阅读说明：本技术 lncRNA IGFL2-AS1作为结肠癌诊断标志物的应用 (Application of lncRNA IGF L2-AS 1 AS colon cancer diagnosis marker ) 是由 李小俊 毕焕京 闫飞 李倩 于 2020-03-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种lncRNA IGFL2-AS1作为结肠癌诊断标志物的应用,属于肿瘤分子生物学领域。本发明提供的lncRNA IGFL2-AS1在结肠癌中呈现高水平表达,在结肠癌细胞恶性转化及肿瘤形成过程中发挥重要作用。人为敲低结肠癌细胞中的lncRNA IGFL2-AS1,能够明显抑制SW620细胞的增殖、迁移、侵袭能力和恶性程度,表明lncRNA IGFL2-AS1在结肠癌发病过程中发挥重要作用,可以作为诊疗结肠癌的新的分子标记和药物靶点。(The invention discloses an application of lncRNA IGF L-AS 1 AS a colon cancer diagnosis marker, belonging to the field of tumor molecular biology.A lncRNA IGF L2-AS 1 provided by the invention shows high-level expression in colon cancer and plays an important role in the processes of malignant transformation of colon cancer cells and formation of tumors.)

lncRNA IGFL2-AS1作为结肠癌诊断标志物的应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体地说，涉及一种lncRNA IGFL2-AS1作为结肠癌诊断标志物的应用。

背景技术

目前全球范围内，在恶性肿瘤中结直肠癌的发病率排第三位，而死亡率排第二位，被认为是对公共健康的主要威胁。由于不良的饮食方式和生活习惯，结肠癌的发病率和死亡率呈现明显上升的趋势，是最常见的胃肠道恶性肿瘤之一。在我国，结肠癌每年新增病例约17万左右，且患者发病年龄较年轻，对我国人民健康造成了极大的危害。结直肠癌变是一个多步骤的生物学过程，涉及到多个癌基因和抑癌基因的失调。尽管对结直肠癌这一疾病有了比较深入的了解，诊断技术也在不断地进展，治疗措施也越来越高效，但结直肠癌患者的总体生存率仍然相对较低。目前，伴随着结直肠癌日益增长的发病率和不良的预后，迫切需要更深入地了解结直肠癌致病过程中具体的分子机制，因为这可以促进发展更有效的治疗策略，最终改善病人的预后。

迄今为止，随着对全基因组和转录组测序技术的改进，人们发现大多数哺乳动物的全基因组可以进行转录，但是其中大部分的转录本都是受到一定限制的或者根本不具备蛋白质编码的能力，这些基因被称为ncRNA。lncRNA是由RNA聚合酶II(RNAPII)进行转录，长度超过200个核苷酸的非编码RNA，它们很少有或者几乎没有开放阅读框(ORFs)。目前大量的研究结果表明，lncRNA在胚胎发育、表观遗传沉默、转录和翻译控制、细胞的各种生物学行为和肿瘤发生等多种基本生物过程中发挥不可替代的作用。此外，广泛的研究也提供了强有力的证据，证明lncRNA在一系列人类疾病中发挥功能作用，包括各种类型的癌症，如乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胃癌等等。并且还发现许多lncRNA在肿瘤的发生发展过程中参与了致癌和抑癌的过程，比如，lncRNA MVIH可作为致癌基因促进非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭，相反的，lncRNA KCNK15-AS1被证明在非小细胞肺癌中作为抑癌基因起到保护作用。近期研究表明，lncRNA在结直肠癌的发生和发展过程中也扮演着调制器的角色，从而表明它们有作为新的治疗靶点的潜力。关于lncRNA在结直肠癌的形成和进展过程中的分子机制和生物学功能的研究还处于起步阶段，虽然迄今为止研究人员在阐明具体的分子机制方面的仅取得了有限的成果，但这些有限的研究也足以表明lncRNA是结直肠癌诊断和治疗的潜在生物靶点。

目前，关于lncRNA在结肠癌发生过程中的作用尚鲜有报道。因此，本发明通过检测结肠癌中lncRNA IGFL2-AS1的表达及功能，以期为结肠癌的治疗提供突破点。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种lncRNA IGFL2-AS1作为结肠癌诊断标志物的应用。

