阅读说明：本技术 治疗肌营养不良症的方法 (Method of treating muscular dystrophy ) 是由 E.M.凯 于 2018-08-31 设计创作，主要内容包括：本披露尤其提供用于治疗肌营养不良症的改进的组合物和方法。例如,本披露提供通过施用有效量的戈罗迪生来治疗具有适合于外显子53跳跃的DMD基因突变的杜氏肌营养不良症患者的方法。(The present disclosure provides, among other things, improved compositions and methods for treating muscular dystrophy. For example, the present disclosure provides a method of treating a patient with duchenne muscular dystrophy having DMD gene mutations suitable for exon 53 skipping by administering an effective amount of golidesne.)

治疗肌营养不良症的方法

技术领域

本发明涉及治疗患者的肌营养不良症的改进方法。其还提供适合用于促进人肌养蛋白基因中外显子53跳跃的组合物。

背景技术

在多种遗传疾病中，突变对基因最终表达的效应可以通过在剪接过程期间靶向外显子跳跃的过程来调节。在正常功能蛋白由于其中的突变而过早终止的情况下，通过反义技术恢复一些功能蛋白产生的手段已证明可能通过在剪接过程期间进行干预，并且如果与致病突变相关的外显子可以从一些基因特异性地缺失，则有时可以产生缩短的蛋白质产物，所述缩短的蛋白质产物具有与天然蛋白质相似的生物特性或具有足够的生物活性以改善由与外显子相关的突变引起的疾病(参见例如，Sierakowska,Sambade等人1996；Wilton,Lloyd等人1999；van Deutekom,Bremmer-Bout等人2001；Lu,Mann等人2003；Aartsma-Rus,Janson等人2004)。

杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy(DMD))由蛋白质肌养蛋白的表达缺陷引起。肌养蛋白是一种杆状细胞质蛋白，并且是通过细胞膜将肌肉纤维的细胞骨架与周围细胞外基质连接起来的蛋白质复合物的重要部分。肌养蛋白在肌肉纤维中起着重要的结构作用，连接细胞外基质和细胞骨架。N端区域结合肌动蛋白，然而C端末端是肌养蛋白糖蛋白复合物(DGC)的一部分，该肌养蛋白糖蛋白复合物跨越肌纤维膜。已表明，mdx小鼠的肌养蛋白缺陷的肌肉纤维展现出对收缩诱导的肌肉纤维膜破裂的易感性增加(参见Petrof等人1993；Cirak等人2012)。

编码该蛋白质的基因含有79个外显子，分布在DNA的超过200万个核苷酸中。任何外显子突变(这些突变改变外显子的阅读框、或者引入终止密码子、或者特征在于去除一个或多个完整框外(out of frame)外显子或复制一个或多个外显子)都有可能破坏功能性肌养蛋白的产生，从而导致DMD。

可以在出生时记录到疾病发作，伴有肌酸激酶水平升高，并且在生存的第一年可能存在显著的运动缺陷。到七岁或八岁时，患有DMD的大多数患者步态愈来愈缓慢，并且正在丧失从地面站起身和爬楼梯的能力；到10岁至14岁时，大多数都依赖轮椅。DMD都是致命的；受影响个体通常在他们十几岁后期或二十岁出头时死于呼吸和/或心力衰竭。DMD的持续进展允许在疾病的所有阶段进行治疗性干预；然而，治疗目前仅限于糖皮质激素，其与许多副作用相关，包括体重增加、行为改变、青春期变化、骨质疏松症、类库欣氏症面容(Cushingoid facies)、生长抑制和白内障。因此，开发更好的疗法来治疗此疾病的基本病因势在必行。

已发现出现了一种不太严重的肌营养不良症，即贝克肌营养不良症(Beckermuscular dystrophy(BMD))，其中突变(通常是一个或多个外显子的缺失)导致沿着整个肌养蛋白转录物的正确阅读框，使得mRNA至蛋白质的翻译不会过早终止。如果在突变的肌养蛋白前体mRNA的加工中上游和下游外显子的连接维持了该基因的正确阅读框，则结果是编码具有短的内部缺失的蛋白质的mRNA保留了一些活性，从而导致贝克(Becker)表型。

多年来，已知不改变肌养蛋白蛋白质的阅读框的一个或多个外显子的缺失将产生BMD表型，然而导致框移的外显子缺失将产生DMD(Monaco,Bertelson等人1988)。一般而言，改变阅读框并且因此中断正确的蛋白质翻译的肌养蛋白突变(包括点突变和外显子缺失)导致DMD。还应注意，一些BMD和DMD患者具有覆盖多个外显子的外显子缺失。

最近，测试剪接开关寡核苷酸(SSO)用于治疗DMD的安全性和功效的临床试验是基于SSO技术通过剪接体的空间阻断诱导前体mRNA的替代性剪接(Cirak等人,2011；Goemans等人,2011；Kinali等人,2009；van Deutekom等人,2007)。然而，尽管这些试验获得成功，但可用于治疗DMD的药理学选项仍是有限的。

因此，仍需要用于产生肌养蛋白和治疗患者的肌营养不良症(如DMD和BMD)的改进的组合物和方法。

发明内容

本披露至少部分是基于显示用外显子53跳跃反义寡核苷酸(戈罗迪生(golodirsen))治疗使患者的肌养蛋白蛋白质显著增加超过基线的临床证据。此外，观察到外显子跳跃与从头合成肌养蛋白蛋白质之间的正相关。

因此，在一些方面，本披露提供用于治疗有需要的患者的杜氏肌营养不良症(DMD)的方法，该患者具有适合于外显子53跳跃的DMD基因突变，该方法包括向该患者施用一定剂量的戈罗迪生或其药学上可接受的盐。

在一些方面，本披露提供用于恢复mRNA阅读框以在患有杜氏肌营养不良症(DMD)的有需要的患者中诱导外显子跳跃的方法，该患者具有适合于外显子53跳跃的DMD基因突变，该方法包括向该患者施用一定剂量的戈罗迪生或其药学上可接受的盐。

在一些方面，本披露提供用于增加患有杜氏肌营养不良症(DMD)的有需要的患者的肌养蛋白产生的方法，该患者具有适合于外显子53跳跃的DMD基因突变，该方法包括向该患者施用一定剂量的戈罗迪生或其药学上可接受的盐。

在一些方面，该剂量以4mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg或50mg/kg患者体重的剂量施用。

在一些方面，将剂量以单剂量施用。在一些方面，将剂量每周施用一次。在一些方面，剂量是静脉内施用的。在一些方面，剂量是通过输注静脉内施用的。在一些方面，剂量是通过输注经35-60分钟的时段静脉内施用的。在一些方面，剂量是通过皮下注射静脉内施用的。

在一些方面，患者为至多40岁、至多30岁或至多21岁。在一些方面，患者为1岁至21岁。在一些方面，患者为5岁至21岁。在一些方面，患者为6岁至15岁。

在一些方面，本披露提供根据前述或相关方面中的任一者的方法，其中该患者具有选自下组的DMD基因突变，该组包括：外显子3至52、4至52、5至52、6至52、9至52、10至52、11至52、13至52、14至52、15至52、16至52、17至52、19至52、21至52、23至52、24至52、25至52、26至52、27至52、28至52、29至52、30至52、31至52、32至52、33至52、34至52、35至52、36至52、37至52、38至52、39至52、40至52、41至52、43至52、42至52、45至52、47至52、48至52、49至52、50至52、54至58、54至61、54至63、54至64、54至66、54至76、54至77、和外显子52。

在一些方面，本披露提供根据前述或相关方面中的任一者的方法，其中向该患者长期施用戈罗迪生。在一些方面，向该患者施用戈罗迪生持续至少48周。在一些方面，向该患者施用戈罗迪生持续超过一年、超过两年、超过三年、超过四年、超过五年、超过十年、超过二十年或超过三十年。

在一些方面，本披露提供根据前述或相关方面中的任一者的方法，其中该患者在施用戈罗迪生之前接受稳定剂量的皮质类固醇持续至少6个月。在一些方面，该患者在施用戈罗迪生之前接受稳定剂量的皮质类固醇持续至少6个月并且在施用戈罗迪生期间保持接受皮质类固醇。

在一些方面，本披露提供根据前述或相关方面中的任一者的方法，其中将戈罗迪生或其药学上可接受的盐配制为药物组合物。在一些方面，将戈罗迪生或其药学上可接受的盐配制为具有50mg/mL强度的药物组合物。在一些方面，将戈罗迪生或其药学上可接受的盐配制为具有50mg/mL强度并且以100mg/2mL的剂型存在的药物组合物。在一些方面，将戈罗迪生或其药学上可接受的盐配制为具有50mg/mL强度并且以500mg/2mL的剂型存在的药物组合物。在一些方面，将该剂型容纳在单次使用小瓶中。

在一些方面，将戈罗迪生或其药学上可接受的盐配制为包含戈罗迪生或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些方面，该药学上可接受的载体是磷酸盐缓冲溶液。

在一些方面，本披露提供根据前述或相关方面中的任一者的方法，其中通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)来测量外显子跳跃。

在一些方面，本披露提供根据前述或相关方面中的任一者的方法，其中该方法增加患者的肌养蛋白产生。在一些方面，通过蛋白质印迹分析来测量肌养蛋白产生。在一些方面，通过免疫组织化学(IHC)来测量肌养蛋白产生。

在一些方面，本披露提供根据前述或相关方面中的任一者的方法，该方法进一步包括在施用戈罗迪生之前确认患者具有适合于外显子53跳跃的DMD基因突变。

在一些方面，本披露提供戈罗迪生或其药学上可接受的盐，用于治疗有需要的患者的杜氏肌营养不良症(DMD)，该患者具有适合于外显子53跳跃的DMD基因突变，其中该治疗包括向该患者每周一次施用单次静脉内剂量的30mg/kg依特立生(eteplirsen)。

在一些方面，本披露提供戈罗迪生或其药学上可接受的盐，用于恢复mRNA阅读框以在患有杜氏肌营养不良症(DMD)的有需要的患者中诱导外显子跳跃，该患者具有适合于外显子53跳跃的DMD基因突变，其中该治疗包括向该患者每周一次施用单次静脉内剂量的30mg/kg依特立生。

在一些方面，本披露提供戈罗迪生或其药学上可接受的盐，用于增加患有杜氏肌营养不良症(DMD)的有需要的患者的肌养蛋白产生，该患者具有适合于外显子53跳跃的DMD基因突变，其中该治疗包括向该患者每周一次施用单次静脉内剂量的30mg/kg依特立生。

附图说明

图1是DMD患者研究设计中SRP-4053的I/II期研究的流程图概述。

图2描绘上述研究中25名患者中的每一名的RT-PCR数据(基线和在SRP-4053治疗后48周)。

图3描绘上述研究中25名患者中的每一名的蛋白质印迹数据(基线和在SRP-4053治疗后48周)。

图4A描绘来自基线和治疗中的单个患者(实例1)的肌肉活检针对层黏连蛋白进行染色以显示总肌肉纤维的免疫荧光染色。

图4B描绘来自图4A的肌肉活检的切片(1-3)针对肌养蛋白进行染色的免疫荧光染色。

图5A描绘来自基线和治疗中的单个患者(实例2)的肌肉活检针对层黏连蛋白进行染色以显示总肌肉纤维的免疫荧光染色。

图5B描绘来自图5A的肌肉活检的切片(1-3)针对肌养蛋白进行染色的免疫荧光染色。

具体实施方式

本披露的实施例涉及通过施用特异性设计以诱导人肌养蛋白基因的外显子53跳跃的反义寡核苷酸(戈罗迪生)来治疗肌营养不良症(如DMD)的方法。肌养蛋白在肌肉功能中起着重要的作用，并且多种肌肉相关疾病的特征在于这种基因的突变形式。因此，在某些实施例中，可以将本文所述的方法用于诱导人肌养蛋白基因的突变形式(如DMD中发现的突变肌养蛋白基因)的外显子53跳跃。

因此，本披露涉及通过诱导患者的外显子53跳跃来治疗肌营养不良症(如DMD)的方法。此外，本披露涉及用于恢复mRNA阅读框以在患有DMD的患者中诱导外显子跳跃的方法。本披露还涉及用于增加患有DMD的患者中的肌养蛋白产生的方法。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。虽然与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但是描述了优选的方法和材料。出于本发明的目的，以下术语定义如下。

I.定义

“约”意指相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度，数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化至多30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

如本文所用，关于受试者或患者“适合于外显子53跳跃”旨在包括具有肌养蛋白基因的一个或多个突变的受试者和患者，所述肌养蛋白基因在不存在肌养蛋白基因的外显子53跳跃的情况下导致阅读框在框外，从而破坏前体mRNA翻译，导致受试者或患者不能产生肌养蛋白。肌养蛋白基因的以下外显子突变的非限制性实例适合于外显子53跳跃，包括例如以下的缺失：外显子3至52、4至52、5至52、6至52、9至52、10至52、11至52、13至52、14至52、15至52、16至52、17至52、19至52、21至52、23至52、24至52、25至52、26至52、27至52、28至52、29至52、30至52、31至52、32至52、33至52、34至52、35至52、36至52、37至52、38至52、39至52、40至52、41至52、43至52、42至52、45至52、47至52、48至52、49至52、50至52、54至58、54至61、54至63、54至64、54至66、54至76、54至77、或外显子52。确定患者是否具有适合于外显子跳跃的肌养蛋白基因突变完全在本领域技术人员的能力范围内(参见例如Aartsma-Rus等人(2009)Hum Mutat.[人类突变]30:293-299，Gurvich等人,Hum Mutat.[人类突变]2009；30(4)633-640，以及Fletcher等人(2010)Molecular Therapy[分子疗法]18(6)1218-1223)。

