理下基因敲减的空白对照SW480人结肠癌细胞、野生型SW480人结肠癌细胞的第一个HUNK靶点敲减后的细胞、野生型SW480人结肠癌细胞的第二个HUNK靶点敲减后的细胞的相对细胞增殖量的对比图；

图6为实施例1中不同浓度的BMS-754807处理下过表达HUNK的空白对照HT-29人结肠癌细胞、过表达HUNK的HT-29人结肠癌细胞的相对细胞增殖量的对比图；

图7为实施例2中6孔板培养的各组细胞的照片；

图8为实施例2中6孔板培养的各组细胞的克隆形成数的对比图；

图9为实施例2中96孔板培养的各组细胞的照片；

图10为实施例2中96孔板培养的各组细胞的相对三维球面积的比值的对比图；

图11为各组小鼠灌胃后的肿瘤体积随培养时间的变化曲线对比图；

图12为各组小鼠灌胃后肿瘤的照片；

图13为灌胃培养10天的各组小鼠的肿瘤体积对比图；

图14为实施例4中野生型的SW480人结肠癌细胞和HUNK基因敲除的SW480人结肠癌细胞的HUNK和IGF2R的基因表达量的对比图；

图15为实施例4中SW480细胞系中HUNK敲减后IGF2R的mRNA表达检测结果；

图16为实施例4中HT-29人结肠癌细胞、过表达HUNK的HT-29人结肠癌细胞的HUNK和IGF2R的基因表达量的对比图；

图17为实施例4中野生型的SW480人结肠癌细胞和HUNK基因敲除的SW480人结肠癌细胞的HUNK、IGF2R和GADPH的蛋白表达量的对比图；

图18为实施例4中SW480细胞系中HUNK敲减后IGF2R的蛋白表达检测结果；

图19为实施例4中野生型的SW480人结肠癌细胞和HUNK基因敲除的SW480人结肠癌细胞的HUNK、IGF2R和GADPH的蛋白表达量的对比图；

图20为实施例5中sgRNA、sgIGF2R的相对细胞增殖量的对比图；

图21为实施例5中shNC、shIGF2R1、shIGF2R2的相对细胞增殖量的对比图；

图22为实施例5中NEO shNC、OE HUNK shNC、OE HUNK shIGF2R1、OE HUNKshIGF2R2的相对细胞增殖量的对比图；

图23为实施例5中WT sgRNA、KO sgRNA、KO sgIGF2R1、KO sgIGF2R2的相对细胞增殖量的对比图；

图24～图27为实施例6中HUNK、AGAP3、MKK4、p-MKK4、ARF6、JNK、p-JNK、c-JUN、p-c-JUN、JIP4、IGF2R和GADPH的表达量的对比图；

图28为实施例7中HER2、HUNK、AGAP3、MKK4、p-MKK4、ARF6、JNK、p-JNK、c-JUN、p-c-JUN、JIP4和GADPH的蛋白表达量；

图29为实施例7中Lapatinib组和OSI-906(10μM)-Lapatinib组的细胞活性对比图；

图30为实施例7中各组小鼠灌胃后的肿瘤体积随培养时间的变化曲线对比图；

图31为实施例7中各组小鼠灌胃后肿瘤的照片；

图32为实施例7中灌胃培养10天的各组小鼠的肿瘤体积对比图；

图33为实施例8中SW480细胞敲减c-Jun蛋白后IGF2R的表达量的蛋白印迹图；

图34为实施例8中SW480细胞过表达c-Jun蛋白后IGF2R的表达量的蛋白印迹图；

图35为实施例8中过表达HUNK蛋白的SW480细胞系中同时敲减c-Jun后IGF2R的表达量的蛋白印迹图；

图36为实施例8中过表达HUNK蛋白的SW480细胞系使用JNK抑制剂后IGF2R的表达量的蛋白印迹图；

图37为实施例8中过表达HUNK蛋白的SW480细胞系中同时敲减MKK4后磷酸JNK和JNK,磷酸化c-Jun和c-Jun以及IGF2R的表达量的蛋白印迹图；

图38为实施例8中敲减IGF2R的SW480细胞系使用BMS-754807抑制剂的细胞活性；

图39为实施例8中SW480细胞过表达IGF2R的SW480细胞系使用BMS抑制剂的细胞活性图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

一实施方式的生物标志物，能够用于评估IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用，以能够用于制备检测IGF1R抑制剂的抗肿瘤效果的检测试剂盒或者检测IGF1R抑制剂的抗肿瘤效果的检测装置中的应用。其中，肿瘤例如可以为结肠癌。具体地，生物标志物包括HUNK。IGF1R抑制剂包括BMS。

激素正调节肿瘤相关性激酶(HUNK，Hormonallyup-regulatedneu-associatedkinase)最初称为Bstk1，也称为VMR肿瘤家族转移有关的蛋白激酶(metastasisassociated protein kinase in VMR tumor family，Mak-V)。HUNK基因位于21号染色体上，长80kDa，是SNF1相关性AMPK家族丝氨酸/苏氨酸激酶。本研究对IGF1R抑制剂进行了大量的研究，意料不到的发现，HUNK基因的表达量影响BMS抑制剂对IGF1R抑制剂的作用，因此，HUNK能够作为生物标志物以有效评估BMS抑制剂对IGF1R抑制作用。