本发明所采用的技术方案如下：

lncRNA IGFL2-AS1作为结肠癌诊断标志物的应用。

进一步地，lncRNA IGFL2-AS1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

检测lncRNA IGFL2-AS1的试剂在制备结肠癌诊断检测试剂或试剂盒中的应用。

进一步地，检测试剂或试剂盒用于检测生物样品中lncRNA IGFL2-AS1的表达量。

进一步地，检测试剂或试剂盒包括：对lncRNA IGFL2-AS1具有检测特异性的PCR引物。

进一步地，对lncRNA IGFL2-AS1具有检测特异性的PCR引物如下：

上游引物：5’-TGCTGAGCAC AGACATGTGA-3’；

下游引物：5’-GTGCTGCAGA ATCAACGACC-3’。

一组针对lncRNA IGFL2-AS1基因靶点的干扰RNA，lncRNA IGFL2-AS1基因靶点的序列如SEQ ID NO：1所示，干扰RNA包括siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3中的至少一种。

进一步地，siRNA-1的序列为：5’-AAAAUUGGUGAGAAGUUCCUU-3’。

进一步地，siRNA-2的序列为：5’-UAAAAUUGGUGAGAAGUUCCU-3’。

进一步地，siRNA-3的序列为：5’-ACUUCUUCAUUCUUGUUGGCU-3’。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供的lncRNA IGFL2-AS1在结肠癌中呈现高水平表达，在结肠癌细胞恶性转化及肿瘤形成过程中发挥重要作用。人为敲低结肠癌细胞中的lncRNA IGFL2-AS1，能够明显抑制SW620细胞的增殖、迁移、侵袭能力和恶性程度，表明lncRNA IGFL2-AS1在结肠癌发病过程中发挥重要作用，可以作为诊疗结肠癌的新的分子标记和药物靶点。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为Real-time PCR检测lncRNA IGFL2-AS1在结肠癌及癌旁组织中的表达情况；

图2为敲低lncRNA IGFL2-AS1的SW620细胞系中lncRNA IGFL2-AS1的表达情况；

图3为敲低lncRNA IGFL2-AS1的SW620细胞系的CCK-8增殖情况；

图4为敲低lncRNA IGFL2-AS1的SW620细胞系的细胞迁移结果；

图5为敲低lncRNA IGFL2-AS1的SW620细胞系的细胞侵袭实验结果。

具体实施方式

本发明利用荧光定量PCR实验研究lncRNA IGFL2-AS1在结肠癌中的表达量明显高于癌旁组织。提取结肠癌及癌旁组织的总RNA，反转录合成cDNA，设计lncRNA IGFL2-AS1PCR引物进行PCR扩增，首次克隆获得lncRNA IGFL2-AS1基因。

通过设计siRNA，以获得敲低lncRNA IGFL2-AS1的SW620结肠癌细胞系，研究lncRNA IGFL2-AS1对SW620细胞增殖、迁移、侵袭以及恶性程度的影响，从而探讨lncRNAIGFL2-AS1在结肠癌发病过程中的作用，及其作为新的肿瘤标记物在结肠癌临床诊断、治疗和药物开发中的应用。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

下列实施案例中若无特殊说明，所用技术手段为本领域技术人员熟知的常规手段。

实施例1：lncRNA IGFL2-AS1的Real-time PCR检测

提取总RNA：

从结肠癌组织样本及癌旁组织样本，加入1mL Reagent后置于室温(15～30℃)使核蛋白复合物完全分离。5min后加入0.2mL氯仿，盖好管盖，手持剧烈振荡15s，室温放置2～3min。于2～8℃条件下以12 000g离心15min，将上层无色水相转移至另一个1.5mL Eppendorf管。加入0.5mL异丙醇，室温放置10min。于2～8℃条件下以12 000g离心10min，弃去上清。用1mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀，旋涡混合器混合。于2～8℃条件下以7500g离心5min，弃去上清。空气干燥5～10min后用无RNA酶的ddH₂O溶解RNA，微量加样器反复吹吸并置于55～60℃温育10min，促进RNA溶解。于260nm测定RNA浓度，提取的RNA可置于-70℃保存。

引物设计：

根据lncRNA IGFL2-AS1的转录本序列，通过NCBI的引物设计工具(Primer BLAST)设计引物。

上游引物：5’-TGCTGAGCAC AGACATGTGA-3’；如SEQ ID NO：2所示。

下游引物：5’-GTGCTGCAGA ATCAACGACC-3’；如SEQ ID NO：3所示。

反转录反应:

以提取的总RNA(1μg)为模板，加入以下反应体系，具体为：Buffer 4μL，RT Enzyme Mix 1μL，Oligo dT Primer(50μM)1μL，Random6mers(100μM)1μL，以无RNA酶的ddH₂O将反应体积补足为20μL。