术语“反义寡聚物”和“反义化合物”和“反义寡核苷酸”和“寡聚物”和“寡核苷酸”在此披露中可互换使用，并且是指通过亚基间的键而连接的环状亚基序列，其中各个环状亚基由以下组成：(i)核糖或其衍生物；以及(ii)与其结合的碱基配对部分，使得碱基配对部分的顺序形成通过沃森-克里克碱基配对(Watson-Crick base pairing)与核酸(通常RNA)中的靶序列互补的碱基序列，从而在靶序列内形成核酸:寡聚物异双链体。在某些实施例中，寡聚物是PMO。在其他实施例中，反义寡核苷酸是2’-O-甲基硫代磷酸。在其他实施例中，本披露的反义寡核苷酸是肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或桥接核酸(BNA)(如2'-O,4'-C-乙烯桥接核酸(ENA))。

术语“互补的”和“互补性”是指通过沃森-克里克碱基配对规则彼此相关的两个或更多个寡聚物(即，各自包含核碱基序列)。例如，核碱基序列“T-G-A(5’→3’)”与核碱基序列“A-C-T(3’→5’)”互补。互补性可以是“部分的”，其中根据碱基配对规则，少于给定核碱基序列的所有核碱基与另一核碱基序列匹配。例如，在一些实施例中，给定核碱基序列与另一核碱基序列之间的互补性可以是约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。或者，在给定核碱基序列与另一核碱基序列之间可能存在“完全的”或“完美的”(100％)互补性，以继续该实例。核碱基序列之间的互补性程度对于序列之间杂交的效率和强度具有显著的作用。

“肌养蛋白”是一种杆状细胞质蛋白，并且是通过细胞膜将肌肉纤维的细胞骨架与周围细胞外基质连接起来的蛋白质复合物的重要部分。肌养蛋白含有多个功能结构域。例如，肌养蛋白含有在约氨基酸14-240处的肌动蛋白结合结构域和在约氨基酸253-3040处的中心杆结构域。此大的中心结构域由约109个氨基酸的24个血影蛋白样三螺旋元件形成，其与α-辅肌动蛋白和血影蛋白具有同源性。重复序列通常掺杂有四个富含脯氨酸的非重复序列区段，也称为铰链区。重复序列15和16被18个氨基酸的延伸段(18amino acid stretch)分开，所述延伸段似乎为肌养蛋白的蛋白水解切割提供主要位点。大部分重复序列之间的序列同一性范围介于10％-25％。一个重复序列含有三个α-螺旋：1、2和3。α-螺旋1和3各自由7个螺旋转角形成，可能通过疏水界面作为卷曲螺旋相互作用。α-螺旋2具有更复杂的结构并且由被甘氨酸或脯氨酸残基分开的四个和三个螺旋转角的区段形成。各个重复序列由两个外显子编码，所述外显子通常在α-螺旋2的第一部分中的氨基酸47与48之间掺杂有内含子。另一内含子发现于重复序列中的不同位置处，通常分散在螺旋-3上。肌养蛋白还在约氨基酸3080-3360处含有富含半胱氨酸的结构域)，包括富含半胱氨酸的区段(即280个氨基酸中的15个半胱氨酸)，所述区段显示与粘液菌(盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum))α-辅肌动蛋白的C端结构域同源。羧基端结构域在约氨基酸3361-3685处。

肌养蛋白的氨基端结合F-肌动蛋白，并且羧基端结合肌纤维膜处的肌养蛋白相关蛋白质复合物(DAPC)。DAPC包括肌养蛋白聚糖、肌聚糖、整合素和小窝蛋白，并且这些组分中的任一者的突变导致常染色体遗传性肌营养不良症。当肌养蛋白不存在时，DAPC不稳定，这导致成员蛋白水平降低，并且转而导致进行性纤维损伤和膜渗漏。在各种形式的肌营养不良症(如杜氏肌营养不良症(DMD)和贝克肌营养不良症(BMD))中，肌肉细胞产生改变的且功能缺陷形式的肌养蛋白，或根本不产生肌养蛋白，主要归因于导致错误剪接的基因序列突变。如上所述，主要表达缺陷型肌养蛋白蛋白质或完全缺乏肌养蛋白或肌养蛋白样蛋白质导致肌肉退化的快速进展。在这方面，“缺陷型”肌养蛋白蛋白质的特征可能在于在某些DMD或BMD受试者中产生的肌养蛋白的形式(如本领域中已知的)，或不存在可检测的肌养蛋白。

“外显子”是指编码蛋白质的核酸的限定部分，或在加工前(或前体)RNA的任一部分已通过剪接去除之后以RNA分子的成熟形式呈现的核酸序列。成熟RNA分子可以是信使RNA(mRNA)或非编码RNA(如rRNA或tRNA)的功能形式。人肌养蛋白基因具有约79个外显子。

“内含子”是指未翻译成蛋白质的核酸区域(在基因内)。内含子是被转录成前体mRNA(前体mRNA)并且随后在成熟RNA形成期间通过剪接去除的非编码部分。

“有效量”或“治疗有效量”是指作为单剂量或作为一系列剂量的一部分施用至哺乳动物受试者的有效产生所需治疗效果的治疗性化合物(如反义寡聚物，包括例如戈罗迪生)的量。对于反义寡聚物，这种效果可以通过抑制选定靶序列的翻译或天然剪接加工、或外显子跳跃以增加肌养蛋白产生来实现。

在一些实施例中，有效量是至少约4mg/kg、至少10mg/kg或至少20mg/kg反义寡聚物或包括反义寡聚物的组合物，持续一段时间以治疗受试者。在一些实施例中，有效量是至少约4mg/kg、至少10mg/kg或至少20mg/kg反义寡聚物或包括反义寡聚物的组合物，以增加受试者的肌养蛋白阳性纤维的数目。在各种实施例中，有效量是至少约4mg/kg、至少10mg/kg至约20mg/kg、20mg/kg至约30mg/kg、约25mg/kg至约30mg/kg、或约30mg/kg至约50mg/kg。在一些实施例中，有效量是约30mg/kg或约50mg/kg。

在各种实施例中，有效量是至少约4mg/kg、至少10mg/kg或至少20mg/kg反义寡聚物或包括反义寡聚物的组合物，以增加受试者的肌养蛋白产生。在各种实施例中，有效量是至少约4mg/kg、至少10mg/kg至约20mg/kg、20mg/kg至约30mg/kg、约25mg/kg至约30mg/kg、或约30mg/kg至约50mg/kg。在一些实施例中，有效量是约30mg/kg或约50mg/kg。

在某些实施例中，有效量是至少约4mg/kg、至少10mg/kg或至少20mg/kg反义寡聚物或包括反义寡聚物的组合物，以相对于健康同龄人，在患者中例如在6MWT中稳定、维持或改进始于20％逆差的行走距离。在各种实施例中，有效量是至少约4mg/kg、至少10mg/kg至约20mg/kg、20mg/kg至约30mg/kg、约25mg/kg至约30mg/kg、或约30mg/kg至约50mg/kg。在一些实施例中，有效量是约30mg/kg或约50mg/kg。

在某些实施例中，有效量是至少约4mg/kg、10mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、或约30mg/kg至约50mg/kg，持续至少24周、至少36周或至少48周，从而增加受试者的肌养蛋白阳性纤维的数目。在某些实施例中，受试者的肌养蛋白阳性纤维的增加是正常的至少20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％。在一些实施例中，治疗使患者中的肌养蛋白阳性纤维的数目增加至正常的20％-60％或30％-50％。

在某些实施例中，有效量是至少约4mg/kg、至少约10mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、或约30mg/kg至约50mg/kg，持续至少24周、至少36周或至少48周，以相对于健康同龄人，在患者中例如在6MWT中稳定或改进始于20％逆差的行走距离。

在各种实施例中，有效量是至少约4mg/kg、至少约10mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、或约30mg/kg至约50mg/kg，持续至少24周、至少36周或至少48周，从而增加患者的肌养蛋白产生。在一些实施例中，相对于健康同龄人，增加的肌养蛋白产生是约0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.7％、0.9％、1％、1.01％、1.5％、2％、2.01％、2.5％、3％、3.01％、3.5％、4％、4.01％、4.5％、5％、5.01％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、40％、45％、50％、55％或60％。在某些实施例中，相对于健康同龄人，肌养蛋白产生的增加可以为约0.1％至0.5％、0.5％至0.9％、0.8％至1％、0.9％至1.2％、0.9％至1.0％、0.9％至1.01％、1％至1.01％、1％至1.5％、1.5％至2％、1.9％至2.0％、1.9％至2.01％、2％至2.01％、2％至2.5％、2.5％至3％、2.9％至3.0％、2.9％至3.01％、2％至3.01％、3％至3.5％、3.5％至4％、4％至4.5％、4.5％至5％、5％至6％、6％至7％、7％至8％、8％至9％、9％至10％、1％至2％、1％至3％、1％至5％、2％至4％、2％至5％、4％至6％、5％至8％、8％至10％、1％至5％、2％至6％、3％至7％、4％至8％、5％至10％、10％至12％、12％至15％、15％至20％、17％至20％、20％至22％、20％至25％、25％至30％、或30％至35％。

“增强(enhance/enhancing)”或“增加(increase/increasing)”或“刺激(stimulate/stimulating)”一般是指与由无反义寡核苷酸或对照化合物引起的反应相比，一种或多种反义寡核苷酸(包括例如戈罗迪生)或其药物组合物在细胞或受试者中产生或引起更大的生理反应(即下游效应)的能力。可测量的生理反应可以包括肌养蛋白蛋白质的功能性形式的表达(或产生)增加、或肌肉组织中的肌养蛋白相关生物活性增加、以及从本领域的理解和本文的描述变得清楚的其他反应。还可以测量增加的肌肉功能，包括肌肉功能增加或改进约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。还可以测量表达功能性肌养蛋白的肌肉纤维的百分比，包括在约1％、2％、5％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的肌肉纤维中的肌养蛋白表达增加。例如，已显示，如果25％-30％的纤维表达肌养蛋白，则可以发生约40％的肌肉功能改进(参见例如DelloRusso等人,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]99:12979-12984,2002)。在一些实施例中，相对于健康同龄人，增加的肌养蛋白产生是约0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.7％、0.9％、1％、1.01％、1.5％、2％、2.01％、2.5％、3％、3.01％、3.5％、4％、4.01％、4.5％、5％、5.01％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、40％、45％、50％、55％或60％。在某些实施例中，相对于健康同龄人，肌养蛋白产生的增加可以为约0.1％至0.5％、0.5％至0.9％、0.8％至1％、0.9％至1.2％、0.9％至1.0％、0.9％至1.01％、1％至1.01％、1％至1.5％、1.5％至2％、1.9％至2.0％、1.9％至2.01％、2％至2.01％、2％至2.5％、2.5％至3％、2.9％至3.0％、2.9％至3.01％、2％至3.01％、3％至3.5％、3.5％至4％、4％至4.5％、4.5％至5％、5％至6％、6％至7％、7％至8％、8％至9％、9％至10％、1％至2％、1％至3％、1％至5％、2％至4％、2％至5％、4％至6％、5％至8％、8％至10％、1％至5％、2％至6％、3％至7％、4％至8％、5％至10％、10％至12％、12％至15％、15％至20％、17％至20％、20％至22％、20％至25％、25％至30％、或30％至35％。如本文所用，“增加的肌养蛋白产生”、“肌养蛋白产生增加”或其类似物是指受试者的肌养蛋白、肌养蛋白样蛋白质或功能性肌养蛋白中的至少一种的产生增加。

“增加的”或“增强的”量通常是“统计学上显著的”量，并且可以包括由无反义寡核苷酸(不存在药剂)或对照化合物产生的量的1.1倍、1.2倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多倍(例如500倍、1000倍)(包括其间并且大于1的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。

术语“减少”或“抑制”可以总体上涉及本发明的一种或多种反义化合物“降低”相关生理或细胞反应(如本文所述的疾病或病症的症状)的能力，如根据诊断领域的常规技术所测量的。相关生理或细胞反应(在体内或在体外)对于本领域技术人员而言将是清楚的，并且可以包括肌营养不良症的症状或病理的减少，或肌养蛋白缺陷形式(如在患有DMD或BMD的个体中表达的肌养蛋白的改变形式)的表达减少。与由没有反义化合物或由对照组合物产生的反应相比，反应的“降低”可以是统计学上显著的，并且可以包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的降低，包括其间的所有整数。