在其中一个实施例中，BMS抑制剂为BMS-754807抑制剂。需要说明的是，BMS抑制剂不限于为BMS-754807抑制剂，也可以为其他抑制IGF1R的BMS抑制剂。

在其中一个实施例中，生物标志物还包括AGAP3。AGAP3为带有GTP水解酶结构域的ADP核糖基化因子家族的GTPase激活蛋白。本研究发现，HUNK能够上调AGAP3的表达，因此，通过将AGAP3与HUNK作为生物标志物，使得能够更加准确地评估IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用，且特异性较高。

在其中一个实施例中，生物标志物还包括JIP4及ARF6中的至少一种。JIP4为JNK支架蛋白。ARF6为GTP结合蛋白，具有ADP-核糖基转移酶活性。本研究发现，HUNK能够上调JIP4和ARF6的表达，因此，通过将JIP4、ARF6与HUNK作为生物标志物，使得能够更加准确地评估IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用，且特异性较高。

在其中一个实施例中，生物标志物还包括p-MKK4、MKK4、p-JNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun及IGF2R中的至少一种。p-MKK4为磷酸化的丝裂原激活的蛋白激酶激酶4。ARF6为ADP-核糖基转移酶6。MKK4为丝裂原激活的蛋白激酶激酶4。p-JNK为磷酸化的c-Jun氨基末端激酶。JNK为c-Jun氨基末端激酶。p-c-Jun为磷酸化的c-Jun。c-Jun为一种转录调节因子，属亮氨酸拉链家族成员。IGF2R为胰岛素样生长因子2受体(IGF-2receptor，IGF2R)介导IGF-2的作用。本研究发现，HUNK能够影响p-MKK4、MKK4、p-JNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun及IGF2R的表达，因此，通过将p-MKK4、MKK4、p-JNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun、IGF2R与HUNK作为生物标志物，使得能够更加准确地评估IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用，且特异性较高。

在其中一个实施例中，IGF1R抑制剂还包括OSI-906。本研究发现，HUNK作为生物标志物不仅能够评估BMS的抑制作用，还能够评估其他IGF1R抑制的抑制作用，例如OSI-906。需要说明的是，IGF1R抑制剂不限于为上述指出的IGF1R抑制剂，还可以为本领域中其他常见的IGF1R抑制剂。

本研究对IGF1R抑制剂进行了大量的研究，意料不到的发现，HUNK基因的表达量影响BMS抑制剂对IGF1R抑制剂的作用，因此，HUNK能够作为生物标志物以有效评估BMS抑制剂对IGF1R抑制作用，并且使得HUNK基因能够作为IGF1R抑制剂的联合用靶点。

一实施方式的提高IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用的方法，包括如下步骤：敲除机体的生物标志物基因，以提高IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用，生物标志物包括HUNK，IGF1R抑制剂包括BMS。

在其中一个实施例中，IGF1R抑制剂还包括OSI-906。需要说明的是，IGF1R抑制剂不限于为上述指出的IGF1R抑制剂，还可以为本领域中其他常见的IGF1R抑制剂。

本研究发现，HUNK基因能够提高细胞对IGF1R抑制剂的阻抗作用。因此，通过敲除机体的HUNK基因，能够提高IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用。

另一实施方式的提高IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用的方法，包括如下步骤：给机体施加抑制生物标志物基因表达的抑制剂，以提高IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用。生物标志物包括HUNK。IGF1R抑制剂包括BMS。

在其中一个实施例中，IGF1R抑制剂还包括OSI-906。需要说明的是，IGF1R抑制剂不限于为上述指出的IGF1R抑制剂，还可以为本领域中其他常见的IGF1R抑制剂。

本研究发现，HUNK基因能够提高细胞对IGF1R抑制剂的阻抗作用。因此，通过给机体施加抑制HUNK基因表达的抑制剂，以抑制HUNK基因的表达，而提高IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用。

此外，还提供一实施方式的抗肿瘤药物组合物，具有较好的抗肿瘤作用。具体地，抗肿瘤药物包括HUNK抑制剂及IGF1R抑制剂。IGF1R抑制剂包括BMS。

在其中一个实施例中，HUNK抑制剂包括拉帕替尼及星形孢菌素中的至少一种。此种设置的HUNK抑制剂能够与IGF1R抑制剂配合，以提高抗肿瘤药物组合物的抗肿瘤作用。需要说明的是，HUNK抑制剂不限于为上述指出的HUNK抑制剂，还可以为本领域中其他常见的HUNK抑制剂。

在其中一个实施例中，IGF1R抑制剂还包括OSI-906。将HUNK抑制剂能够与OSI-906配合，以提高抗肿瘤药物组合物的抗肿瘤作用。需要说明的是，IGF1R抑制剂不限于为上述指出的IGF1R抑制剂，还可以为本领域中其他常见的IGF1R抑制剂。

在其中一个实施例中，HUNK抑制剂与IGF1R抑制剂的摩尔比为1：1～1：100。

在其中一个实施例中，肿瘤为结肠癌。

本研究对IGF1R抑制剂进行了大量的研究，意料不到的发现，HUNK基因的表达量影响BMS抑制剂对IGF1R抑制剂的作用，因此，HUNK能够作为生物标志物以有效评估BMS抑制剂对IGF1R抑制作用，并且使得HUNK基因能够作为IGF1R抑制剂的联合用靶点，从而通过HUNK抑制剂与IGF1R抑制剂配合，得到抗肿瘤作用较优的抗肿瘤药物组合物。