将上述混合液置于37℃15min，85℃5s，即获得cDNA。该cDNA可用于lncRNA Real-time PCR检测。

Real-time PCR检测：

按日本Takara公司的Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)试剂盒推荐的引物最适浓度(10μM)，将lncRNA IGFL2-AS1的Real-time PCR特异性引物以去离子水溶解，并建立以下反应体系：SYBR Premix Ex TaqTM(2×)25μL，ROX Reference Dye(50×)1μL，PCR Forward Primer(10μM)1μL，PCR Reverse Primer(10μM)1μL，cDNA 4μL，灭菌ddH₂O18μL。以95℃20s预变性，按95℃10s变性、60℃20s退火、70℃10s延伸过程循环40次，获得Ct值。获得的Ct值按Applied Biosystem公司ABI PRISM 7300Sequence Detection SystemUser Bulletin#2推荐方法进行计算。

结果证实lncRNA IGFL2-AS1在结肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织(图1)，提示lncRNA IGFL2-AS1可能参与调控结肠癌的发生过程。

实施案例2：癌细胞lncRNA IGFL2-AS1敲低

选择SW620细胞系用来做lncRNA IGFL2-AS1的敲低实验，并检测敲低后的相关基因表达和细胞迁移能力。

lncRNA IGFL2-AS1的敲低：

lncRNA IGFL2-AS1的敲低使用siRNA的方法来实现，具体方法如下：六孔板铺上细胞，第二天长满培养板50％时，用Opti-MEM饥饿30min；

取2.5nmol siRNA/NC用125μL DEPC水溶解，每个孔的取量为10μL。取两个管标号A、B，每管加入100μL Opti-MEM；A管加入10μL lipofectamine 3000，B管中加入siRNA或者NC 10μL，分别混匀室温静置5min。将AB两管充分混匀，静置15min加入到六孔板中，转染6-8h。

本发明在研究中使用的siRNA，序列如下：

5’-AAGGAACTTCTCACCAATTTTAA-3’

siRNA-1：5’-AAAAUUGGUGAGAAGUUCCUU-3’，如SEQ ID NO：4所示；

5’-AGGAACTTCTCACCAATTTTAAA-3’

siRNA-2：5’-UAAAAUUGGUGAGAAGUUCCU-3’，如SEQ ID NO：5所示；

5’-AGCCAACAAGAATGAAGAAGTGG-3’

siRNA-3：5’-ACUUCUUCAUUCUUGUUGGCU-3’，如SEQ ID NO：6所示。

图2显示，将以上三种siRNA转入SW620细胞系后，细胞系中的lncRNA IGFL2-AS1表达量发生降低。应用siRNA-1和siRNA-2进行后续实验。

实施案例3：CCK-8实验

以1×10⁵个/孔细胞数将SW620细胞接种于12孔板中，37℃5％CO₂培养，次日当细胞长至70％汇合度时，去除原培养基，加入细胞，24h后胰酶消化，以3 000个/孔细胞数接种于96孔板中，每组设5个复孔。分别在培养1-7d后向每孔加入10μl CCK-8，继续培养1h，以空白孔调零，波长为450nm，用全自动酶标读数仪上检测OD值。

结果如图3所示，与未被敲低的肿瘤细胞相比，转入了siRNA的细胞增殖能力降低。

实施案例4：肿瘤细胞的迁移能力测试

对肿瘤细胞进行划痕实验，具体方法如下：

转染后的细胞长满培养板80-90％，用合适大小的枪头划出两条垂直的划痕。无血清培养液培养，观察0h、48h后划痕的愈合情况(细胞向中间迁移情况)；

结果如图4所示，与未被敲低的肿瘤细胞相比，转入了siRNA的细胞迁移能力降低。

实施案例5：Transwell侵袭实验

将基质胶和DMEM培养基按1：8配成基质胶-DMEM混合液，置于冰上备用。将Transwell小室置于24孔板中，下室为500μl DMEM培养基，每个小室加入60μl基质胶-DMEM混合液，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养5h。

将细胞用DMEM培养基配制成5×10⁵个/ml的细胞悬液，每个小室加入100μl细胞悬液，即每孔5×10⁴个细胞，每组设置3复孔。将24孔板放入细胞培养箱，于12h后取出小室染色固定，显微镜下拍照计数，通过观察进入下室的细胞数量证明细胞侵袭情况。

结果如图5所示，与未被敲低的肿瘤细胞相比，转入了siRNA的细胞侵袭能力降低。

上述结果表明，lncRNA IGFL2-AS1的敲减能够明显抑制结肠癌细胞SW620的增殖、迁移、侵袭能力，说明结肠癌中低水平表达的lncRNA IGFL2-AS1参与调控肿瘤发生的多个过程，而且具有促结肠癌变的潜能，为结肠癌的诊断和治疗提供了新的分子标记和药物靶标。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。