如本文所用，术语“功能”和“功能性”等是指生物学功能、酶促功能或治疗功能。

“功能性”肌养蛋白一般是指通常与某些DMD或BMD受试者中存在的肌养蛋白蛋白质的改变或“缺陷型”形式相比，具有足够的生物活性以减少肌肉组织的进行性退化(其原本是肌营养不良症的特征)的肌养蛋白蛋白质。在某些实施例中，功能性肌养蛋白可以具有野生型肌养蛋白的体外或体内生物活性的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％(包括其间的所有整数)，如根据本领域中的常规技术所测量的。作为一个实例，在体外肌肉培养物的肌养蛋白相关活性可以根据肌管大小、肌原纤维组织(或无组织)、收缩运动和乙酰胆碱受体的自发性聚集来测量(参见例如Brown等人,Journal ofCellScience.[细胞科学杂志]112:209-216,1999)。动物模型也是用于研究疾病发病机理的宝贵资源，并提供了测试肌养蛋白相关活性的手段。用于DMD研究的两种最广泛使用的动物模型是mdx小鼠和金毛猎犬肌营养不良症(GRMD)狗，两者都是肌养蛋白阴性的(参见例如Collins和Morgan,Int J Exp Pathol[国际实验病理学杂志]84:165-172,2003)。可以将这些和其他动物模型用于测量多种肌养蛋白蛋白质的功能活性。包括截短形式的肌养蛋白，例如由本披露的某些外显子跳跃反义寡核苷酸产生的那些形式。

术语“吗啉代”、“吗啉代寡聚物”或“PMO”是指如下磷酰二胺吗啉代寡聚物，其具有以下通用结构：

B＝核碱基

并且如在Summerton,J.等人,Antisense&Nucleic Acid Drug Development[反义和核酸药物开发],7:187-195(1997)的图2中所述。如本文所述的吗啉代旨在涵盖具有前述通用结构的所有立体异构体(和其混合物)和构型。吗啉代寡聚物的合成、结构和结合特征详述于美国专利号5,698,685、5,217,866、5,142,047、5,034,506、5,166,315、5,521,063、5,506,337、8,076,476和8,299,206中，将其全部都通过引用并入本文。在某些实施例中，吗啉代在寡聚物的5'或3'末端与“尾”部分缀合，以增加其稳定性和/或溶解性。示例性尾包括：

“戈罗迪生”，还凭借其代号“SRP-4053”为人所知，是具有碱基序列5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3'(SEQ ID NO:1)的PMO。戈罗迪生是以CAS登记号1422959-91-8注册。化学名称包括：all-P-ambo-[P,2',3'-三脱氧-P-(二甲基氨基)-2',3'-亚氨基-2',3'-断裂](2'a→5')(G-T-T-G-C-C-T-C-C-G-G-T-T-C-T-G-A-A-G-G-T-G-T-T-C)5'-[4-({2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基}羰基)-N,N-二甲基哌嗪-1-磷酰胺]

戈罗迪生具有以下结构：

并且还由以下化学结构表示：

碱基序列从5'末端至3'末端为GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC

为了清楚起见，本披露的结构(包括例如戈罗迪生的上述结构)从5'至3'是连续的，并且为了便于描绘呈紧凑形式的整个结构，已包括标记有“断点A”和“断点B”的各种图解断点。如普通技术人员应理解，例如“断点A”的各个指示显示在这些点处结构图解的继续。普通技术人员理解，对于上述结构中的“断点B”的每种情况同样如此。然而，没有一个图解断点旨在指示上述结构的实际中止，也没有普通技术人员将其理解成意味着上述结构的实际中止。

如本文所用，在结构式内使用的一组括号指示括号之间的结构特征是重复的。在一些实施例中，使用的括号可以是“[”和“]”，并且在某些实施例中，用于指示重复结构特征的括号可以是“(”和“)”。在一些实施例中，括号之间结构特征的重复迭代数目是括号外指示的数目，例如2、3、4、5、6、7等。在多种实施例中，括号之间结构特征的重复迭代数目由括号外指示的变量(如“Z”)所指示。

如本文所用，在直键或波浪键结构式内相对于手性碳或磷原子绘制的键表明该手性碳或磷的立体化学是不确定的并且旨在包括所有形式的手性中心。此类图解的实例描绘如下：

如本文所用，短语“肠胃外施用(parenteral administration和administeredparenterally)”意指除了肠内施用和局部施用之外的施用方式，通常是通过注射，并且包括但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。

短语“药学上可接受的”意指物质或组合物必需在化学上和/或在毒理学上与包含配制品的其他成分和/或用其治疗的受试者相容。

如本文所用，短语“药学上可接受的载体”意指任何类型的无毒惰性的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、囊封材料或配制助剂。可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例是：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类；如丙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原质水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液；以及其他无毒相容性润滑剂，如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁；以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂；防腐剂和抗氧化剂也可以根据配制者的判断存在于组合物中。

肌养蛋白合成或产生的术语“恢复”一般是指在用如本文所述的反义寡聚物治疗后，患有肌营养不良症的患者产生肌养蛋白蛋白质，包括截短形式的肌养蛋白。在一些实施例中，治疗导致患者的肌养蛋白产生增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％(包括其间的所有整数)。在一些实施例中，治疗使受试者中的肌养蛋白阳性纤维的数目增加至正常的至少20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％至100％。在其他实施例中，治疗使受试者中的肌养蛋白阳性纤维的数目增加至正常的约20％至约60％、或约30％至约50％。可以使用已知技术通过肌肉活检来确定治疗后患者中肌养蛋白阳性纤维的百分比。例如，肌肉活检可以取自合适的肌肉，如患者的肱二头肌。

阳性肌养蛋白纤维百分比的分析可以在治疗前和/或治疗后、或者在整个治疗过程中的某些时间点进行。在一些实施例中，治疗后活检取自治疗前活检的对侧肌肉。可以使用任何合适的肌养蛋白测定进行治疗前和治疗后肌养蛋白表达研究。在一些实施例中，使用作为肌养蛋白的标记的抗体(如单克隆抗体或多克隆抗体)对来自肌肉活检的组织切片进行免疫组织化学检测。例如，可以使用MANDYS106抗体，该抗体是肌养蛋白的高度敏感性标记。可以使用任何合适的第二抗体。

在一些实施例中，通过将阳性纤维的数目除以所计数的总纤维来计算肌养蛋白阳性纤维百分比。正常肌肉样品具有100％肌养蛋白阳性纤维。因此，可以将肌养蛋白阳性纤维百分比表达为正常的百分比。当计数治疗后肌肉中的肌养蛋白阳性纤维时，为了控制治疗前肌肉纤维以及回复纤维中痕量水平肌养蛋白的存在，可以使用各个患者的治疗前肌肉切片设定基线。这可以用作计数该患者中治疗后肌肉切片中的肌养蛋白阳性纤维的阈值。在其他实施例中，抗体染色的组织切片也可以用于使用Bioquant图像分析软件(Bioquant图像分析公司(Bioquant Image Analysis Corporation)，纳什维尔(Nashville)，田纳西州(TN))进行的肌养蛋白定量。总肌养蛋白荧光信号强度可以报告为正常的百分比。此外，单克隆或多克隆抗肌养蛋白抗体的蛋白质印迹分析可以用于确定肌养蛋白阳性纤维的百分比。例如，可以使用来自Novacastra公司的抗肌养蛋白抗体NCL-Dys1。肌养蛋白阳性纤维的百分比也可以通过确定肌聚糖复合物(β，γ)组分和/或神经元NOS的表达来分析。

在一些实施例中，用本披露的反义寡聚物(如戈罗迪生)治疗减慢或减少在没有治疗的情况下将预期DMD患者的进行性呼吸肌功能障碍和/或衰竭。在一些实施例中，用本披露的反义寡聚物治疗可以减少或消除对在没有治疗的情况下将期望的通气辅助的需求。在一些实施例中，用于追踪疾病病程以及评价潜在治疗干预的呼吸功能的测量包括最大吸气压力(MIP)、最大呼气压力(MEP)和用力肺活量(FVC)。MIP和MEP分别测量一个人在吸气和呼气期间可以产生的压力水平，并且是呼吸肌强度的敏感性量度。MIP是膈肌无力的量度。

在一些实施例中，MEP可能在其他肺功能测试(包括MIP和FVC)变化之前下降。在某些实施例中，MEP可以是呼吸功能障碍的早期指标。在某些实施例中，FVC可以用于测量最大吸气后用力呼气期间排出的空气的总体积。在DMD患者中，FVC伴随着身体生长而增加，直到青少年早期。然而，当生长减慢或因疾病进展而受阻，并且肌无力进展时，肺活量进入下降期，并且在10岁至12岁之后以每年约8至8.5百分比的平均速率下降。在某些实施例中，所预测的MIP百分比(针对体重调整的MIP)、所预测的MEP百分比(针对年龄调整的MEP)和所预测的FVC百分比(针对年龄和身高调整的FVC)是支持性分析。

如本文所用，“受试者”或“患者”包括可以用本披露的反义寡核苷酸治疗的、展现出症状或处于展现症状的风险下的任何动物，如患有DMD或BMD或处于患上DMD或BMD的风险下，或具有与这些病症相关的任何症状(例如肌肉纤维损失)或处于具有与这些病症相关的任何症状的风险下的受试者。合适的受试者(患者)包括实验室动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农畜、以及家畜或宠物(如猫或狗)。包括非人灵长类动物，以及优选人患者。还包括在具有适合于外显子53跳跃的肌养蛋白基因突变的受试者中产生肌养蛋白的方法。

如本文所用，“小儿患者”是从1岁至21岁(包括端值)的患者。

如本文所用，短语“全身施用(systemic administration和administeredsystemically)”、“外周施用(peripheral administration和administeredperipherally)”意指除了直接用于中枢神经系统中以外的方式施用化合物、药物或其他材料，使得所述化合物、药物或其他材料进入患者的系统中并因此进行代谢和其他相似过程，例如皮下施用。

如本文所用，“长期施用”是指连续、规则、长期的治疗性施用，还即定期施用而基本上没有中断。例如，出于治疗患者的肌营养不良症的目的，每日，持续至少数周或数月或数年的时间段。例如，出于治疗患者的肌营养不良症的目的，每周，持续至少数月或数年的时间段(例如，每周，持续至少六周；每周，持续至少12周；每周，持续至少24周；每周，持续至少48周；每周，持续至少72周；每周，持续至少96周；每周，持续至少120周；每周，持续至少144周；每周，持续至少168周；每周，持续至少180周；每周，持续至少192周；每周，持续至少216周；或每周，持续至少240周)。

如本文所用，“定期施用”是指在剂量之间具有一定间隔的施用。例如，定期施用包括可以重复进行的按固定间隔(例如每周、每月)的施用。

如本文所用，“安慰剂”是指不具有治疗效果并且可以用作对照的物质。

如本文所用，“安慰剂对照”是指接受安慰剂而非组合疗法、反义寡核苷酸、非类固醇抗炎症化合物和/或另一种药物组合物的受试者或患者。安慰剂对照可以具有与受试者或患者相同的突变状态，具有相似的年龄、相似的行走能力和或接受相同的伴随药物治疗(包括类固醇等)。

短语“靶向序列”、“碱基序列”或“核碱基序列”是指与靶标前体mRNA的核苷酸序列互补的寡聚物核碱基序列。在本披露的一些实施例中，靶标前体mRNA中的核苷酸序列是命名为H53A(+36+60)的肌养蛋白前体mRNA中的外显子53退火位点。

受试者(例如，哺乳动物，如人)或细胞的“治疗”是试图改变受试者或细胞的自然进程的任何类型的干预。治疗包括但不限于寡聚物或其药物组合物的施用，并且可以预防性地进行或者在病理事件开始或与致病因子接触之后进行。治疗包括对与肌养蛋白蛋白质相关的疾病或病症的症状或病理(如呈某些形式的肌营养不良症)的任何期望的效果，并且可以包括例如所治疗疾病或病症的一种或多种可测量标记的最小变化或改善。还包括“预防性”治疗，其可以旨在降低所治疗疾病或病症的进展速率，延迟该疾病或病症的发作，或降低其发作的严重性。“治疗”或“预防”不一定指示完全根除、治愈或防止该疾病或病症或其相关症状。

在一些实施例中，用本披露的反义寡聚物治疗增加肌养蛋白产生，延迟疾病进展，减慢或减少步行丧失，减少肌肉炎症，减少肌肉损伤，改进肌肉功能，减少肺功能丧失和/或增强肌肉再生，这些是在没有治疗的情况下将预期的或在没有治疗的情况下所预期的。在一些实施例中，治疗维持、延迟或减慢疾病进展。在一些实施例中，治疗维持步行或减少步行丧失。在一些实施例中，治疗维持肺功能或减少肺功能丧失。在一些实施例中，如通过例如6分钟行走测试(6MWT)所测量的，治疗维持或增加患者的稳定行走距离。在一些实施例中，治疗维持或减少行走/跑步10米的时间(即10米行走/跑步测试)。在一些实施例中，治疗维持或减少从仰卧站立的时间(即站立时间测试)。在一些实施例中，治疗维持或减少爬四阶标准楼梯的时间(即四阶爬楼测试)。在一些实施例中，如通过例如MRI(例如，腿部肌肉的MRI)所测量的，治疗维持或减少患者的肌肉炎症。在一些实施例中，MRI测量T2和/或脂肪分数以鉴定肌肉退化。MRI可以鉴定由炎症、水肿、肌肉损伤和脂肪浸润引起的肌肉结构和组成的变化。