一实施方式的检测IGF1R抑制剂的抗肿瘤效果的检测试剂盒包括与生物标志物特异性结合的检测物。生物标志物包括HUNK。IGF1R抑制剂包括BMS。

在其中一个实施例中，与生物标志物特异性结合的检测物为能够扩增该生物标志物的引物或能够检测该生物标志物的探针。通过扩增该生物标志物的引物或检测该生物标志物的探针定量或定性的测定生物标志物的含量。

在其中一个实施例中，与生物标志物特异性结合的检测物包括PCR扩增HUNK基因的引物对。需要说明的是，与生物标志物特异性结合的检测物不限于包括PCR扩增HUNK基因的引物对，该可以包括检测HUNK基因的探针。

在其中一个实施例中，PCR扩增HUNK基因的引物对的碱基序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示。具体地，如SEQ ID No.1所示的序列为5’-CCCGCAGATACATCCGACAG-3’。如SEQ ID No.2所示的序列为5’-TTTTGGGGCCGTATTTCTTCC-3’。

在其中一个实施例中，BMS抑制剂为BMS-754807抑制剂。需要说明的是，BMS抑制剂不限于为BMS-754807抑制剂，也可以为其他BMS抑制剂。

在其中一个实施例中，生物标志物还包括AGAP3。本研究发现，HUNK能够上调AGAP3的表达，因此，通过将AGAP3与HUNK作为生物标志物，使得能够更加准确地评估IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用，且特异性较高。进一步地，与生物标志物特异性结合的检测物还包括PCR扩增AGAP3基因的引物对。

在其中一个实施例中，生物标志物还包括JIP4及ARF6中的至少一种。本研究发现，HUNK能够上调JIP4和ARF6的表达，因此，通过将JIP4、ARF6与HUNK作为生物标志物，使得能够更加准确地评估IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用，且特异性较高。进一步地，与生物标志物特异性结合的检测物还包括PCR扩增JIP4基因的引物对及PCR扩增JIP4基因的引物对中的至少一种。

在其中一个实施例中，生物标志物还包括p-MKK4、MKK4、p-JNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun及IGF2R中的至少一种。本研究发现，HUNK能够影响p-MKK4、MKK4、p-JNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun及IGF2R的表达，因此，通过将p-MKK4、MKK4、p-JNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun、IGF2R与HUNK作为生物标志物，使得能够更加准确地评估IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用，且特异性较高。进一步地，与生物标志物特异性结合的检测物还包括PCR扩增p-MKK4基因的引物对、PCR扩增MKK4基因的引物对、PCR扩增p-JNK基因的引物对、PCR扩增JNK基因的引物对、PCR扩增p-c-Jun基因的引物对、PCR扩增c-Jun基因的引物对和PCR扩增IGF2R基因的引物对中的至少一种。

在其中一个实施例中，检测IGF1R抑制剂的抗肿瘤效果的检测试剂盒还包括生物标志物PCR反应常用的DNA聚合酶和试剂，能够和与生物标志物特异性结合的检测物相互配合，以实现对生物标志物的检测。

其中，DNA聚合酶选自T4 DNA聚合酶、Klenow酶和DNA聚合酶I中的至少一种。试剂例如包括缓冲液、dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP)、荧光染料和稳定剂。

在其中一个实施例中，检测IGF1R抑制剂的抗肿瘤效果的检测试剂盒还包括检测内参基因的试剂。例如可以包括PCR扩增内参基因引物对。通过检测内参基因的试剂检测内参基因的含量，以此为基准计算生物标准的含量，从而校正生物标志物的检测过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。具体地，内参基因例如可以为GAPDH。

上述检测试剂盒通过上述生物标志物进行检测，能够评估IGF1R抑制剂的抗肿瘤效果，得到的结果具有较高的敏感度和较高的特异性，有利于IGF1R抑制剂的筛选，对抗肿瘤的研究具有重要的临床应用价值。

以下为具体实施例部分。

实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。

如未特别说明，各基因干扰细胞中所用的序列详见表1。

表1各基因干扰细胞中所用的序列

如未特别说明，以下实施例中，OSI-906购于Selleck公司；BMS-754807购于Selleck公司。

如未特别说明，以下实施例中，HUNK基因敲除的SW480人结肠癌细胞(即HUNK敲除细胞系)购于江苏吉锐生物技术有限公司。HUNK基因敲减的SW480人结肠癌细胞(即HUNK敲减细胞系)本实验室构建，具体地，使用靶向HUNK的siRNA转染SW480人结肠癌细胞得到HUNK基因敲减的SW480人结肠癌细胞。野生型的SW480人结肠癌细胞购于中科院上海细胞库。野生型的HT-29人结肠癌细胞购于中科院上海细胞库。HUNK基因过表达的SW480人结肠癌细胞(即HUNK过表达细胞系)本实验室构建，具体地，使用HUNK全长序列构建的慢病毒，然后感染SW480人结肠癌细胞得到HUNK基因过表达的SW480人结肠癌细胞。Lapatinib购于Selleck公司。其中，SW480人结肠癌细胞有两个HUNK靶点；第一个HUNK靶点的siRNA简称siHUNK-1，其序列如SEQ ID No.7所示，即GCCATCTACTTCCTCTTAATT；第二个HUNK靶点的siRNA简称siHUNK-2，其序列如SEQ ID No.8所示，即GCTACTAGATGAAGACAATTT。

如未特别说明，以下实施例中，目的基因过表达SW480细胞的构建过程包括：使用目的基因全长序列构建的慢病毒，然后感染SW480细胞系得到目的基因过表达的细胞系。

实施例1

(1)实验共分为10大组，分别编号为第1组～第7组。每个大组分为10个小组，分别编号为1号～10号。在96孔板上进行实验。每个小组三孔。向第1组的每孔中加入HUNK基因敲除的SW480人结肠癌细胞。向第2组的每孔中野生型SW480人结肠癌细胞。向第3组的每孔中加入基因敲减的空白对照SW480人结肠癌细胞(即细胞中没有含敲减靶点的质粒)。向第4组的每孔中加入第一个HUNK基因靶点敲减的SW480人结肠癌细胞。向第5组的每孔中加入第二个HUNK基因靶点敲减的SW480人结肠癌细胞。向第6组的每孔中加入过表达HUNK的空白对照人结肠癌细胞。向第7组的每孔中加入过表达HUNK的HT-29人结肠癌细胞。向每孔中加入0.2mL、含体积百分含量为10％胎牛血清的DMEM培养基，然后37℃、5％二氧化碳下培养24h。每孔的细胞数为3000个～5000个。

(2)向每个大组的1号～10号小组中分别加入1微升、不同浓度的OSI-906，且1号～10号的小组中OSI-906在培养基中的最终浓度在0μM～10μM范围内以10的倍数梯度递增，培养5天后，固液分离，收集细胞。其中，1号～10号的小组中OSI-906在培养基中的最终浓度分别为0、0.001μM、0.03μM、0.01μM、0.03μM、0.1μM、0.3μM、3μM、5μM和10μM。

(3)按照与步骤(2)相同的方法，向每个大组的1号～10号小组中分别加入1微升、不同浓度的BMS-754807，且1号～10号的小组中BMS-754807的浓度在0μM～10μM范围内以10的倍数梯度递增，培养5天后，固液分离，收集细胞。其中，1号～10号的小组中BMS-754807在培养基中的最终浓度分别为0、0.001μM、0.03μM、0.01μM、0.03μM、0.1μM、0.3μM、3μM、5μM和10μM。

(4)采用CTG(CELL TITER-GLO)发光法测定步骤(2)和步骤(3)得到的细胞活力，并计算相对细胞增殖量(即relative cell proliferation)。测定结果详见图1～图6。图1～图6中，“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01，“***”表示p<0.001。“WT”表示野生型SW480人结肠癌细胞。“KO”表示HUNK基因敲除SW480人结肠癌细胞。“siNC”表示转染siRNA的时候用随机siRNA作为靶标基因siRNA的对照细胞(即基因敲减的空白对照SW480人结肠癌细胞)。“si1”表示将野生型SW480人结肠癌的第一个HUNK靶点敲减后的细胞。“si2表示将野生型SW480人结肠癌的第二个HUNK靶点敲减后的细胞。“NEO”表示过表达基因全长载体的对照，它是不带基因的空白载体，即过表达HUNK的空白对照人结肠癌细胞。“OE”表示过表达HUNK的HT-29人结肠癌细胞。CTG发光法的测定原理如下：ATP(腺嘌呤核苷三磷酸，简称三磷酸腺苷)参与生物体内多种酶促反应，是活细胞新陈代谢的一个指标，其含量直接反应了细胞的数量及细胞状态；实验过程中向细胞培养基加入等体积CellTiter-Glo^TM试剂，测量发光值，在光信号和体系中，发光值与ATP量成正比，而ATP又和活细胞数正相关，因此可通过检测ATP含量得细胞活力；CellTiter-Glo^TM发光活细胞检测系统的检测试剂具有最高灵敏度和较长的信号持续时间，能够广泛地应用在生命科学研究领域中，如一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。相对细胞增殖量表示加药后的细胞相对于不加药的细胞的增值倍数，即为用加药处理后的细胞活力数值除以不加药细胞的细胞活力。

从图1～图6可以看出，HUNK基因敲除和HUNK基因敲减均能够显著降低结肠癌细胞对IGF1R抑制剂的抵抗，而过表达HUNK则显著上调结肠癌细胞对IGF1R抑制剂的抵抗。

实施例2

通过平板克隆验证HUNK对细胞克隆形成能力的影响，具体步骤如下：

(1)实验共分为8组，分别编号为1～8号。1号～4号在6孔板中进行。5号～8号在96孔板中进行。每个组3孔。向1号～2号的每孔中加入HUNK基因敲除的SW480人结肠癌细胞，向3号～4号的每孔中野生型的SW480人结肠癌细胞，每孔的细胞数为2000个。向5号～6号的每孔中加入HUNK基因敲除的SW480人结肠癌细胞，向7号～8号的每孔中野生型的SW480人结肠癌细胞，每孔的细胞数为5000个。向1号～4号的每孔中加入2mL、含体积百分含量为10％胎牛血清的DMEM培养基，5号～8号的每孔加入0.2mL、含体积百分含量为10％胎牛血清的DMEM培养基然后在37℃、5％二氧化碳下培养24h。