在一些实施例中，用本披露的反义寡聚物治疗增加肌养蛋白产生。在一些实施例中，相对于健康同龄人，增加的肌养蛋白产生是约0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.7％、0.9％、1％、1.01％、1.5％、2％、2.01％、2.5％、3％、3.01％、3.5％、4％、4.01％、4.5％、5％、5.01％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、40％、45％、50％、55％或60％。在某些实施例中，相对于健康同龄人，肌养蛋白产生的增加可以为约0.1％至0.5％、0.5％至0.9％、0.8％至1％、0.9％至1.2％、0.9％至1.0％、0.9％至1.01％、1％至1.01％、1％至1.5％、1.5％至2％、1.9％至2.0％、1.9％至2.01％、2％至2.01％、2％至2.5％、2.5％至3％、2.9％至3.0％、2.9％至3.01％、2％至3.01％、3％至3.5％、3.5％至4％、4％至4.5％、4.5％至5％、5％至6％、6％至7％、7％至8％、8％至9％、9％至10％、1％至2％、1％至3％、1％至5％、2％至4％、2％至5％、4％至6％、5％至8％、8％至10％、1％至5％、2％至6％、3％至7％、4％至8％、5％至10％、10％至12％、12％至15％、15％至20％、17％至20％、20％至22％、20％至25％、25％至30％、或30％至35％。

在某些实施例中，用本披露的反义寡聚物治疗增加肌养蛋白产生并且减慢或减少在没有治疗的情况下将预期的步行丧失。例如，治疗可以稳定、维持、改进或增加受试者的行走能力(例如，步行的稳定)。在一些实施例中，McDonald等人(Muscle Nerve[肌肉神经],2010；42:966-74，通过引用并入本文)描述，如通过例如6分钟行走测试(6MWT)所测量的，治疗维持或增加患者的稳定行走距离。6分钟行走距离(6MWD)的变化可以表达为绝对值、百分比变化或％预测值的变化。在一些实施例中，相对于健康同龄人，治疗维持或改进受试者在6MWT中始于20％逆差的稳定行走距离。可以通过计算％预测值来确定相对于健康同龄人的典型表现DMD患者在6MWT中的表现。例如，对于男性，％预测的6MWD可以使用以下等式来计算：196.72+(39.81x年龄)–(1.36x年龄²)+(132.28x以米计的身高)。对于女性，％预测的6MWD可以使用以下等式来计算：188.61+(51.50x年龄)–(1.86x年龄²)+(86.10x以米计的身高)(Henricson等人,PLoS Curr.[公共科学图书馆·潮流],2012,第2版,通过引用并入本文)。

在一些实施例中，用反义寡聚物治疗使患者的稳定行走距离从基线增加至大于3、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或50米(包括其间的所有整数)。在一些实施例中，相对于健康同龄人，增加的肌养蛋白产生是约0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.7％、0.9％、1％、1.01％、1.5％、2％、2.01％、2.5％、3％、3.01％、3.5％、4％、4.01％、4.5％、5％、5.01％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、40％、45％、50％、55％或60％。在某些实施例中，相对于健康同龄人，肌养蛋白产生的增加可以为约0.1％至0.5％、0.5％至0.9％、0.8％至1％、0.9％至1.2％、0.9％至1.0％、0.9％至1.01％、1％至1.01％、1％至1.5％、1.5％至2％、1.9％至2.0％、1.9％至2.01％、2％至2.01％、2％至2.5％、2.5％至3％、2.9％至3.0％、2.9％至3.01％、2％至3.01％、3％至3.5％、3.5％至4％、4％至4.5％、4.5％至5％、5％至6％、6％至7％、7％至8％、8％至9％、9％至10％、1％至2％、1％至3％、1％至5％、2％至4％、2％至5％、4％至6％、5％至8％、8％至10％、1％至5％、2％至6％、3％至7％、4％至8％、5％至10％、10％至12％、12％至15％、15％至20％、17％至20％、20％至22％、20％至25％、25％至30％、或30％至35％。

DMD患者的肌肉功能丧失可能发生在正常儿童生长和发育的背景下。事实上，尽管存在进行性肌肉损伤，但是在约1年的时间过程内，患有DMD的年少儿童可能显示在6MWT期间行走的距离增加。在一些实施例中，将来自DMD患者的6MWD与典型发育的对照受试者以及与来自年龄和性别匹配的受试者的现有标准数据进行比较。在一些实施例中，可以使用与标准数据拟合的基于年龄和身高的等式来说明正常生长和发育。这样的等式可以用于将6MWD转换成DMD受试者的百分比预测(％预测的)值。在某些实施例中，％预测的6MWD数据的分析代表一种说明正常生长和发育的方法，并且可以表明，在早龄期(例如，小于或等于7岁)的功能增强代表DMD患者的能力稳定而非改进(Henricson等人,PLoS Curr.[公共科学图书馆·潮流],2012,第2版，通过引用并入本文)。

提出并公开反义分子命名系统，以在不同反义分子之间进行区分(参见Mann等人,(2002)J Gen Med[基因医学杂志]4,644-654)。当测试若干个略微不同的反义分子时，这种命名变得尤其相关，这些反义分子全部针对相同的靶标区域，如下所示：

H#A/D(x:y)。

第一个字母指定物种(例如，H：人类，M：鼠类，C：犬类)。“#”指定靶标肌养蛋白外显子数目。“A/D”分别指示在外显子的开始和结束处的受体或供体剪接位点。(x y)表示退火坐标，其中“-”或“+”分别指示内含子或外显子序列。例如，A(-6+18)将指示在靶标外显子之前的内含子的最后6个碱基和靶标外显子的前18个碱基。最接近的剪接位点是受体，因此这些坐标前面将带有“A”。描述在供体剪接位点处的退火坐标可以是D(+2-18)，其中最后2个外显子碱基和前18个内含子碱基对应于该反义分子的退火位点。完整的外显子退火坐标将由A(+65+85)表示，其是从该外显子开始的第65个与第85个核苷酸之间的位点。

II.反义寡核苷酸

根据本披露的方法使用靶向肌养蛋白基因的前体mRNA以实现外显子53跳跃的反义寡核苷酸。

可以设计这样的反义寡核苷酸以阻断或抑制mRNA翻译或抑制天然前体mRNA剪接加工，并且可以称为“针对”或“靶向”与其杂交的靶序列。靶序列通常是包括mRNA的AUG起始密码子、翻译抑制寡聚物、或经预加工的mRNA的剪接位点、剪接抑制寡聚物(SSO)的区域。剪接位点的靶序列可以包括如下mRNA序列，该mRNA序列在预加工的mRNA中具有其正常剪接受体接合点下游的5'末端1个至约25个碱基对。在一些实施例中，靶序列可以是预加工的mRNA的任何区域，其包括剪接位点或完全包含在外显子编码序列内或跨越剪接受体或供体位点。当寡聚物以上述方式靶向靶标的核酸时，该寡聚物更通常被称为“靶向”生物相关靶标，如蛋白质、病毒或细菌。

在某些实施例中，反义寡核苷酸与肌养蛋白前体mRNA的外显子53靶标区域特异性地杂交并且诱导外显子53跳跃。在某些实施例中，与肌养蛋白前体mRNA的外显子53靶标区域杂交并且诱导外显子53跳跃的反义寡核苷酸是磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)。

在某些实施例中，反义寡核苷酸是戈罗迪生。

戈罗迪生属于一类独特的新型合成反义RNA治疗剂，称为磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)，其是天然核酸结构的重新设计。戈罗迪生是与肌养蛋白前体mRNA的外显子53靶标区域杂交并且诱导外显子53跳跃的PMO。可以采用上文引用的参考文献以及另外国际专利申请序列号PCT/US17/40318(将其全部内容通过引用明确并入本文)中详述的方法，通过逐步固相合成来制备戈罗迪生。

PMO基于体内非临床观察结果提供潜在的临床优势。PMO掺入针对RNA糖环的修饰以保护其免受核酸酶的酶促降解，以便确保在体内的稳定性。部分通过使用6元合成吗啉代环将PMO与天然核酸和其他反义寡核苷酸类别进行区别，该6元合成吗啉代环替换在RNA、DNA和许多其他合成反义RNA寡核苷酸中发现的5元核糖呋喃糖基环。

对PMO特异的不带电荷的磷酰二胺键被认为可能赋予降低的与蛋白质的脱靶结合。PMO具有连接各个吗啉代环的不带电荷的磷酰二胺键，而非在其他临床阶段合成反义RNA寡核苷酸中使用的带负电荷的硫代磷酸酯键。

治疗由DMD基因中的框外突变引起的DMD的潜在治疗方法是由称为BMD(其由框内突变引起)的较弱形式的肌营养不良病(dystrophinopathy)所建议。假设将框外突变转换成框内突变的能力可以保留mRNA阅读框并产生内部缩短但有功能的肌养蛋白蛋白质。设计戈罗迪生以实现此目标。

戈罗迪生靶向肌养蛋白前体mRNA并且诱导外显子53的跳跃，因此将其从成熟的剪接mRNA转录物中排除或跳跃。通过跳跃外显子53，使破坏的阅读框恢复成框内突变。虽然DMD由多种基因亚型构成，但是特异性设计戈罗迪生以跳跃肌养蛋白前体mRNA的外显子53。适合于跳跃外显子53的DMD突变包括与外显子53相连的外显子的缺失(即包括外显子52或外显子54的缺失)，并且包含DMD患者的亚群(8％)。

设计戈罗迪生的25个核碱基的序列以与肌养蛋白前体mRNA的外显子53内的特异性靶序列互补。在戈罗迪生中的各个吗啉代环与DNA中发现的四个杂环核碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶)之一连接。

戈罗迪生与靶向的前体mRNA序列的杂交干扰前体mRNA剪接复合物的形成并且使外显子53从成熟mRNA中缺失。戈罗迪生的结构和构型允许与互补序列的序列特异性碱基配对。例如，依特立生(其是设计以跳跃肌养蛋白前体mRNA的外显子51的PMO)允许与肌养蛋白前体mRNA的外显子51中包含的互补序列的序列特异性碱基配对。

使用外显子跳跃恢复肌养蛋白阅读框

含有全部79个外显子的正常肌养蛋白mRNA将产生正常的肌养蛋白蛋白质。

失去肌养蛋白基因的完整外显子的肌养蛋白mRNA通常导致DMD。

另一种外显子跳跃PMO(依特立生)使外显子51跳跃以恢复mRNA阅读框。由于外显子49以完整密码子结束并且外显子52以密码子的第一个核苷酸开始，所以通过外显子跳跃使外显子51缺失恢复了阅读框，从而导致产生具有完整肌养蛋白聚糖结合位点的内部缩短的肌养蛋白蛋白质。

非临床研究支持使用外显子跳跃恢复肌养蛋白mRNA开放阅读框来改善DMD表型的可行性。在DMD的营养不良动物模型中的许多研究表明，通过外显子跳跃恢复肌养蛋白引起肌肉力量和功能的可靠改进(Sharp 2011；Yokota2009；Wu 2008；Wu 2011；Barton-Davis1999；Goyenvalle 2004；Gregorevic 2006；Yue 2006；Welch 2007；Kawano 2008；Reay2008；van Putten 2012)。其引人注目的实例来自一项研究，其中将外显子跳跃(使用PMO)疗法后的肌养蛋白水平与相同组织中的肌肉功能进行比较。在营养不良的mdx小鼠中，用小鼠特异性PMO治疗的胫骨前(TA)肌肉在应激诱导收缩之后维持其最大力容量的约75％，然而未经治疗的对侧TA肌肉仅维持其最大力容量的约25％(p<0.05)(Sharp 2011)。在另一项研究中，3只营养不良的CXMD狗(在2-5个月龄)接受使用对其基因突变特异的PMO的外显子跳跃疗法，一周一次持续5至7周，或者每隔一周一次持续22周。在外显子跳跃疗法后，全部3只狗均表现出在骨骼肌中肌养蛋白的广泛的全身性表达，以及相对于基线维持或改进的步行(15m跑步测试)。相比之下，未经治疗的年龄匹配的CXMD狗在研究过程中显示出步行的显著减少(Yokota 2009)。

在mdx小鼠和在表达整个人DMD转录物的人源化DMD(hDMD)小鼠模型中，已显示PMO在等摩尔浓度下具有比硫代磷酸酯更多的外显子跳跃活性(Heemskirk 2009)。在正常人骨骼肌细胞或具有适合于外显子51跳跃的不同突变的DMD患者肌肉细胞中使用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(WB)的体外实验将依特立生(一种PMO)鉴定为外显子51跳跃的有效诱导剂。已在hDMD小鼠模型中在体内证实依特立生诱导的外显子51跳跃(Arechavala-Gomeza 2007)。