(2)向1号、3号、5号和7号的每孔中一次性加入1微升、最终浓度为10μM的DMSO(二甲亚砜)。向2号、4号、6号和8号的每孔中一次性加入1微升、最终浓度为10μM的OSI-906。在37℃、5％二氧化碳下培养9天。然后用体积百分含量为95％的乙醇的水溶液进行固定和染色，在显微镜下对克隆数进行计数并计算相对克隆数，采用球形相机计算三维球面积。其中，1号～4号的相对克隆数为1号～4号的克隆数分别与1号的克隆数的比值，5号～8号的相对克隆数为5号～8号的克隆数分别与5号的克隆数的比值。1号～4号的相对三维球面积为1号～4号的三维球面积分别与1号的三维球面积的比值，5号～8号的相对三维球面积为5号～8号的三维球面积分别与5号的三维球面积的比值。测定结果详见图7～图10。图7为实施例2中6孔板培养的各组细胞的照片。图8为实施例2中6孔板培养的各组细胞的克隆形成数的对比图。图9为实施例2中96孔板培养的各组细胞的照片。图10为实施例2中96孔板培养的各组细胞的相对三维球面积的比值的对比图。“WT”表示加入DMSO的野生型细胞。“KO”表示加入DMSO的HUNK基因敲除细胞。“WT-OSI-906”表示加入OSI-906的野生型细胞。“KO-OSI-906”表示加入OSI-906的HUNK基因敲除细胞。

从图7～图10可以看出，HUNK基因敲除显著下调了OSI906对细胞克隆形成和成球能力的影响。

实施例3

实验共分为4组，分别命名为WT组、KO组、WT-OSI-906组、KO-OSI-906组。每组五只重症免疫缺陷小鼠。向KO组和KO-OSI-906组的每只小鼠体内接种5×10⁶个HUNK基因敲除的SW480人结肠癌细胞。向WT组和WT-OSI-906组的每只小鼠体内接种5×10⁶个野生型的SW480人结肠癌细胞。无菌培养10天后，按照每kg小鼠灌胃60mg的OSI-906量，向WT-OSI-906组、KO-OSI-906组的每只小鼠均灌胃OSI-906。将4组小鼠继续无菌培养10天。每天取小鼠并处死，然后将肿瘤取出并测定肿瘤的体积。测定结果详见图11～图13。图11为各组小鼠灌胃后的肿瘤体积随培养时间的变化曲线对比图。图12为各组小鼠灌胃后肿瘤的照片，其中，对每隔两天的肿瘤进行拍照。图13为灌胃培养10天的各组小鼠的肿瘤体积对比图。“WT”表示未加入OSI-906的野生型细胞。“KO”表示未加入OSI-906的入DMSO的HUNK基因敲除细胞。“WT-OSI-906”表示加入OSI-906的野生型细胞。“KO-OSI-906”表示加入OSI-906的HUNK基因敲除细胞。

从图11～图13可以看出，KO-OSI-906组的肿瘤体积小于WT-OSI-906组的肿瘤体积，说明HUNK的敲除能够降低细胞对OSI-906的抑制，以使OSI-906能够更好地发挥抑制作用而降低肿瘤的形成。

实施例4

(1)实验分为7组，7组的细胞分别为野生型SW480人结肠癌细胞(即WT)、HUNK基因敲除SW480人结肠癌细胞(即KO)、转染siRNA的时候用随机siRNA作为靶标基因siRNA的对照细胞(即siNC)、将野生型SW480人结肠癌的第一个HUNK靶点敲减后的细胞(即si1)、将野生型SW480人结肠癌的第二个HUNK靶点敲减后的细胞(即si2)、过表达HUNK基因全长载体的对照细胞，它是不带基因的空白载体(即NEO)、过表达HUNK基因的野生型细胞(即OE)。

(2)将各组细胞贴壁培养48小时检测后，采用表2中HUNK引物对实时定量PCR检测各组细胞中HUNK基因表达量，并使用免疫印迹检测HUNK蛋白表达量；采用表2中IGF2R引物对实时定量PCR检测各组细胞中GADPH基因表达量，并使用免疫印迹检测IGF2R蛋白表达量；同时以GADPH为参比基因，采用表2中GADPH引物对实时定量PCR检测各组细胞中GADPH基因表达量，并使用免疫印迹检测GADPH蛋白表达量。其中，PCR反应体系如下：前引物0.5微升，后引物0.5微升，模板cDNA2微升，其余qpcr试剂及水补齐至20微升；PCR反应条件如下：95℃5分钟，循环95℃15秒和60℃30秒40次，随后95℃15秒，降温至60℃维持一分钟，随后升温至95℃维持15秒。