分析与肌养蛋白前体mRNA的外显子53靶标区域特异性地杂交并且诱导外显子53跳跃的反义寡核苷酸的效应的临床结果包括肌养蛋白阳性纤维百分比(PDPF)、六分钟行走测试(6MWT)、步行丧失(LOA)、北极星移动评估(NSAA)、肺功能测试(PFT)、无外部支持(从仰卧位)起身的能力、从头合成肌养蛋白产生和其他功能量度从基线增加。

已在临床研究中研究了戈罗迪生。

研究4053-101

研究4053-101是SRP-4053(戈罗迪生)在DMD患者中的I/II期研究。本研究是2部分、随机化、双盲、安慰剂对照、剂量滴定、安全性、耐受性和药代动力学研究(第1部分)，随后是SRP-4053在适合于外显子53跳跃的杜氏肌营养不良症患者中的开放标记功效和安全性评估(第2部分)。主要结果量度包括不良事件的发生率[时间范围：大约12周(第1部分)]、6分钟行走测试(6MWT)从基线的变化[时间范围：144周(第2部分)]和肌养蛋白阳性纤维百分比[时间范围：48周(第2部分)]。次要结果量度包括血浆中的药物浓度[时间范围：大约12周(第1部分)]、预测的最大吸气压力(MIP)％、预测的最大呼气压力(MEP)％[时间范围：144周(第2部分)]。此研究的另外的详情见于www.clinicaltrials.gov(NCT02310906)。

III.配制品和施用方式

在某些实施例中，本披露提供适合用于治疗性递送如本文所述的反义寡核苷酸的配制品或药物组合物。因此，在某些实施例中，本披露提供药学上可接受的组合物，所述药学上可接受的组合物包含与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的治疗有效量的本文所述的一种或多种反义寡核苷酸。虽然有可能将本披露的反义寡核苷酸单独施用，但优选的是将该化合物作为药物配制品(组合物)施用。

用于递送核酸分子的方法描述于例如Akhtar等人,1992,Trends Cell Bio.[细胞生物学趋势],2:139；以及Delivery Strategies for Antisense OligonucleotideTherapeutics,Akhtar编；Sullivan等人,PCT WO 94/02595中。可以将这些和其他方案用于递送实际上任何核酸分子，包括本披露的反义寡核苷酸。

如下文详述，本披露的药物组合物可以专门配制用于以固体或液体形式施用，所述固体或液体形式包括适于以下的那些：(1)口服施用，例如灌药(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂(例如靶向颊、舌下和全身吸收的那些)、大丸剂、粉剂、颗粒剂、用于应用于舌头的糊剂；(2)肠胃外施用，例如作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放配制品通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射；(3)局部应用，例如作为应用至皮肤的乳膏剂、软膏剂或控制释放贴剂或喷雾剂；(4)阴道内或直肠内，例如作为子宫托、乳膏或泡沫；(5)舌下；(6)经眼；(7)经皮；或(8)经鼻。

可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括但不限于：(1)糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，如丙二醇；(11)多元醇，如丙三醇、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原质水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及(22)药物配制品中所用的其他无毒相容性物质。

适合用于与本披露的反义寡核苷酸一起配制的药剂的另外非限制性实例包括：PEG缀合的核酸、磷脂缀合的核酸、含有亲脂部分的核酸、硫代磷酸酯、P-糖蛋白抑制剂(如普洛尼克(Pluronic)P85)，其可以增强药物进入各种组织中；生物可降解聚合物，例如用于植入之后的持续释放递送的聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)微球体(Emerich,D F等人,1999,Cell Transplant[细胞移植],8,47-58)Alkermes公司，剑桥(Cambridge),马萨诸塞州(Mass.)；以及加载的纳米颗粒，例如由聚氰基丙烯酸丁酯制成的那些，其可以通过血脑屏障递送药物并且可以改变神经元摄取机制(Prog Neuropsychopharmacol BiolPsychiatry[神经心理药理学与生物精神病学进展],23,941-949,1999)。

本披露还涉及包含含有聚(乙二醇)脂质的经表面修饰的脂质体(经PEG修饰的、分支的和非分支的或其组合，或者长循环脂质体或隐形脂质体)的组合物的用途。本披露的反义寡核苷酸还可以包含各种分子量的共价附接的PEG分子。这些配制品提供了用于增加药物在靶标组织中积累的方法。这种类型的药物载体通过单核吞噬细胞系统(MPS或RES)抵抗调理作用和消除，从而使经囊封药物的血液循环时间更长并且组织暴露增强(Lasic等人Chem.Rev.[化学评论]1995,95,2601-2627；Ishiwata等人,Chem.Pharm.Bull.[化学及药物通讯]1995,43,1005-1011)。已显示此类脂质体在肿瘤中选择性地积累，可假定通过外渗和在新生血管化靶组织中捕获(Lasic等人,Science[科学]1995,267,1275-1276；Oku等人,1995,Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报],1238,86-90)。长循环脂质体增强DNA和RNA的药代动力学和药效动力学，尤其与已知在MPS组织中积累的常规阳离子脂质体相比(Liu等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]1995,42,24864-24870；Choi等人,国际PCT公开号WO96/10391；Ansell等人,国际PCT公开号WO 96/10390；Holland等人,国际PCT公开号WO 96/10392)。基于长循环脂质体避免在代谢侵袭性MPS组织(如肝脏和脾脏)中积累的能力，与阳离子脂质体相比，长循环脂质体还可能在更大程度上保护药物免受核酸酶降解。

在另外的实施例中，本披露包括制备用于递送的反义寡核苷酸药物组合物，如美国专利号6,692,911、7,163,695和7,070,807中所述。在这方面，在一个实施例中，本披露提供本披露的寡聚物，其单独或与PEG(例如分支的或未分支的PEG或两者的混合物)组合、与PEG和靶向部分组合或者前述任一种与交联剂组合在包含赖氨酸和组氨酸(HK)的共聚物(如美国专利号7,163,695、7,070,807和6,692,911中所述)的组合物中。在某些实施例中，本披露提供反义寡核苷酸，其在包含经葡萄糖酸修饰的聚组氨酸或经葡萄糖酸化的聚组氨酸/转铁蛋白-聚赖氨酸的药物组合物中。本领域技术人员还将认识到，具有与His和Lys类似的特性的氨基酸可以在该组合物中被取代。

本文所述的反义寡核苷酸的某些实施例可以含有碱性官能团，如氨基或烷基氨基，并且因此能够与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。在这方面，术语“药学上可接受的盐”是指本披露化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在施用运载体或剂型制造过程中原地制备，或者通过使本披露的纯化化合物以其游离碱形式与合适的有机酸或无机酸单独反应，并且在后续纯化期间分离因此形成的盐来制备。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐(napthylate)、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖醛酸盐和月桂基磺酸盐等。(参见例如Berge等人(1977)“Pharmaceutical Salts”,J.Pharm.Sci.[药物科学杂志]66:1-19)。

主题反义寡核苷酸的药学上可接受的盐包括这些化合物的常规无毒盐或季铵盐，例如来自无毒有机酸或无机酸。例如，此类常规无毒盐包括衍生自无机酸的那些，所述无机酸例如为盐酸、氢溴酸、硫酸、胺磺酸、磷酸、硝酸等；以及从有机酸制备的盐，所述有机酸例如为乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、异硫磺酸等。

在某些实施例中，本披露的反义寡核苷酸可以含有一个或多个酸性官能团，并且因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”是指本披露化合物的相对无毒的无机和有机碱加成盐。同样，这些盐可以在施用运载体或剂型制造过程中原地制备，或者通过使纯化化合物以其游离酸形式与合适的碱(如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)、与氨或与药学上可接受的有机伯胺、仲胺、或叔胺单独反应来制备。代表性碱盐或碱土盐包括锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。(参见例如Berge等人,见上文)。

湿润剂、乳化剂和润滑剂(如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。

药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

本披露的配制品包括适合用于口服、经鼻、局部(包括经颊和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外施用的那些。这些配制品可以方便地以单位剂型存在并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的宿主、特定施用方式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量一般是产生治疗效果的化合物的那个量。一般而言，从百分之百中，此量将在从约0.1％至约99％活性成分、优选从约5％至约70％、最优选从约10％至约30％的范围内。

在某些实施例中，本披露的配制品包含选自以下的赋形剂：环糊精、纤维素、脂质体、胶束形成剂(例如胆汁酸)和聚合物载体(例如聚酯和聚酸酐)；和本披露的寡聚物。在某些实施例中，前述配制品使得本披露的寡聚物是口服生物可利用的。

制备这些配制品或药物组合物的方法包括使本披露的反义寡核苷酸与载体以及任选地一种或多种辅助成分缔合的步骤。一般而言，通过使本披露化合物与液体载体或细碎的固体载体或两者均一且紧密地缔合并且随后(如果必要)使产物成形来制备配制品。

适合用于口服施用的本披露的配制品可以呈胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)、粉剂、颗粒剂的形式，或作为呈水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或作为水包油或油包水液体乳剂，或作为酏剂或糖浆，或作为糖果锭剂(使用惰性基质，如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为漱口水等，每一种含有预定量的本披露化合物作为活性成分。本披露的反义寡核苷酸还可以作为大丸剂、舐剂或糊剂施用。

在用于口服施用的本披露的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉剂、颗粒剂、糖锭等)中，将活性成分与一种或多种药学上可接受的载体(如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或任何下列物质混合：(1)填充剂或扩充剂(extender)，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如像羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，如石蜡；(6)吸收加速剂，如季铵化合物，以及表面活性剂，如泊洛沙姆和月桂基硫酸钠；(7)润湿剂，例如像鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯和非离子表面活性剂；(8)吸附剂，如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠、硬脂酸锌、硬脂酸钠、硬脂酸、及其混合物；(10)着色剂；以及(11)控制释放剂，如交聚维酮或乙基纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可以包含缓冲剂。使用如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等此类赋形剂，相似类型的固体药物组合物也可以用作在软壳和硬壳明胶胶囊中的填充剂。

片剂可以通过任选地与一种或多种辅助成分压缩或模制来制备。可以使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羟基乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备压缩片剂。可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂湿润的粉状化合物的混合物来制备模制的片剂。

本披露的药物组合物的片剂和其他固体剂型(如糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂)可以任选地用包衣和外壳进行刻痕(scored)或制备，这些包衣和外壳是例如肠包衣和药物配制领域中熟知的其他包衣。也可以将它们使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所需的释放谱、其他聚合物基质、脂质体和/或微球来配制，以便提供其中活性成分的缓慢或控制释放。可以将它们配制用于快速释放，例如冷冻干燥的。可以将它们例如通过用截留细菌的滤器过滤或通过在使用前即刻掺入可溶解于无菌水或一些其他可注射无菌介质中的呈无菌固体药物组合物形式的灭菌剂来进行灭菌。任选地，这些药物组合物也可以含有遮光剂并且可以是仅或者优先在胃肠道的某一部分，任选地以延迟的方式释放一种或多种活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。活性成分也可以是微囊化的形式，如果适当的话，含有一种或多种上文所述的赋形剂。

用于口服施用本披露化合物的液体剂型包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性成分以外，液体剂型可以含有在本领域中常用的惰性稀释剂，例如像，水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(具体地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯类、及其混合物。

除了隋性稀释剂以外，口服药物组合物还可以包括佐剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。

除了活性化合物以外，悬浮液可以含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和山梨聚糖酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶、及其混合物。

用于直肠或阴道施用的配制品可以作为栓剂呈递，这些配制品可以通过将本披露的一种或多种化合物与一种或多种合适的无刺激赋形剂或载体混合而制备，这些赋形剂或载体包含例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐，并且这些配制品在室温下是固体但在体温下是液体，并且因此其将在直肠或阴道腔中融化并释放活性化合物。

用于如本文提供的寡聚物的局部或经皮施用的配制品或剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。可以将活性反义寡核苷酸在无菌条件下与药学上可接受的载体、以及与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。除了本披露的活性化合物以外，软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶还可以含有赋形剂，如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌、或其混合物。

除了本披露的寡聚物以外，粉剂和喷雾剂可以含有赋形剂，如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末、或这些物质的混合物。另外，喷雾剂可以含有常规的推进剂，如氯氟烃类和未经取代的挥发性烃类，如丁烷和丙烷。

经皮贴片具有提供本披露的寡聚物向身体的控制递送的另外优势。此类剂型可以通过将寡聚物溶解或分散于适宜的介质中来制备。还可以将吸收增强剂用于增加药剂穿过皮肤的通量。除了本领域已知的其他方法以外，可以通过提供速率控制膜或将药剂分散在聚合物基质或凝胶中来控制这种通量的速率。

适合用于肠胃外施用的药物组合物可以包含本披露的一种或多种反义寡核苷酸与一种或多种药学上可接受的无菌等张水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液、或可以仅在使用之前重构成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂的组合，这些溶液、分散液、悬浮液或乳液或无菌粉剂可以含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使得配制品与预期接受者的血液等张的溶质、或悬浮剂或增稠剂。可以用于本披露的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物；植物油，如橄榄油；和可注射有机酯，如油酸乙酯。例如，可以通过使用包衣材料(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需的粒径、以及通过使用表面活性剂来维持适宜的流动性。

这些药物组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，可以确保防止微生物对主题反义寡核苷酸作用。还希望在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等。此外，通过包括延迟吸收的药剂，如单硬脂酸铝和明胶可以引起可注射药物形式的延长吸收。

在一些情况下，为了延长药物的效果，希望减慢来自皮下或肌内注射的药物的吸收。除了本领域已知的其他方法以外，这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。然后药物的吸收速率取决于其溶解速率，该溶解速率转而又可能取决于晶体大小和结晶形式。可替代地，肠胃外施用的药物形式的延迟吸收通过将药物溶解或悬浮于油性运载体中来实现。

可以通过在可生物降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成主题反义寡核苷酸的微胶囊基质来制备可注射积存形式。取决于寡聚物与聚合物的比率以及所采用的具体聚合物的性质，可以控制寡聚物释放的速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)以及聚(酸酐)。积存可注射配制品也可以通过将药物包埋到可与机体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。

当本披露的反义寡核苷酸作为药物施用至人和动物时，它们本身可以被给予或作为含有例如0.1％至99％(更优选10％至30％)活性成分与药学上可接受的载体组合的药物组合物给予。

如上文所指出，本披露的配制品或制剂可以口服、肠胃外、局部或经直肠给予。通常，它们是以适合用于各种施用途径的形式被给予。例如，它们是以片剂或胶囊形式施用，通过注射、吸入施用，以眼部洗剂、软膏、栓剂等施用，通过注射、输注或吸入施用，通过洗剂或软膏局部施用，及通过栓剂经直肠施用。

无论选择何种施用途径，本披露的反义寡核苷酸(其能以合适的水合形式使用)和/或本披露的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。可以改变本披露的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得在不对患者有不可接受的毒性情况下有效地实现针对特定患者、组合物、施用方式的期望治疗反应的活性成分的量。

所选剂量水平将取决于多种因素，包括所用的本披露的特定寡聚物、或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，所用的特定寡聚物的排泄或代谢速率，吸收速率和程度，治疗持续时间，与所用的特定寡聚物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况和先前病史，以及医学领域中熟知的类似因素。

具有本领域普通技术的医师或兽医可以容易地确定并开出有效量的所需药物组合物。例如，医师或兽医能以低于为实现所需治疗效果所需的水平的药物组合物中所用的本披露化合物的剂量开始，并且逐渐增加剂量直至实现所需效果。一般而言，本披露化合物的合适日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物量。通常这样的有效剂量将取决于上文所述的这些因素。一般而言，当用于所指示的效果时，用于患者的本披露化合物的口服、静脉内、脑室内和皮下剂量将在每天每公斤体重约0.0001mg至约100mg范围内。

在一些实施例中，本披露的反义寡核苷酸是以一般约4-160mg/kg、10-160mg/kg或20-160mg/kg的剂量施用。在一些情况下，可能需要大于160mg/kg的剂量。在一些实施例中，例如像静脉内施用的肠胃外剂量是从约0.5mg至160mg/kg。在一些实施例中，反义寡核苷酸是以约4mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、17mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、25mg/kg、26mg/kg、27mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg、31mg/kg、32mg/kg、33mg/kg、34mg/kg、35mg/kg、36mg/kg、37mg/kg、38mg/kg、39mg/kg、40mg/kg、41mg/kg、42mg/kg、43mg/kg、44mg/kg、45mg/kg、46mg/kg、47mg/kg、48mg/kg、49mg/kg 50mg/kg、51mg/kg、52mg/kg、53mg/kg、54mg/kg、55mg/kg、56mg/kg、57mg/kg、58mg/kg、59mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg、100mg/kg、105mg/kg、110mg/kg、115mg/kg、120mg/kg、125mg/kg、130mg/kg、135mg/kg、140mg/kg、145mg/kg、150mg/kg、155mg/kg、160mg/kg(包括其间的所有整数)的剂量施用的。在一些实施例中，将寡聚物以30mg/kg施用。在一些实施例中，将寡聚物以40mg/kg施用。在一些实施例中，将寡聚物以60mg/kg施用。在一些实施例中，将寡聚物以80mg/kg施用。在一些实施例中，将寡聚物以160mg/kg施用。在一些实施例中，将寡聚物以50mg/kg施用。

如果需要，活性化合物的有效日剂量可以作为两次、三次、四次、五次、六次或更多次亚剂量施用，这些亚剂量任选地以单位剂型在一天内以适当间隔单独施用。在某些情形中，给药是每天施用一次。在某些实施例中，给药是按需要每2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天，或每1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周，或每1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月施用一次或多次，以维持功能性肌养蛋白的所需表达。在某些实施例中，给药是每周一次施用一次。在某些实施例中，给药是每两周一次施用一次或多次。在一些实施例中，给药是每两周一次施用一次。在各种实施例中，给药是每个月施用一次或多次。在某些实施例中，给药是每个月施用一次。

在各种实施例中，将反义寡核苷酸每周以4mg/kg施用。在各种实施例中，将反义寡核苷酸每周以10mg/kg施用。在各种实施例中，将反义寡核苷酸每周以20mg/kg施用。在各种实施例中，将反义寡核苷酸每周以30mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每周以40mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每周以60mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每周以80mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每周以100mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每周以160mg/kg施用。如本文所用，每周应理解为具有本领域所接受的每周的含义。

在各种实施例中，将反义寡核苷酸每两周以4mg/kg施用。在各种实施例中，将反义寡核苷酸每两周以10mg/kg施用。在各种实施例中，将反义寡核苷酸每两周以20mg/kg施用。在各种实施例中，将反义寡核苷酸每两周以30mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每两周以40mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每两周以60mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每两周以80mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每两周以100mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每两周以160mg/kg施用。如本文所用，每两周应理解为具有本领域所接受的每两周的含义。

在各种实施例中，将反义寡核苷酸每三周以4mg/kg施用。在各种实施例中，将反义寡核苷酸每三周以10mg/kg施用。在各种实施例中，将反义寡核苷酸每三周以20mg/kg施用。在各种实施例中，将反义寡核苷酸每三周以30mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每三周以40mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每三周以60mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每三周以80mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每三周以100mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每三周以160mg/kg施用。如本文所用，每三周应理解为具有本领域所接受的每三周一次的含义。

在各种实施例中，将反义寡核苷酸每月以4mg/kg施用。在各种实施例中，将反义寡核苷酸每月以10mg/kg施用。在各种实施例中，将反义寡核苷酸每月以20mg/kg施用。在各种实施例中，将反义寡核苷酸每月以30mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每月以40mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每月以60mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每月以80mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每月以100mg/kg施用。在一些实施例中，将反义寡核苷酸每月以160mg/kg施用。如本文所用，每月应理解为具有本领域所接受的每个月的含义。

如本领域中所理解，每周、每两周、每三周或每月施用可以是如上文所论述的一次或多次施用或亚剂量。

核酸分子可以通过本领域技术人员已知的各种方法施用至细胞，这些方法包括但不限于囊封在脂质体中、通过离子电渗或通过并入其他运载体(如水凝胶、环糊精、可生物降解纳米胶囊和生物黏附性微球)中，如本文所述和本领域中已知的。在某些实施例中，微乳化技术可以用于改善亲脂性(非水溶性)药剂的生物利用度。实例包括Trimetrine(Dordunoo,S.K.等人,Drug Development and Industrial Pharmacy,17(12),1685-1713,1991)和REV 5901(Sheen,P.C.等人,J Pharm Sci 80(7),712-714,1991)。除其他益处以外，微乳化通过优先将吸收指向淋巴系统而非循环系统，由此绕过肝脏并防止在肝胆循环中破坏化合物来提供增强的生物利用度。

在披露的一方面，配制品含有由如本文提供的寡聚物和至少一种两亲性载体形成的胶束，其中这些胶束具有小于约100nm的平均直径。更优选的实施例提供平均直径小于约50nm的胶束，并且甚至更优选的实施例提供平均直径小于约30nm或甚至小于约20nm的胶束。

虽然涵盖所有合适的两亲性载体，但当前优选的载体一般是具有普遍认为安全(GRAS)状态并且当溶液与复杂水相(例如发现于人胃肠道中的水相)接触时可以溶解本披露化合物并且在后期将其微乳化的那些载体。通常，满足这些要求的两亲性成分的HLB(亲水性至亲脂性平衡)值是2-20，并且其结构含有在C-6至C-20范围内的直链脂肪族基团。实例是聚乙二醇化的脂肪甘油酯和聚乙二醇。

两亲性载体的实例包括饱和的和单不饱和的聚乙二醇化的脂肪酸甘油酯，例如从完全或部分氢化的各种植物油中获得的那些。此类油可能有利地由三脂肪酸甘油酯、二脂肪酸甘油酯和单脂肪酸甘油酯以及相应脂肪酸的二聚乙二醇酯和单聚乙二醇酯组成，其中尤其优选的脂肪酸组合物包括癸酸4-10、癸酸3-9、月桂酸40-50、肉豆蔻酸14-24、棕榈酸4-14和硬脂酸5％-15％。另一类有用的两亲性载体包括具有饱和的或单不饱和的脂肪酸(SPAN系列)或者相应的乙氧基化类似物(TWEEN系列)的部分酯化的山梨聚糖和/或山梨糖醇。

可商购获得的两亲性载体可以是特别有用的，包括Gelucire系列、Labrafil、Labrasol或Lauroglycol(全部由法国圣普列斯特(Saint Priest)的Gattefosse公司制造和分销)、PEG-单油酸酯、PEG-二油酸酯、PEG-单月桂酸酯和二月桂酸酯、卵磷脂、聚山梨醇酯80等(由美国和全球的许多公司生产和分销)。

在某些实施例中，为了将本披露的药物组合物引入合适的宿主细胞中，递送可以通过使用脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等发生。具体地，可以配制本披露的药物组合物用于递送，这些药物组合物被囊封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球、纳米颗粒等中。可以使用已知和常规的技术进行此类递送运载体的配制和使用。

适合用于本披露的亲水性聚合物是易溶于水、可以共价附接至囊泡形成脂质、并且在体内是耐受的而无毒性作用(即是生物相容的)的那些。合适的聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(也称为聚丙交酯)、聚乙醇酸(也称为聚乙交酯)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物和聚乙烯醇。在某些实施例中，聚合物的分子量为从约100或120道尔顿多至约5,000或10,000道尔顿，或从约300道尔顿至约5,000道尔顿。在其他实施例中，聚合物是分子量为从约100至约5,000道尔顿，或分子量为从约300至约5,000道尔顿的聚乙二醇。在某些实施例中，聚合物是750道尔顿的聚乙二醇(PEG(750))。聚合物也可以由其中的单体的数目来定义；本披露的优选实施例利用至少约三种单体的聚合物，此类PEG聚合物由三种单体(约150道尔顿)组成。

可以适合用于本披露的其他亲水性聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、和衍生化的纤维素(如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素)。

在某些实施例中，本披露的配制品包含选自下组的生物相容性聚合物，该组由以下组成：聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烃、丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物、聚乙烯聚合物、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酸酐、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、多糖、蛋白质、聚透明质酸、聚氰基丙烯酸酯、及其共混物、混合物或共聚物。

环糊精是由6个、7个或8个葡萄糖单元组成的环状寡糖，分别以希腊字母α、β或γ表示。葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键连接。由于糖单元的椅型构象，所有仲羟基基团(在C-2、C-3处)均位于环的一侧，而在C-6处的所有伯羟基基团均位于另一侧。因此，外表面是亲水性的，使环糊精为水溶性的。相反，环糊精的腔是疏水性的，因为它们被原子C-3和C-5的氢以及类醚氧填满。这些基质允许与多种相对疏水性化合物复合，这些相对疏水性化合物包括例如类固醇化合物(如17α-雌二醇)(参见例如van Uden等人Plant CellTiss.Org.Cult.[植物细胞组织和器官培养]38:1-3-113(1994))。该复合通过范德华相互作用并通过氢键形成而发生。关于环糊精的化学的一般综述，参见Wenz,Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.[应用化学国际英语版],33:803-822(1994)。

环糊精衍生物的物理化学特性在很大程度上取决于取代的种类和程度。例如，其在水中的溶解度在不溶(例如三乙酰基-β-环糊精)至147％可溶(w/v)(G-2-β-环糊精)的范围内。此外，它们可溶于许多有机溶剂中。环糊精的特性使得能够通过增加或减少其溶解度来控制各种配制品组分的溶解性。

已对许多环糊精及其制备方法进行了描述。例如Parmeter(I)等人(美国专利号3,453,259)和Gramera等人(美国专利号3,459,731)描述了电中性环糊精。其他衍生物包括具有阳离子特性的环糊精[Parmeter(II)，美国专利号3,453,257]、不溶性交联环糊精(Solms，美国专利号3,420,788)、以及具有阴离子特性的环糊精[Parmeter(III)，美国专利号3,426,011]。在具有阴离子特性的环糊精衍生物中，已将羧酸、亚磷酸、亚膦酸、膦酸、磷酸、硫代膦酸、硫代亚磺酸和磺酸附加至亲本环糊精[参见Parmeter(III)，见上文]。此外，Stella等人(美国专利号5,134,127)描述了磺烷基醚环糊精衍生物。