测定结果详见图14～图19。图14～图19中，“WT”表示野生型SW480人结肠癌细胞。“KO”表示HUNK基因敲除SW480人结肠癌细胞。“siNC”表示转染siRNA的时候用随机siRNA作为靶标基因siRNA的对照细胞。“si1”表示将野生型SW480人结肠癌的第一个HUNK靶点敲减后的细胞。“si2表示将野生型SW480人结肠癌的第二个HUNK靶点敲减后的细胞。“NEO”表示过表达基因全长载体的对照，它是不带基因的空白载体。“OE”表示过表达HUNK的野生型细胞。图14为实施例4中野生型的SW480人结肠癌细胞和HUNK基因敲除的SW480人结肠癌细胞的HUNK和IGF2R的基因表达量的对比图；图15为实施例4中SW480细胞系中HUNK敲减后IGF2R的mRNA表达检测结果，第一列为空白对照组，第二列和第三列为两个独立的HUNK的感染siRNA转染，空白对照组是指一段随机的siRNA序列，用于作为实验的阴性对照，他不产生任何作用，而实验组是对目标基因设计的一段siRNA序列，产生降低目标序列的表达；图16为实施例4中HT-29人结肠癌细胞、过表达HUNK的HT-29人结肠癌细胞的HUNK和IGF2R的基因表达量的对比图；图17为实施例4中野生型的SW480人结肠癌细胞和HUNK基因敲除的SW480人结肠癌细胞的HUNK、IGF2R和GADPH的蛋白表达量的对比图；图18为实施例4中SW480细胞系中HUNK敲减后IGF2R的蛋白表达检测结果，第一列为空白对照组，第二列和第三列为两个独立的HUNK的感染siRNA转染的对比图，空白对照组是指一段随机的siRNA序列，用于作为实验的阴性对照，他不产生任何作用，而实验组是对目标基因设计的一段siRNA序列，产生降低目标序列的表达；图19为实施例4中野生型的SW480人结肠癌细胞和HUNK基因敲除的SW480人结肠癌细胞的HUNK、IGF2R和GADPH的蛋白表达量的对比图。

表2实施例4所用引物对

从图14～图19可以看出，HUNK基因能够上调IGF2R基因的表达量。

实施例5

使用CAS9激活系统上调IGF2R的表达量，具体操作如下：通过sgRNA靶向IGF2R的启动子区，招募缺失突变失去切割DNA活性的dCAS9，在CAS9一端偶联VP64转录因子，从而靶向提高IGF2R的转录水平，提高表达量。使用shrna靶向IGF2R并降解IGF2R的mRNA从而敲减IGF2R表达量，然后将这些细胞系种到96孔板种，3000个细胞每孔，加入不同浓度OSI-906，处理5天后测量细胞活性，并计算相对细胞增殖量。更具体地，设计靶向IGF2R启动子区的sgRNA，随后将该sgRNA装载到CRISPR/Cas9 Synergistic Activation Mediator系统中，过表达三个CRISPR/Cas9 Synergistic Activation Mediator系统质粒，从而提高IGF2R的表达量。该系统包含三个质粒，分别是sgRNA-MS2质粒，dCas9-VP64质粒，MS2-P65-HSF1质粒。其中sgRNA-MS2为一段RNA，包含了靶向基因启动子的sgRNA和MS2环状RNA，dCAS9-VP64为突变型CAS9偶联VP64转录因子，MS2-P65-HSF1为MS2蛋白偶联P65和HSF1两个转录因子，dCAS9结合sgRNA从而将VP64转录因子结合到启动子区，MS2蛋白结合MS2环从而将P65和HSF1招募到启动子区，三个转录因子协同提高基因表达。

将HUNK敲除细胞系分为两组。一组在HUNK敲除细胞系中高表达IGF2R，具体地，使用IGF2R全长序列构建的慢病毒感染HUNK敲除细胞系得到IGF2R基因过表达的细胞系。另外一组在HUNK过表达细胞中敲减IGF2R，具体地，使用靶向IGF2R的干扰序列，并根据干扰序列设计互补配对的shRNA，再根据shRNA构建IGF2R基因慢病毒，然后感染HUNK敲除细胞系，得到IGF2R基因敲减的细胞系，HUNK敲除细胞系有两个IGF2R靶点；第一个IGF2R靶点的shRNA简称shIGF2R-1，其正义链和反义链的序列如SEQ ID No.9～SEQ ID No.10所示，如SEQ IDNo.9所示的序列为GATCCCGGACATCCAGCATCATATTCTCGAGAATATGATGCTGGATGTCCGGTTTTT，如SEQ ID No.10所示的序列为AATTAAAAACCGGACATCCAGCATCATATTCTCGAGAATATGATGCTGGATGTCCGG；第二个IGF2R靶点的shRNA简称shIGF2R-2，其正义链和反义链的序列如SEQ IDNo.11～SEQ ID No.12所示，如SEQ ID No.11所示的序列为GATCCCTGCAAGAAAGACATATTTACTCGAGTAAATATGTCTTTCTTGCAGGTTTTT，如SEQ ID No.12所示的序列为AATTAAAAACCTGCAAGAAAGACATATTTACTCGAGTAAATATGTCTTTCTTGCAGG。

向上述IGF2R基因过表达的细胞系和IGF2R敲减细胞系中均加入10uM的OSI-906进行处理，5天后测量细胞活性，以检测HUNK对OSI-906的抑制效果是否和IGF2R有关。测定结果详见图20～图23。图20～图23中，“sgRNA”表示空白对照的sgRNA。“sgIGF2R”表示靶向IGF2R启动子区的sgRNA。“shNC”表示敲减对照质粒。“shIGF2R1”表示靶向IGF2R的shRNA靶点1。“shIGF2R2”表示靶向IGF2R的shRNA靶点2。“WT sgRNA”表示HUNK野生型细胞中使用sgRNA提高IGF2R表达量的细胞。“KO sgRNA”表示HUNK敲除细胞中使用对照sgRNA的细胞。“KO sgIGF2R1”表示HUNK敲除细胞中使用sgRNA靶点1提高IGF2R表达量的细胞。“KOsgIGF2R2”表示HUNK敲除细胞中使用sgRNA靶点2提高IGF2R表达量的细胞。“NEO shNC”表示过表达对照SW480细胞中使用敲减对照质粒转染的细胞。“OE HUNK shNC”表示过表达HUNK细胞中使用敲减对照的质粒转染的细胞。“OE HUNK shIGF2R1”表示过表达HUNK细胞中使用shRNA靶点1敲减IGF2R的细胞。“OE HUNK shIGF2R2”表示过表达HUNK细胞中使用shRNA靶点2敲减IGF2R的细胞。

从图20～图23可以看出，IGF2R能够促进细胞对OSI-906抵抗，并且能够改变HUNK对OSI-906的抵抗。

实施例6

采用免疫印迹分别检测HUNK过表达SW480细胞系、HUNK敲除的SW480细胞系和HUNK敲减的SW480细胞中HUNK、AGAP3、MKK4、p-MKK4、ARF6、JNK、p-JNK、c-JUN、p-c-JUN、JIP4、IGF2R和GADPH的表达量。其中，免疫印迹条件如下：蛋白电泳2小时，蛋白转膜1小时，对应的蛋白一抗孵育过夜，对应的二抗孵育1小时，然后化学发光检测。测定结果详见图24～图27。

从图24～图27可以看出，HUNK能够结合AGAP3，而AGAP3、JIP4和ARF6结合能够改变HUNK对IGF2R的调控，进而说明HUNK、AGAP3、MKK4、p-MKK4、ARF6、JNK、p-JNK、c-JUN、p-c-JUN、JIP4、IGF2R均能够作为生物标志物，以用于评估IGF1R抑制剂对IGF1R的抑制作用。

实施例7

(1)实验分为两组，在96孔板中进行实验，每组3孔，其中一组为DMSO组，另一组为Lapatinib组。每孔接种2000个SW480细胞，培养24小时后，向DMSO组加入1微升、终浓度为10uM的DMSO溶液，向Lapatinib组加入1微升、终浓度为10μM的Lapatinib溶液，培养48小时，采用免疫印迹检测各组细胞中HER2、HUNK、AGAP3、MKK4、p-MKK4、ARF6、JNK、p-JNK、c-JUN、p-c-JUN、JIP4和GADPH的蛋白表达量，测定结果详见图28。图28为实施例7中HER2、HUNK、AGAP3、MKK4、p-MKK4、ARF6、JNK、p-JNK、c-JUN、p-c-JUN、JIP4和GADPH的蛋白表达量。

从图28可以看出，Lapatinib能够下调HER2、HUNK、AGAP3、MKK4、p-MKK4、ARF6、JNK、p-JNK、c-JUN、p-c-JUN、JIP4蛋白的表达。

(2)实验分为两个大组，其中一个大组为Lapatinib组，另一个大组为OSI-906(10μM)-Lapatinib组，每个大组分为六个小组。在96孔板中进行实验，每个小组3孔。每孔中加入3000个SW480细胞，贴壁培养24小时后，向OSI-906(10μM)-Lapatinib组的每孔中加入10μM的OSI-906，并且向每个大组的六个小组依次加入梯度浓度的Lapatinib，继续培养5天后，采用CTG方法测定细胞的活性。测定结果详见图29。图29为实施例6中Lapatinib组和OSI-906(10μM)-Lapatinib组的细胞活性对比图。图29中的“Relative cell proliferationg”是指相对细胞增值量，即相对细胞活性。

从图29可以看出，Lapatinib可以和OSI-906在结肠癌细胞系中产生联合使用而产生较好的持续性地细胞增值的效果。

(3)实验共分为4组，分别命名为Control组、OSI-906组、Lapatinib组、OSI-906-Lapatinib组。每组5只重症免疫缺陷小鼠。向OSI-906组、Lapatinib组、OSI-906-Lapatinib组的每只小鼠体内接种5×10⁶个SW480细胞。无菌培养10天后，按照每kg小鼠灌胃60mg的OSI-906量，向OSI-906组、OSI-906-Lapatinib组的每只小鼠均灌胃OSI-906。按照每kg小鼠灌胃60mg的Lapatinib量，向Lapatinib组、OSI-906-Lapatinib组的每只小鼠均灌胃Lapatinib。将4组小鼠继续无菌培养10天。每天取小鼠并处死，然后将肿瘤取出并测定肿瘤的体积。测定结果详见图30～图32。图30为实施例7中各组小鼠灌胃后的肿瘤体积随培养时间的变化曲线对比图。图31为实施例7中各组小鼠灌胃后肿瘤的照片，其中，对每隔两天的肿瘤进行拍照。图32为实施例7中灌胃培养10天的各组小鼠的肿瘤体积对比图。