脂质体由至少一个脂质双层膜组成，该脂质双层膜封闭内部水性区室。脂质体可以通过膜类型和大小来表征。小单层囊泡(SUV)具有单个膜并且直径通常在0.02μm与0.05μm之间的范围内；大单层囊泡(LUVS)通常大于0.05μm。寡层大囊泡和多层囊泡具有多个通常同心的膜层，并且通常大于0.1μm。具有若干个非同心膜的脂质体(即若干个较小囊泡包含在一个较大囊泡内)被称为多囊泡性囊泡。

本披露的一个方面涉及包含含有本披露反义寡核苷酸的脂质体的配制品，其中将该脂质体膜配制以提供携带能力增加的脂质体。可替代地或此外，本披露化合物可以包含在脂质体的脂质体双层内或吸附在脂质体的脂质体双层上。可以将本披露的反义寡核苷酸与脂质表面活性剂聚集并且携带于脂质体的内部空间内；在这些情况下，将脂质体膜配制以抵抗活性剂-表面活性剂聚集体的破坏作用。

根据本披露的一个实施例，脂质体的脂质双层含有用聚乙二醇(PEG)衍生的脂质，使得PEG链从脂质双层的内表面延伸至脂质体囊封的内部空间，并且从脂质双层的外部延伸至周围环境。

本披露的脂质体中包含的活性剂呈溶解形式。根据本披露，可以将表面活性剂和活性剂的聚集体(例如含有感兴趣的活性剂的乳液或胶束)包埋在脂质体的内部空间内。表面活性剂起到分散和溶解活性剂的作用，并且可以选自任何合适的脂肪族、脂环族、或芳香族表面活性剂，包括但不限于具有不同链长(例如，从约C14至约C20)的生物相容性溶血磷脂酰胆碱(LPG)。聚合物衍生的脂质(如PEG脂质)也可以用于胶束形成，因为它们将起到抑制胶束/膜融合的作用，并且因为将聚合物添加到表面活性剂分子中降低表面活性剂的CMC并有助于胶束形成。优选的是具有在微摩尔范围的CMO的表面活性剂；较高CMC的表面活性剂可以用于制备包埋在本披露的脂质体内的胶束。

可以通过本领域已知的多种技术中的任一种来制备根据本披露的脂质体。参见例如美国专利号4,235,871；公开的PCT申请WO 96/14057；New RRC,Liposomes:A practicalapproach,IRL Press,Oxford(1990),第33-104页；Lasic DD,Liposomes from physics toapplications,爱思唯尔科学出版社(Elsevier Science Publishers BV),阿姆斯特丹(Amsterdam),1993。例如，本披露的脂质体可以通过如下来制备：以与脂质体中所需的衍生化脂质的最终摩尔百分比对应的脂质浓度，将被亲水性聚合物衍生化的脂质扩散到预先形成的脂质体中，例如通过将预先形成的脂质体暴露于由脂质接合的聚合物构成的胶束中。含有亲水性聚合物的脂质体也可以通过均质化、脂质场水合、或挤出技术形成，如本领域已知的。

在另一示例性配制程序中，首先通过超声处理将活性剂分散在容易溶解疏水性分子的溶血磷脂酰胆碱或其他低CMC表面活性剂(包括聚合物接合的脂质)中。然后将所得的活性剂胶束悬浮液用于再水化干燥的脂质样品，该干燥的脂质样品含有合适摩尔百分比的聚合物接合的脂质或胆固醇。然后使用如本领域已知的挤出技术将脂质和活性剂悬浮液形成为脂质体，并且将所得的脂质体通过标准柱分离从未囊封的溶液中分离出。

在本披露的一方面，将脂质体制备成具有在选定尺寸范围内的基本均匀的尺寸。一种有效的分级方法涉及将脂质体的水性悬浮液通过一系列具有选定的均匀孔径的聚碳酸酯膜挤出；膜的孔径将大致对应于通过该膜挤出产生的最大脂质体尺寸。参见例如美国专利号4,737,323(1988年4月12日)。在某些实施例中，可以使用诸如和等试剂将多核苷酸或蛋白质引入细胞中。

本披露的配制品的释放特征取决于囊封材料、囊封药物的浓度、和释放调节剂的存在。例如，可以使用例如仅在低pH(如在胃中)或较高pH(如在肠中)下释放的pH敏感性包衣将释放操纵为pH依赖性的。肠包衣可以用于防止释放产生，直到通过胃之后。在不同材料中囊封的氰胺的多种包衣或混合物可以用于获得在胃中初始释放，随后在肠中后期释放。释放也可以通过包括盐或成孔剂来操纵，这些盐或成孔剂可以增加水摄取或通过从胶囊中扩散来释放药物。改变药物溶解性的赋形剂也可以用于控制释放速率。也可以掺入增强基质降解或从基质中释放的药剂。取决于化合物，可以将它们添加至药物中(作为单独的相(即作为微粒)添加)，或者可以将其共溶于聚合物相中。在大多数情况下，量应在0.1％与30％(w/w聚合物)之间。降解增强剂的类型包括无机盐(如硫酸铵和氯化铵)，有机酸(如柠檬酸、苯甲酸和抗坏血酸)，无机碱(如碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸锌和氢氧化锌)，和有机碱(如硫酸鱼精蛋白、精胺、胆碱、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺)，以及表面活性剂(如和)。将微观结构添加至基质中的成孔剂(即水溶性化合物，如无机盐和糖)作为微粒添加。范围通常在1％与30％(w/w聚合物)之间。

也可以通过改变颗粒在肠道中的停留时间来操纵摄取。这可以例如通过用粘膜粘附性聚合物包衣颗粒或选择粘膜粘附性聚合物作为囊封材料来实现。实例包括大多数具有游离羧基基团的聚合物，例如壳聚糖、纤维素，以及尤其是聚丙烯酸酯(如本文所用，聚丙烯酸酯是指包括丙烯酸酯基团和经修饰的丙烯酸酯基团的聚合物，如氰基丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯)。

可以将反义寡核苷酸配制以包含在手术或医疗装置或植入物内，或适于通过手术或医疗装置或植入物释放。在某些方面，可以用反义寡核苷酸涂覆或以其他方式处理植入物。例如，水凝胶或其他聚合物(如生物相容性和/或可生物降解聚合物)可以用于用本披露的药物组合物涂覆植入物(即该组合物可以适于通过使用水凝胶或其他聚合物与医疗装置一起使用)。用于用药剂涂覆医疗装置的聚合物和共聚物是本领域熟知的。植入物的实例包括但不限于：支架、药物洗脱支架、缝合线、假体、血管导管、透析导管、血管移植物、人工心脏瓣膜、心脏起搏器、可植入心脏复律除颤器、IV针、用于骨固定和形成的装置(如销、螺钉、板和其他装置)、以及用于伤口愈合的人造组织基质。

除了本文提供的方法以外，根据本披露使用的反义寡核苷酸可以与其他药物类似地配制，用于以任何方便的方式施用而用于人类医学或兽医学中。反义反义寡核苷酸及其相应的配制品可以单独或与治疗肌营养不良症的其他治疗策略组合施用，这些其他治疗策略例如为成肌细胞移植、干细胞疗法、施用氨基糖苷抗生素、蛋白酶体抑制剂和上调疗法(例如，上调肌营养相关蛋白(utrophin)，该肌营养相关蛋白是肌养蛋白的一种常染色体旁系同源物)。

在一些实施例中，可以在施用本披露的反义寡核苷酸之前、同时或之后施用另外的治疗剂。例如，可以将反义寡核苷酸与类固醇和/或抗生素组合施用。在某些实施例中，将反义寡核苷酸施用至具有背景类固醇理论(例如间歇性或长期/持续背景类固醇疗法)的患者。例如，在一些实施例中，该患者在施用反义寡聚物之前已用皮质类固醇进行治疗，并继续接受该类固醇疗法。在一些实施例中，该类固醇是糖皮质激素或泼尼松。

所描述的施用途径仅旨在作为引导，因为熟练技术人员将能够容易地确定用于任何特定动物和病症的最佳施用途径和任何剂量。已尝试用于在体外和在体内将功能性新遗传材料引入细胞中的多种方法(Friedmann(1989)Science[科学],244:1275-1280)。这些方法包括将待表达的基因整合到经修饰的逆转录病毒中(Friedmann(1989)见上文；Rosenberg(1991)Cancer Research[癌症研究]51(18),增刊:5074S-5079S)；整合到非逆转录病毒载体(例如腺相关病毒载体)中(Rosenfeld等人,(1992)Cell[细胞],68:143-155；Rosenfeld等人,(1991)Science[科学],252:431-434)；或经由脂质体递送与异源启动子-增强子元件连接的转基因(Friedmann(1989),见上文；Brigham等人,(1989)Am.J.Med.Sci.[美国医学科学杂志],298:278-281；Nabel等人,(1990)Science[科学],249:1285-1288；Hazinski等人,(1991)Am.J.Resp.Cell Molec.Biol.[美国呼吸系统细胞和分子生物学杂志],4:206-209；以及Wang和Huang(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)[美国国家科学院院刊],84:7851-7855)；与基于阳离子的配体特异性转运系统偶联(Wu和Wu(1988)J.Biol.Chem.[生物化学杂志],263:14621-14624)或使用裸DNA、表达载体(Nabel等人(1990),见上文)；Wolff等人(1990)Science[科学],247:1465-1468)。将转基因直接注射到组织中仅产生局部表达(Rosenfeld(1992)见上文)；Rosenfeld等人(1991)见上文；Brigham等人(1989)见上文；Nabel(1990)见上文；以及Hazinski等人(1991)见上文)。Brigham等人研究组(Am.J.Med.Sci.[美国医学科学杂志](1989)298:278-281和Clinical Research[临床研究](1991)39(摘要))已报道在静脉内或气管内施用DNA脂质体复合物后仅体内转染小鼠肺部。人类基因疗法程序的综述文章的实例是：Anderson,Science[科学](1992)256:808-813。

在另外的实施例中，本披露的药物组合物可以另外包含如Han等人,Nat.Comms.7,10981(2016)(将其全部内容通过引用并入本文)中所提供的碳水化合物。在一些实施例中，本披露的药物组合物可以包含5％的己糖碳水化合物。例如，本披露的药物组合物可以包含5％葡萄糖、5％果糖、或5％甘露糖。在某些实施例中，本披露的药物组合物可以包含2.5％葡萄糖和2.5％果糖。在一些实施例中，本披露的药物组合物可以包含选自以下的碳水化合物：按体积计以5％的量存在的阿拉伯糖，按体积计以5％的量存在的葡萄糖，按体积计以5％的量存在的山梨糖醇，按体积计以5％的量存在的半乳糖，按体积计以5％的量存在的果糖，按体积计以5％的量存在的木糖醇，按体积计以5％的量存在的甘露糖，按体积计各自以2.5％的量存在的葡萄糖和果糖的组合，以及按体积计以5.7％的量存在的葡萄糖、按体积计以2.86％的量存在的果糖、和按体积计以1.4％的量存在的木糖醇的组合。

IV.试剂盒

本披露还提供用于治疗患有遗传疾病(例如DMD)的患者的试剂盒，该试剂盒包含包装在合适容器中的至少一种反义分子(例如戈罗迪生)以及其使用说明书。试剂盒还可以含有外周试剂，如缓冲剂、稳定剂等。本领域普通技术人员应理解，上述方法的应用广泛应用于鉴定适合用于治疗许多其他疾病的反义分子。

实例

所有实例均来源于以下正在进行的首次人类临床试验，该临床试验测试SRP-4053的安全性和功效。在该研究的第2部分期间在第48周获得本文所报道的结果。

SRP-4053在DMD患者中的I/II期研究

ClinicalTrials.gov识别符：NCT02310906

这是评估SRP-4053在具有适合于外显子53跳跃的缺失的杜氏肌营养不良症(DMD)患者中的安全性、耐受性、功效和药代动力学的首次人类多剂量2部分研究。

研究类型：干预性

研究设计：分配：随机化

干预模式：并行分配

设盲：四重(参与者、护理提供者、调查员、结果评估员)

主要目的：治疗

官方名称：2部分、随机化、双盲、安慰剂对照、剂量滴定、安全性、耐受性和药代动力学研究(第1部分)，随后是SRP-4053在适合于外显子53跳跃的杜氏肌营养不良症患者中的开放标记功效和安全性评估(第2部分)

材料与方法

研究药物

药物物质戈罗迪生(又称为SRP-4053)是具有本文所述的化学结构的PMO，并且由Sarepta Therapeutics公司供应。将戈罗迪生药物产品以50mg/mL的浓度配制为在单次使用小瓶中供应的无菌等张的磷酸盐缓冲水溶液。在临床环境中经由IV输注施用之前，用生理盐水(0.9％氯化钠注射液)稀释该药物产品。

患者：合格

合格的患者为6岁至15岁，具有适合于跳跃外显子53的DMD基因框外缺失。

纳入标准：

·通过基因型确认诊断患有DMD。

·左右二头肌或另一上臂肌群完整。

·肺部和心脏功能稳定。

·在如研究方案中所规定的6MWT、北极星移动评估和起立(Gowers)测试中表现最差。

·接受稳定剂量的皮质类固醇持续至少6个月。

排除标准：

·先前用实验药剂BMN-195(SMT C1100)或PRO053进行治疗。

·目前或先前在研究开始之前12周内用任何其他实验性治疗进行治疗。

·在最近3个月内进行重大手术。

·存在其他临床重大疾病。

·在最近3个月内物理疗法方案发生重大变化。

可以应用其他纳入和排除标准。

研究设计

研究设计的汇总示于图1和紧接下方的表格中。

详细描述：

第1部分：随机化、安慰剂对照的剂量滴定以评估4个剂量水平的SRP-4053在具有适合于外显子53跳跃的缺失的基因型确认的DMD患者中的安全性、耐受性和药代动力学。

筛选/基线：

具有适合于外显子53筛选的确认突变的DMD患者参与4周至6周的筛选期以确保合格。进行治疗前腿部肌肉MRI和肌肉MRS(在具有MRS能力的选择部位)并且获得皮肤和肌肉活检。进行功能测试(6分钟行走测试[6MWT]、北极星移动评估[NSAA]和其他功能度量，并且采集潜在疾病相关生物标记的血液样品。还在筛选期间进行肺功能测试(PFT)、超声心动图(ECHO)和ECG。

剂量滴定：

将患者随机分组(2:1)以接受SRP-4053或安慰剂。患者接受剂量水平递增的安慰剂或SRP-4053的每周IV输注，各持续至少2周：在第1-2周4mg/kg/周；在第3-4周10mg/kg/周；在第5-6周20mg/kg/周；以及从第7周开始30mg/kg/周。一旦最后一名患者接受其30mg/kg的第二剂量，独立的DMC在开始第2部分的给药之前审查第1部分的累积安全性数据。DMC审查来自第1部分的安全性数据，并且建议在研究的开放标记区段(第2部分)进行每周一次30mg/kg IV输注。

第2部分：与具有不适合于外显子53跳跃的缺失的未经治疗的对照DMD患者相比，SRP-4053在来自第1部分的患者连同新入选的具有适合于外显子53跳跃的缺失的DMD患者中的开放标记评估。

第2部分是与具有不适合于外显子53跳跃的突变的未经治疗的DMD患者并行对照组相比在患者中每周一次SRP-405330mg/kg IV输注的安全性和功效的144周开放标记评估。

筛选/基线：

来自第1部分的患者(SRP-4053和安慰剂)继续进入第2部分。新的具有适合于外显子53跳跃的缺失的DMD患者入选开放标记SRP-4053治疗，治疗组中总共25名患者。具有不适合于外显子53跳跃的缺失、否则满足合格标准的至多24名DMD患者也入选第2部分以充当未经治疗的对照组。在4周至6周的筛选期期间确认所有新的第2部分患者的合格。

持续144周的开放标记治疗：

在第2部分中，治疗组中的所有患者以IV输注形式接受每周一次30mg/kg的SRP-4053，持续144周。新的第2部分经治疗的患者在基线进行皮肤和肌肉活检，并且所有经治疗的患者均需要在第2部分的第48周进行第二次肌肉活检。患者还进行功能性测试(如上文第1部分所述)和PFT，并且每12周至24周进行一次ECG。在研究过程中持续监测和收集不良事件和伴随药物治疗。在确认研究合格之后，除了体检和实验室评估时间表缩短并且无PK采样或活检以外，未经治疗的对照组中的患者进行与第2部分中经治疗的患者相同的研究程序。

主要结果量度：

·不良事件的发生率[时间范围：大约12周(第1部分)]

·临床实验室异常(血液学、化学、凝血、尿分析)的发生率[时间范围：大约12周(第1部分)]

·生命体征和体检异常的发生率[时间范围：大约12周(第1部分)]

·ECG和ECHO异常的发生率[时间范围：大约12周(第1部分)]

·6分钟行走测试(6MWT)从基线的变化[时间范围：基线至第144周(第2部分)]

·通过蛋白质印迹确定的肌养蛋白蛋白质水平[时间范围：基线至第48周(第2部分)]

次要结果量度：

·血浆中的药物浓度[时间范围：大约12周(第1部分)]

·肺功能测试[时间范围：基线至第144周(第2部分)]

最大呼气压力(MEP)％，最大吸气压力(MIP)％

·通过IHC确定的肌养蛋白阳性纤维的百分比[时间范围：基线至第48周(第2部分)]

·外显子53跳跃[时间范围：基线至第48周(第2部分)]

其他结果量度：

·不良事件的发生率[时间范围：144周(第2部分)]

·临床实验室异常(血液学、化学、凝血、尿分析)的发生率[时间范围：144周(第2部分)]

·生命体征和体检异常的发生率[时间范围：144周(第2部分)]

·ECG和ECHO异常的发生率[时间范围：144周(第2部分)]

·免疫原性[时间范围：144周(第2部分)]

实例1：生化功效评估

从25名参与多部位首次人类试验的患者获得基线和治疗中的肱二头肌的配对肌肉活检，该试验评估每周通过静脉内输注施用30mg/kg SRP-4053的安全性、耐受性和肌养蛋白产生(ClinicalTrials.gov识别符：NCT02310906)。对于每次手术，切除两块肌肉：A块和B块。对于所有测定，分别分析A块和B块。

通过优化方法检测肌肉活检以评估肌养蛋白蛋白质数量(蛋白质印迹，主要生物学端点)和外显子跳跃(RT-PCR)。新颖的自动化成像分析(MuscleMap^TM))使用免疫组织化学来评定估肌养蛋白的定位(平均纤维强度)。

对于蛋白质印迹分析：A块和B块在一式两份凝胶上运行＝4次测试取平均值

对于RT-PCR分析：A块和B块一式四份地运行＝8次测试取平均值

对于IHC分析：A块和B块在1级和2级运行＝4次测试取平均值

基线特征：

将经戈罗迪生治疗的群组中25名患者的基线特征汇总于表1中。呈现适合于外显子53跳跃的五种不同的基因型(在45-52；48-52；49-52；50-52；和52处突变缺失)。十七名患者最初接受研究第1部分中的安慰剂、随后转换成SRP-4053治疗，或者被入选SRP-4053治疗研究的第2部分。八名患者在研究的第1部分和第2部分接受SRP-4053。总共25名患者接受SRP-4053。

表1.基线人口统计学和疾病特征

1.基线是在第一剂量的研究药物(安慰剂或SRP-4053)之前的最后记录值

2.基线是在第一剂量的研究药物(安慰剂或SRP-4053)之前最后一次就诊的第1天和第2天的平均值

外显子跳跃的确定：

RT-PCR分析：

在每一研究设计的基线和48周通过RT-PCR测量外显子跳跃。对于RT-PCR分析，按照制造商方案使用Trizol试剂试剂盒从细胞中分离RNA。使用NanoDrop确定RNA的浓度和纯度。用根据表2的突变配对正向引物和反向引物通过RT-PCR测量外显子53跳跃。

表2.用于检测外显子53跳跃的引物

跳跃的产物和未跳跃的产物产生根据表3的扩增子大小。

表3.各患者突变的外显子53跳跃的和未跳跃的扩增子产物大小的汇总

在对RNA进行RT-PCR之后，使用LabChip GX分析样品，LabChip GX使用凝胶毛细管电泳。使用以下等式计算外显子跳跃百分比：(跳跃的条带的曲线下面积)/(跳跃的条带和未跳跃的条带的曲线下面积)×100。

RT-PCR结果的汇总示于表4中。接受至少48次每周剂量的SRP-4053的所有25名患者在外显子跳跃方面显示超过基线水平的增加(p<0.001)。

表4.RT-PCR结果确认DMD患者的外显子跳跃

图2示出了研究中25名患者中每一名的RT-PCR数据(基线和SRP-4053治疗后48周)，该研究导致确定在外显子跳跃方面存在超过基线水平的增加(p<0.001)。

肌养蛋白产生的确定：蛋白质印迹分析

对于蛋白质印迹分析，以大约5mm直径的9至18×20-μm组织切片在133μL缓冲液中的比率用均质化缓冲液(4％SDS、4M尿素、125mM tris-HCl(pH6.8))将组织均质化。收集相应的裂解物，并且按照制造商的说明书(BioRad目录号500-0122)使用RC DC蛋白质测定试剂盒对其进行蛋白质定量。使用均质化缓冲液以1:10稀释组织提取物样品，使其落入BSA标准曲线的范围内。制备样品，使得28μl样品含有40μg蛋白质、1×最终浓度NuPAGE LDS样品缓冲液(Life Technologies目录号NP0008,卡尔斯巴德(Carlsbad),加利福尼亚州(California),美国(USA))和1×最终浓度NuPAGE还原剂(10×)(Life Technologies目录号NP0004)。将蛋白质样品在105℃下加热5分钟之后，将样品离心并且将上清液以40μg总蛋白质/泳道加载于NuPAGE Novex 12孔、1mm、微型3％-8％聚丙烯酰胺tris-乙酸酯凝胶(Life Technologies Cat.EA0375)上。凝胶在室温下在150伏特下运行，直至染料前端离开凝胶。使用NuPAGE转移缓冲液(Life Technologies NP006-1)、10％甲醇和0.1％NuPAGE抗氧化剂(Life Technologies NP0005)将所得的蛋白质凝胶在室温下在30伏特下转移至PVDF膜(Life Technologies目录号LC2007)，持续75分钟。

在蛋白质转移之后，将PVDF膜浸入TTBS缓冲液(1×TBS(Amresco目录号J640-4L)、0.1％(v/v)tween-20)中。将膜转移至阻断缓冲液(5％(w/v)脱脂奶粉(Lab Scientific目录号M0841)于TTBS中)并且在4℃下伴随轻轻摇动浸泡过夜。在阻断之后，将膜在室温下在使用阻断缓冲液以1:20稀释的DYS1(Leica目录号NCL-DYS1)中孵育60分钟，或者在室温下在用阻断缓冲液以1:100,000稀释的抗α辅肌动蛋白抗体(Sigma-Aldrich目录号NA931V)中孵育20分钟，随后洗涤六次(每次用TTBS洗涤五分钟)。使用阻断缓冲液以1:40,000稀释与辣根过氧化酶缀合的抗小鼠IgG(GE Healthcare目录号NA931V)，并且将其添加至膜中45分钟(DYS1)或15分钟(α-辅肌动蛋白)，随后再洗涤六次。使用ECL Prime蛋白质检测试剂盒(GE Healthcare目录号RPN2232)，将膜暴露于凝胶并且相应地显影。使用ImageQuant TLPlus软件(版本8.1)扫描和分析显影的膜，并且使用Graphpad软件进行线性回归分析。

各蛋白质印迹凝胶包括使用总蛋白质制备的5点肌养蛋白标准曲线，该总蛋白质从正常组织提取并掺入DMD组织提取物中用于4％、2％、1％、0.5％、0.25％的最终正常对照(参见例如图5A和图5B)。如上所述处理标准曲线样品。通过将肌养蛋白条带强度与凝胶标准曲线相比较来确定作为正常对照肌养蛋白水平的百分比(％NC)的肌养蛋白蛋白质水平。

如通过蛋白质印迹所测量的正常肌养蛋白蛋白质的平均％从基线的0.09％增加至治疗中的1.02％(范围0.09％-4.3％)，表示从基线的+0.93％的平均变化(p<0.001)。

蛋白质印迹结果的汇总示于表5中。如通过蛋白质印迹所测量，患者表现出肌养蛋白蛋白质超过基线的统计学上显著的增加。

表5.蛋白质印迹结果确认DMD患者的肌养蛋白产生

图3示出了研究中25名患者中每一名的蛋白质印迹数据(基线和SRP-4053治疗后48周)，该研究导致确定在肌养蛋白蛋白质方面超过基线的统计学上显著的增加。

观察到在外显子跳跃与从头合成肌养蛋白蛋白质之间的正相关(Spearman-r＝0.500，p＝0.011)。

平均纤维强度的分析表明，从头合成肌养蛋白蛋白质高于基线的统计学上显著的增加(p<0.001)，并且肌养蛋白正确地定位于肌纤维膜(图4A-图5B)。

在所有患者中均观察到外显子跳跃和肌纤维膜肌养蛋白定位。

IHC阳性肌养蛋白纤维百分比的汇总示于表6中。如通过IHC所测量，所有患者均表现出阳性肌养蛋白纤维百分比超过基线的统计学上显著的增加。

表6.IHC结果

如表5和表6以及图4A-图5B中可见，蛋白质印迹数据与PDPF和强度相关，表明DMD患者的肌养蛋白产生由用SRP-4053治疗引起。

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将本说明书中所引用的所有公开和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的公开或专利申请具体地且单独地指示通过引用并入。