从图30～图32可以看出，Lapatinib可以和OSI-906在结肠癌动物模型的治疗中联合使用而产生很好的效果。

实施例8

采用蛋白免疫印迹技术测定各细胞中各蛋白的表达量。

其中，SW480细胞敲减c-Jun蛋白(即c-Jun敲减的SW480细胞)的构建过程包括：使用靶向c-Jun的干扰序列，并根据干扰序列设计互补配对的shRNA，再根据shRNA构建c-Jun慢病毒，然后感染SW480细胞系，得到c-Jun敲减的细胞系。SW480细胞系有两个c-Jun靶点；第一个c-Jun靶点的shRNA简称shc-Jun-1，其正义链和反义链的序列如SEQ ID No.13～SEQID No.14所示，如SEQ ID No.13所示的序列为GATCCGCAAACCTCAGCAACTTCAACTCGAGTTGAAGTTGCTGAGGTTTGCGTTTTTG，如SEQ ID No.14所示的序列为AATTCAAAAACGCAAACCTCAGCAACTTCAACTCGAGTTGAAGTTGCTGAGGTTTGCG；第二个c-Jun靶点的shRNA简称shc-Jun-2，其正义链和反义链的序列如SEQ ID No.15～SEQ ID No.16所示，如SEQ ID No.15所示的序列为GATCCCTATCGACATGGAGTCTCAGCTCGAGCTGAGACTCCATGTCGATAGGTTTTTG，如SEQ ID No.16所示的序列为AATTCAAAAACCTATCGACATGGAGTCTCAGCTCGAGCTGAGACTCCATGTCGATAGG。

过表达HUNK蛋白的SW480细胞系中同时敲减MKK4的构建过程包括：使用靶向MKK4的siRNA转染过表达HUNK蛋白的SW480细胞系得到MKK4基因敲减的过表达HUNK蛋白的SW480细胞系，过表达HUNK蛋白的SW480细胞系有两个MKK4靶点；第一个MKK4靶点的siRNA简称siMKK4-1，其序列如SEQ ID No.17所示，即GCAACTGTGAAAGCACTAATT；第二个MKK4靶点的siRNA简称siMKK4-2，其序列如SEQ ID No.18所示，即CCCAAGCGCATCACGACAATT。

敲减IGF2R的SW480细胞的构建过程包括：使用靶向IGF2R的干扰序列，并根据干扰序列设计互补配对的shRNA，再根据shRNA构建IGF2R基因慢病毒，然后感染SW480细胞，得到IGF2R基因敲减的细胞系，SW480细胞有两个IGF2R靶点；第一个IGF2R靶点的shRNA简称shIGF2R-1，其正义链和反义链的序列如SEQ ID No.9～SEQ ID No.10所示，如SEQ ID No.9所示的序列为GATCCCGGACATCCAGCATCATATTCTCGAGAATATGATGCTGGATGTCCGGTTTTT，如SEQID No.10所示的序列为AATTAAAAACCGGACATCCAGCATCATATTCTCGAGAATATGATGCTGGATGTCCGG；第二个IGF2R靶点的shRNA简称shIGF2R-2，其正义链和反义链的序列如SEQ ID No.11～SEQ ID No.12所示，如SEQ ID No.11所示的序列为GATCCCTGCAAGAAAGACATATTTACTCGAGTAAATATGTCTTTCTTGCAGGTTTTT，如SEQ ID No.12所示的序列为AATTAAAAACCTGCAAGAAAGACATATTTACTCGAGTAAATATGTCTTTCTTGCAGG。

测定结果详见图33～图39。图33为SW480细胞敲减c-Jun蛋白后IGF2R的表达量的蛋白印迹图；图34为SW480细胞过表达c-Jun蛋白后IGF2R的表达量的蛋白印迹图；图35为过表达HUNK蛋白的SW480细胞系中同时敲减c-Jun后IGF2R的表达量的蛋白印迹图；图36为过表达HUNK蛋白的SW480细胞系使用JNK抑制剂后IGF2R的表达量的蛋白印迹图；图37为过表达HUNK蛋白的SW480细胞系中同时敲减MKK4后磷酸JNK和JNK,磷酸化c-Jun和c-Jun以及IGF2R的表达量的蛋白印迹图；图38为敲减IGF2R的SW480细胞系使用BMS-754807抑制剂的细胞活性；图39为过表达IGF2R的SW480细胞系使用BMS抑制剂的细胞活性图。

从图33可以看出，c-Jun敲减能够下调IGF2R表达量。从图34可以看出，c-Jun过表达能够上调IGF2R表达量。从图35可以看出，c-Jun敲减能够下调HUNK对IGF2R表达量的改变。从图36可以看出，JNK抑制剂能够下调HUNK过表达对IGF2R表达量的影响。从图37可以看出，MKK4的敲减能够下调HUNK过表达对IGF2R的表达量的影响。从图38～图39可以看出，IGF2R也能够促进SW480细胞对BMS-754807的抵抗。

综上，HUNK能够作为生物标志物以有效评估BMS抑制剂对IGF1R抑制作用，以能够用于制备检测IGF1R抑制剂的抗肿瘤效果的检测试剂盒或者检测IGF1R抑制剂的抗肿瘤效果的检测装置中的应用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所

<120> 生物标志物及其应用

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA