阅读说明：本技术 二氨基胍衍生物及其饲用组合物在制备兽医用药物中的应用 (Application of diaminoguanidine derivative and feeding composition thereof in preparation of veterinary medicine ) 是由 彭险峰 于 2019-07-22 设计创作，主要内容包括：二氨基胍衍生物及其饲用组合物在制备兽医用药物中的应用。一种结构如式(Ⅰ)所示的二氨基胍衍生物或其立体异构体,几何异构体,互变异构体,溶剂合物,药学上可接受的盐或其前药,在制备动物用药物中的应用,所述药物是用于防护、处理、治疗或减轻由细菌感染引起的疾病的药物：其中R为NO<Sub>2</Sub>、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示基团；R<Sub>1</Sub>为直链或支链的C<Sub>1</Sub>-C<Sub>20</Sub>烷基；A为O,N或S；R<Sub>2</Sub>为直链或支链的C<Sub>3</Sub>-C<Sub>14</Sub>烷基,C<Sub>5</Sub>-C<Sub>6</Sub>环烷基,C<Sub>5</Sub>-C<Sub>6</Sub>芳基或CH<Sub>2</Sub>(C<Sub>5</Sub>-C<Sub>6</Sub>芳基)。该二氨基胍衍生物是一种对动物无毒安全的化合物,应用在养殖动物的生殖系统、皮肤等感染性疾病的治疗具有显著的疗效。<Image he="96" wi="700" file="DDA0002506520790000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(Application of diaminoguanidine derivatives and feeding compositions thereof in preparation of veterinary drugs. Use of a diaminoguanidine derivative having the structure of formula (i) or a stereoisomer, geometric isomer, tautomer, solvate, pharmaceutically acceptable salt or prodrug thereof, for the manufacture of a medicament for use in the prevention, treatment or alleviation of a disease caused by a bacterial infection in an animal: wherein R is NO 2 A group of formula (II) or (III); r 1 Is straight-chain or branched C 1 ‑C 20 An alkyl group; a isO, N or S; r 2 Is straight-chain or branched C 3 ‑C 14 Alkyl radical, C 5 ‑C 6 Cycloalkyl radical, C 5 ‑C 6 Aryl or CH 2 (C 5 ‑C 6 Aryl). The diaminoguanidine derivative is a compound which is nontoxic and safe to animals, and has obvious curative effect when being applied to the treatment of infectious diseases of reproductive systems, skins and the like of cultured animals.)

二氨基胍衍生物及其饲用组合物在制备兽医用药物中的应用

技术领域：

本发明属于药物领域，具体涉及一种二氨基胍衍生物及其药物组合物在制备动物用药物中的应用，具体为制备用于防护、处理、治疗或减轻由细菌感染引起的疾病的药物。

背景技术：

在动物养殖业中，畜禽常常会因细菌感染而引起炎症性疾病，如泌尿生殖系统疾病、胃肠道疾病、呼吸系统疾病、皮肤感染等等，将会严重的影响到畜禽的生产性能和健康，常用且有效的方法是抗菌药物或激素疗法。随着抗菌药物的大量使用，耐药菌株不断增加，且抗菌药物或激素等的应用不可避免地的出现动物产品中药物残留，给人类健康带来严重的危害。

发明内容

：

基于此，本发明提供一种药用组合物，其包含一种二氨基胍衍生物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、溶剂合物、药学上可接受的盐或其前药至少一种和任选的可饲用辅料；还提供了所述药用组合物及所述二氨基胍衍生物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、溶剂合物、药学上可接受的盐或其前药在制备动物用药物中的应用，目的在于为现阶段的养殖业提供安全有效的动物用抗感染药物。

为了实现本申请的至少一个目的，特采用如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种结构如式(Ⅰ)所示的二氨基胍衍生物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、溶剂合物、药学上可接受的盐或其前药。

在一些技术方案中，R为NO₂、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示基团；

R₁为直链或支链的C₁-C₂₀烷基；A为O，N或S；R₂为直链或支链的C₃-C₁₄烷基，C₅-C₆环烷基，C₅-C₆芳基或CH₂(C₅-C₆芳基)。

在一些技术方案中，所述的R为式(Ⅱ)，R₁为直链的C₁-C₂₀烷基。

在一些技术方案中，所述的R为式(Ⅱ)，R₁为直链的C₁-C₁₂烷基。

在一些技术方案中，所述的R为式(Ⅱ)，R₁优选为甲基。

在一些技术方案中，所述的R为式(Ⅲ)，其中的A优选为O。

在一些技术方案中，所述的R为式(Ⅲ)，其中的A优选为N。

在一些技术方案中，所述的R为式(Ⅲ)，其中的R₂为直链的C₃-C₁₄烷基。

在一些技术方案中，所述的R为式(Ⅲ)，其中的R₂为支链的C₃-C₁₄烷基。

在一些技术方案中，所述的R为式(Ⅲ)，其中的R₂优选为支链的C₃烷基或支链的C₄烷基。

在一些技术方案中，所述的二氨基胍衍生物的药学上可接受的盐为DL-乳酸盐，甲磺酸盐，2-羟乙基磺酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，苯甲酸盐，琥珀酸盐，富马酸盐，马来酸盐，醋酸盐，硫酸盐，磷酸盐或草酸盐。

另一方面，本发明提供了一种药用组合物，其包含结构如式(Ⅰ)所示的二氨基胍衍生物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、溶剂合物、药学上可接受的盐或其前药的至少一种和任选的可药用辅料。

在一些技术方案中，所述的药用组合物还包含一种或多种治疗剂。

另一方面，本发明提供了结构如式(Ⅰ)所示的二氨基胍衍生物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、溶剂合物、药学上可接受的盐或其前药及其药用组合物在制备动物用药物中的应用。

在一些技术方案中，所述的药物为用于防护细菌感染引起的疾病。

在一些技术方案中，所述的药物为用于治疗细菌感染引起的疾病。

在一些技术方案中，所述的药物为用于减轻细菌感染引起的疾病症状。

另一方面，本发明还提供了一种防护、处理、治疗或减轻由细菌感染引起的疾病的方法，所述的方法是基于由结构如式(Ⅰ)所示的二氨基胍衍生物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、溶剂合物、药学上可接受的盐或其前药及其药用组合物制备的药物抑制细菌的生长实现的。

本发明的有益效果：

本发明提供的二氨基胍衍生物是一种对动物无毒安全的化合物，应用在养殖动物的生殖系统、皮肤等感染性疾病的治疗具有显著的疗效。

本发明的任一方面的任一实施方案可以与其他实施方案进行组合，只要它们之间不出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们之间不会出现矛盾。

具体实施方式

前面所述内容只是概述了本申请的某些方面，但不限于这些方面。上述涉及内容及其他方面的内容将在下面做更加具体完整的描述。

本发明的进一步详细描述。

现在详细描述本发明的某些实施方案，其实例由随附的结构式和化学式加以说明。本发明的意图涵盖所有的替代、修改和等同的技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明的范围内。另外，本发明的某些技术特征为清楚可见，在多个独立的实施方案中分别进行描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供或以任意适合的子组合形式提供。

化合物

本发明涉及的化合物是一种结构如式(Ⅰ)所示的二氨基胍衍生物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、溶剂合物、药学上可接受的盐或其前药。

其中，R是式(Ⅰ)苯环上4-位上的取代基，选自NO₂、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)。R₁为直链或支链的C₁-C₂₀烷基；A为O、N或S；R₂为直链或支链的C₃-C₁₄烷基、C₅-C₆环烷基、取代的或非取代的C₅-C₆芳基或CH₂(C₅-C₆芳基)。

一般的，“取代的”表示所给结构中的一个或多个可被取代的氢原子被具体取代基所取代，一个取代的基团可以有一个取代基在基团各个可取代的位置进行取代，当所给出的结构式中不只一个位置能被具体基团的一个或多个取代基所取代，那么取代基可以相同或不同地在各个位置取代。

本发明所述的“前药”为一个化合物在体内转化为式(Ⅰ)所示的化合物。这样的转化受前体药物在血液中水解或在血液或组织中经酶转化为母体结构的影响。

在本发明中，“C_a-C_b烷基”表示含有a个至b个碳原子的直链或支链的饱和烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、……，如“C₁-C₅烷基”是表示含有1个至5个碳原子的直链或支链的饱和烷基；“C₅-C₆环烷基”表示为包含5个或6个碳原子的只含碳氢两种元素的环状烷基，如环戊基或环己基等；“C₅-C₆芳基”表示含有5个或6个碳原子具有芳香性的环状基团，如苯环等。

在一些实施方案中，所述的二氨基胍衍生物中R为式(Ⅱ)，R₁为直链的C₁-C₂₀烷基。

进一步的，所述的R₁为直链的C₁-C₁₂烷基。

在一实施例中，所述的二氨基胍衍生物中R为式(Ⅱ)，R₁为甲基。

在一些实施方案中，所述的二氨基胍衍生物中R为式(Ⅱ)，R₁为支链的C₁-C₂₀烷基。

进一步的，所述的R₁为支链的C₃-C₄烷基。

在一实施例中，所述的二氨基胍衍生物中R为式(Ⅱ)，R₁为异丙基。

在一些实施方案中，所述的二氨基胍衍生物中R为式(Ⅲ)。

可选的，A为O、N或S。

在一些实施例中，所述的二氨基胍衍生物中R为式(Ⅲ)时，所述的A为O。

在另一些实施例中，所述的二氨基胍衍生物中R为式(Ⅲ)时，所述的A为N。

在一些实施方案中，所述的二氨基胍衍生物中R为式(Ⅲ)，R₂为直链或支链的C₃-C₁₄烷基。

可选的，所述的R₂为直链的C₃-C₁₄烷基。

进一步的，所述的R₂为直链的C₃-C₁₂烷基。

在一些实施例中，所述的R₂为正丙基。

在另一些实施例中，所述的R₂为正丁基。

又可选的，所述的R₂为支链的C₃-C₁₄烷基。

进一步的，所述的R₂为支链的C₃-C₅烷基。

在一些实施例中，所述的R₂为异丙基。

在一些实施方案中，所述的二氨基胍衍生物中R为式(Ⅲ)，R₂为C₅-C₆环烷基。

在一些实施例中，所述的R₂为环戊基。

在一些实施方案中，所述的二氨基胍衍生物中R为式(Ⅲ)，R₂为取代或非取代的C₅-C₆芳基。

进一步的，所述的R₂为非取代的C₅-C₆芳基。

在一实施例中，所述的R₂为苯基。

又进一步的，所述的R₂为取代的C₅-C₆芳基，所述的芳基为任选地被1、2、3、4或5个R³所取代，R³为-OH、-NH₂、-NO₂、-CN、-SH、-X、-C₁-C₅烷氧基、-C₁-C₅烷基或被X取代的C₁-C₅烷基，其中X选自F、Cl、Br或I。

具体的，所述的C₅-C₆芳基优选为苯基。

在一些实施方案中，所述的二氨基胍衍生物中R为式(Ⅲ)，R₂为取代或非取代的CH₂(C₅-C₆芳基)。

进一步的，所述的R₂为非取代的CH₂(C₅-C₆芳基)。

在一实施例中，所述的R₂为苄基。

进一步的，所述的R₂为取代的CH₂(C₅-C₆芳基)，所述的芳基为任选地被1、2、3、4或5个R³所取代，R³为-OH、-N H₂、-NO₂、-CN、-SH、-X、-C₁-C₅烷氧基、-C₁-C₅烷基或被X取代的C₁-C₅烷基，其中X选自F、Cl、Br或I。

具体的，所述的R₂为取代的苄基，所述的苄基上的苯环任选地被1、2、3、4或5个R³所取代，R³为-OH、-NH₂、-N O₂、-CN、-SH、-X、-C₁-C₅烷氧基、-C₁-C₅烷基或被X取代的C₁-C₅烷基，其中X选自F、Cl、Br或I。

在一些具体的实施例中，本发明包括的二氨基胍衍生物包括化合物1、化合物2、化合物3和化合物4，依次结构如下：

在一些实施方案中，所述二氨基胍衍生物为药物可接受的盐，优选为与酸结合的复合盐。

可选的，所述的酸为有机酸或无机酸。

具体的，所述的无机酸包括但不限于硫酸、甲磺酸、盐酸或磷酸，所述的有机酸包括但不限于DL-乳酸，2-羟乙基磺酸，柠檬酸，酒石酸，苯甲酸，琥珀酸，富马酸，马来酸，醋酸或草酸。

化合物的制备与纯化

本发明涉及的二氨基胍衍生物为二氨基胍与4-位取代苯甲醛发生席夫碱反应而得的系列化合物，方法详见CN103880712A，所述的4-取代苯甲醛结构如式(Ⅳ)所示。

其中，R是式(Ⅰ)苯环上4-位上的取代基，选自NO₂、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)。R₁为直链或支链的C₁-C₂₀烷基；A为O、N或S；R₂为直链或支链的C₃-C₁₄烷基、C₅-C₆环烷基、取代的或非取代的C₅-C₆芳基或CH₂(C₅-C₆芳基)。

当R为具有手性结构的取代基时，式(Ⅳ)所示的苯甲醛类化合物将会呈现出一定的手性特征，并且与二氨基胍反应生成的产物也可能会具备手性特征，将会呈现出不同的立体异构体化合物或互变异构体。

当二氨基胍与式(Ⅳ)所示的苯甲醛类化合物反应生成的二氨基胍衍生物具有刚性结构时，反应底物在反应过程中可生成不同的几何异构体产物。

上述的立体异构体、几何异构体、互变异构体也包括在本发明的实施范围内。

本发明涉及的“立体异构体”是指具有相同化学构造，但原子或基团在空间上的排列方式不同的化合物，包括对映异构体、非对映异构体、构象异构体、几何异构体、阻转异构体等。“对映异构体”是指一个化合物的两个不能重叠但互成镜像关系的异构体。“非对映异构体”是指有两个或多个手性中性并且其分子不互为镜像的立体异构体，具有不同的熔点、沸点、光谱性质和反应性等物理性质。非对应异构体混合物可通过高分辨分析操作如电泳或色谱来分离；“互变异构体”是指具有不同能量的可通过低能垒互相转化的结构异构体。

在一些实施方案中，本发明提供二氨基胍衍生物的制备过程还涉及反应产物的分离、纯化或重结晶过程。反应产物可通过脱溶剂法从反应体系中获得粗品。为了获得化学纯度更高、杂质含量更低的固体物质，粗品经醇溶剂、醇水混合溶剂或其他可用于产品重结晶的有机溶剂中在合适的温度、光照以及机械振动等条件下溶解、析晶或沉淀或重结晶和分离得到具有一定晶型状态的二氨基胍衍生物。所述具有一定晶型状态的二氨基胍衍生物是二氨基胍衍生物结晶或二氨基胍衍生物的溶剂合物。所述的二氨基胍衍生物的溶剂合物可选自二氨基胍衍生物的水合物或二氨基胍衍生物的乙醇合物。

本发明涉及的“溶剂合物”是指本发明的化合物与溶剂分子接触的过程中，外部条件与内部条件因素造成通过非共价分子间力而结合化学当量或非化学当量的溶剂分子而形成的共晶缔合物。形成溶剂合物的溶剂包括但是不限于水、丙酮、乙醇、甲醇、二甲亚砜、乙酸乙酯、乙酸、异丙醇等溶剂。“水合物”是指溶剂分子是水所形成的缔合物或结晶体，也就是通过非共价分子间力而结合化学当量或非化学当量的水的化合物。

本发明提供的二氨基胍衍生物的制备为了获得化学纯度更高、杂质含量更低的固体物质还可通过盐析法后进行处理。所述的盐析法是利用酸碱中和法、酸碱配位法或酸碱螯合法的原理使氨基酸衍生物与相应的有机碱、无机碱、有机酸或无机酸成盐沉淀的过程，获得药物可接受的盐；所述的无机酸包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐或它们的组合。

饲料可接受的盐为本发明的二氨基胍衍生物与对动物无毒的有机碱、无机碱、有机酸或无机酸形成的盐。所述的“饲料可接受的”是指物质或组合物必须是适合化学或毒理学的，与组成的饲料或食用的养殖动物有关。

在一些实施方案中，本发明的二氨基胍衍生物在后处理的盐析沉淀过程中，有机酸形成酸碱配位盐和或酸碱螯合盐，所述的有机酸包括但不限于乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、延胡索酸、丙二酸、苹果酸、2-羟基丙酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、葡萄糖醛酸、半乳糖醇酸、柠檬酸、酒石酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、对甲基苯甲酸、肉桂酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、三氟甲磺酸或它们的组合。

本发明涉及的药用组合物

一种包含如式(Ⅰ)所示的二氨基胍衍生物及其消旋体、立体异构体、几何异构体、互变异构体、溶剂合物或药物可接受的盐的至少一种和可药用辅料的饲用组合物，所述的二氨基胍衍生物的在组合物中的量能有效的控制病畜的病情。

本发明涉及的“组合物”是指包含一种或一种以上的化合物组成有效成分的化合物集体。

本发明所述的“包含”为开放式表达，既包括本发明所明指的内容，但并不排除其他方面的内容。

所述的可药用辅料为可药用的载体、辅剂、稀释剂、赋形剂、溶媒、分散剂、悬浮剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、固体粘合剂或润滑剂、或它们的组合。本发明涉及的“载体”是指能够承载活性成分，改善其分散性，并有良好的化学稳定性和吸附性的可药用物质。本发明涉及的辅料包括但不限于离子交换剂、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白、磷酸盐等缓冲物质、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的甘油酯混合物、水、盐、电解质、硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、蜡、羊毛脂、糖、淀粉、纤维素及其衍生物、树胶粉、麦芽、明胶、滑石粉；辅料如可可豆酯、栓剂蜡状物；油如花生油、棉籽油、红花油、麻油、橄榄油、玉米油、豆油；二醇类化合物如丙二醇、聚乙二醇；酯类如乙基油酸、乙基月桂酸酯、琼脂；缓冲剂如氢氧化镁、氢氧化铝；海藻酸、乙醇、磷酸缓冲溶液、月桂酸钠等润滑剂、着色剂包衣材料、甜味剂、调味剂、香料、防腐剂、抗氧化剂。

所述的辅剂为使物质本身固有的黏性诱发出来的润湿剂、使物质黏合起来的粘合剂、使物质整体的片状物裂碎为许多细小颗粒的崩解剂、降低颗粒间摩擦力的助留剂或防止物料黏着的抗黏剂，包括但不限于硬脂酸镁、滑石粉、植物油、月桂醇硫酸镁、淀粉、淀粉浆、水、无机盐、糊精、糖粉等。

本发明涉及的“溶媒”是指溶解或分散固体所需的溶剂，包括但不限于水、乙醇、甘油等。

在一些实施方案中，所述的药用组合物进一步包含一种或多种治疗剂。

所述的治疗剂包括但不限于驱虫保健剂、兽医用抗生素或中草药等药物饲料添加剂。

具体地，所述的药物饲料添加剂包括但不限于具有预防动物疾病、促进动物生长作用并可在饲料中长期添加使用而掺入载体或稀释剂的兽药预混合物质。

更进一步具体地，所述的药物饲料添加剂为饲用抗生素，所述的饲用抗生素包括但不限于多粘菌素、盐霉素、阿维拉霉素、杆菌肽、维吉尼亚霉素、那西肽、黄霉素、恩拉霉素、北里霉素、喹乙醇、土霉素或金霉素。

本发明涉及的二氨基胍衍生物及其药用组合物的应用。

本发明提供了上述二氨基胍衍生物及包含其的药用组合物在制备动物用药物中的应用。

在一些实施方案中，所述的药物为用于防护细菌感染引起的疾病的物质。

在一些实施方案中，所述的药物为用于防护细菌感染引起的疾病的物质。

在一些实施方案中，所述的药物为用于治疗细菌感染引起的疾病的物质。

在一些实施方案中，所述的药物为用于减轻细菌感染引起的疾病症状的物质。

可选的，所述的细菌为革兰氏阳性菌，包括但不限于肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血链球菌、肠球菌、草绿色链球菌。

进一步的，所述的细菌优选为金黄色葡萄球菌。

在一些实施例中，所述的细菌感染引起的疾病为金黄色葡萄球菌引起的皮肤感染。

在一些实施例中，所述的细菌感染引起的疾病为胃肠道感染。

在一些实施例中，所述的细菌感染引起的疾病为呼吸道感染。

在一些实施例中，所述的细菌感染引起的疾病为泌尿生殖系统疾病，包括乳腺炎、子宫内膜炎、尿道炎等。

在一些实施方案中，所述的二氨基胍衍生物或其药用组合物在制备动物用药中以特定剂型存在。

可选的，所述的特定剂型包括但不限于口服剂型、注射剂型、栓剂、外用剂型或灌注液。

具体的，所述的特定剂型除了药用辅料外含有有效治疗剂量的二氨基胍衍生物。

进一步具体的，所述的特定剂型根据临床用药的规律具有特定的独立可用规格。

动物治疗的方法。

本发明还提供了一种治疗动物中由细菌感染引起的疾病的方法。

可选的，所述的方法包括但不限于口服或注射给与动物使用二氨基胍衍生物或其药用组合物的药物制剂。

进一步的，所述的药物制剂包括但不限于片剂、胶囊剂、注射液、水剂、丸剂、贴剂等。

又进一步的，所述的制剂根据不同动物生长阶段的有效剂量的需要含有不同剂量的二氨基胍衍生物。

本发明的二氨基胍衍生物或可药用组合物的“有效剂量”是指处理或减轻一个或多个本发明所提到的病症的严重度的有效量。

在一些实施方案中，所述的动物为各个生长阶段的宠物、家畜或家禽。

可选的，所述的宠物包括但不限于狗或猫；所述的家畜包括但不限于各个生长阶段的猪、牛、羊、驴或马；所述的家禽包括但不限于鸡、鸭、鹅、鹌鹑。

在一些实施方案中，包含所述二氨基胍衍生物的或其药用组合物的治疗方法还进一步包括对患病动物给与附加治疗剂，其中附加治疗剂包括但不限于化学疗法、抗炎剂、中药制剂、物理治疗法等。其中附加治疗剂适用于所治疗的疾病，其附加治疗剂可以和本发明的二氨基胍衍生物或其药用组合物联合给药。本发明的二氨基胍衍生物或其药用组合物为单个剂型、或分开的化合物或组合物作为多剂型的一部分。附加治疗剂可以与本发明的二氨基胍衍生物同时给药或不同时给药。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例对本发明的化合物、组合物及应用进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1二氨基胍衍生物对母猪产后子宫内膜炎的治疗效果。

选取5个不同猪场中患有子宫内膜炎的母猪，每个猪场30例，合计病例150例，随机分组，并设立不治疗对照组，对各试验组的病猪进行子宫灌注药物，治疗1-4组灌注的子宫灌注剂的主要成分分别依次为化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，给药剂量为10mg/kg，对照组则给与等体积的生理盐水。给药频率为一日一次，连续使用7天，治疗效果如表1所示。

表1二氨基胍衍生物的治疗效果

组别		动物数量	治疗结果	治愈率
					对照组	-	30	恶化	-
治疗组1	化合物1	30	治愈27头，症状改善1头	93.3％
					治疗组2	化合物2	30	治愈29头，症状改善1头	100％
治疗组3	化合物3	30	治愈25头，症状改善2头	90.0％
					治疗组4	化合物4	30	治愈25头，症状改善5头	100％

实验结果表明，5个猪场患有子宫内膜炎的病猪150例，试验中均为随机选择病猪，分为治疗组和不治疗对照组经子宫灌注给与药物后，连续观察7天，治疗组的病猪的病情得到有效治疗或改善，治愈率高达90％以上。不治疗对照组的病猪病情进一步恶化。

实施例2化合物2对母猪产后乳腺炎的治疗效果

在养猪试验场，对产后母猪曾经出现乳房红肿热痛、不让仔猪吃乳、体温升高、精神不振、食欲减退或废绝、泌乳减少、病初乳汁呈稀薄水样，后变为浓汁样含絮状物等现象进行试验治疗，分为两组，每组10头，分别为对照组和试验组。对照组肌注青霉素50万单位/头和链霉素50万单位/头，每天一次，连续肌注5天。试验组在日粮中添加化合物2，每次10mg/kg.w，每天两次，连续喂食5天。试验结果如表2所示。

表2化合物2对产后母乳乳腺炎的治疗效果

试验结果表明，化合物2对母乳乳腺炎具有很好的治疗效果，治愈率达到了90％以上，治疗效果优于肌注青霉素和链霉素的治疗方法。

实施例3化合物2对小鼠皮肤感染的治疗效果

将每只小鼠置于诱导箱中进行异氟烷诱导麻醉，剪下一片背部皮毛以露出皮肤，并用手持式冲孔机取下一块圆形皮肤，在背部上留下具有中央腔的伤口。将伤口用2.5*10^{- 7}CFU/mL金黄色葡萄球菌悬浮液10μL进行接种感染，将小鼠置于用小鼠编号标记的各个恢复箱中，记录接种时间和小鼠的初始体重。待小鼠恢复到全意识状态时放回各个笼子进行4小时的术后或麻醉并发症监控。在感染后大约4-6小时，将伤口用0.2g媒介物制剂或化合物2含量为20mg/g的制剂进行局部处理，每隔12小时对感染的皮肤伤口再次处理，总共处理14次，连续监控观察七天。七天后，对小鼠施与安乐死，解剖原始感染伤口区域并取下，通过标准微生物学测试细菌含量，并确认收获菌株为金黄色葡萄球菌。试验结果为，在媒介物处理组中观察到的每克组织的平均菌落计数为5381475，在化合物2处理组中观察到的每克组织的平均菌落计数为2207，每克组织的菌落降低百分含量如表3所示。

表3化合物2对小鼠细菌感染伤口的治疗效果

试验组	CFU/g	降低％
			媒介物	5381475	-
化合物2	2207	99.96

从试验结果可知，用化合物2处理导致了感染性金黄色葡萄球菌的数量显著降低，证明化合物2对小鼠的皮肤感染进行了有效的治疗。

实施例4化合物2的使用安全性评价试验

实施例4.1化合物2对大鼠的经口急性毒性试验

1材料与方法

1.1试验材料

实验动物：清洁级健康Wistar大鼠40只，体重160～200g，雌、雄各半，由扬州大学比较医学中心提供。

受试物：化合物2，由广州英赛特生物技术有限公司提供，临用前用1％羧甲基纤维素钠溶液制成所需浓度的混悬液。

给药方法：给药途径为经口给药，给予受试物体积为1.0ml/100g b.w.，给药前禁饲12h，不限制饮水，给药后3h饲喂。

1.2试验步骤

1.2.1预试验

每组设4只大鼠(雌、雄各半)进行预试验，测定4/4致死剂量(b)和0/4致死剂量(a)。预试验测得化合物2对大鼠的0/4致死剂量a＝700mg/kg b.w.，4/4致死剂量b＝5000mg/kg b.w.。

1.2.2正式试验

一般设5～7个剂量组。根据预试验获得的4/4致死剂量(b)和0/4致死剂量(a)的比值来确定正式试验组数(N)，比值为2～3时，设4～5组；比值为3～10时，设5～7组。本试验设6个剂量组。

按公式求得相邻两组剂量比值(r)，式中r—相邻两组剂量的比值、b—最低全致死剂量、a—最高不致死剂量、n—组数，根据此式计算大鼠经口急性毒性试验中r值为1.48。

以预试验获得的4/4致死剂量(b)作为正式试验高剂量组(第一组)的剂量，按r值等比求得其它各剂量组的剂量。

实验动物分组：清洁级健康Wistar大鼠60只，采用完全随机法随机分为6组，每组10只，雌雄各半，雄、雌动物分开进行正式试验。

受试物溶液配制：按“1：K系列稀释法”等容量配制大鼠各剂量组所需的受试物溶液，根据设计的试验剂量，按试验动物给予受试物的体积要求，首先确定最大剂量组所需配制的受试物溶液浓度C1以及各剂量组所需受试物溶液的体积m。

受试物母液应配制的浓度C＝C1，应配制的体积M(mL)按下列公式计算：式中K为各组剂量的比值，K＝1/r。

根据母液浓度及体积计算需称取的受试物量(mg或mL)。

称取受试物，置烧杯内，加入选定的溶剂(1％羧甲基纤维素钠溶液)溶解或稀释，转入容量瓶内，充分混匀并定容，即获得浓度C＝C1的受试物母液。从中取出供最高剂量组给药用的溶液体积m，向原溶液中加入同体积的溶剂，混匀后溶液浓度为C1×K，正好是次高剂量组所要求的剂量浓度C2；从中取出供第二组给药用的溶液体积m，再加入同体积的溶剂，混匀后溶液浓度为C2×K，正好是第三组所要求的剂量浓度C3，依此类推，配制得到各剂量组所需浓度及体积的受试物溶液。

试验1～6组化合物2的经口给药剂量依次为700mg/kg、1037mg/kg、1537mg/kg、2277mg/kg、3374mg/kg、5000mg/kg。

试验观察：给药结束后，每日两次观察大鼠的一般状况，包括体重、精神状态、毛色、自主活动、呼吸、饮食欲、粪便、口鼻分泌物，中毒症状和死亡情况。对观察期间死亡大鼠进行大体解剖学检查，并记录全部大体病理变化。连续观察14天。试验结束后将存活大鼠处死，观察剖检症状。

1.2.3数据整理

根据试验记录，整理获得各项数据。采用改良寇氏法用下式计算LD₅₀值及其95％可信限。

LD₅₀＝log^-1[X_m-i(∑p-0.5)]

当不含0％和100％死亡率时，用下式计算LD50：

LD₅₀的95％可信限＝log-1(log LD₅₀±1.96×Sx50)

以上各式中：i—组距，即相邻两组剂量对数剂量之差；Xm—最大剂量对数；P—各剂量组死亡率(死亡率均用小数表示)；Pm—最高死亡率；q—各组剂量存活率，q＝1-p；Pn—最低死亡率；∑p—各剂量组死亡率之和；n—各组动物数；Sx50—logLD₅₀的标准误

1.2.4结果评定

根据受试物半数致死量(LD₅₀)，参照化学物急性毒性(LD₅₀)剂量分级表(表4)，评定受试物毒性分级。

表4化学物急性毒性(LD₅₀)剂量分级表

2试验结果

2.1中毒症状

大鼠经口给药后25min，高剂量组大鼠出现精神沉郁，被毛粗乱无光，并逐渐转入抑制，反应迟钝、不食、麻痹。0.5h～1.0h后有大鼠出现呼吸困难伴随脖颈伸直、食欲废绝，3h后开始出现死亡，大鼠死亡前出现惊厥、抽搐、震颤等神经症状。急性死亡发生于给药后3～24h。中毒死亡后剖解主要表现对肝脏的损伤，其次是肺和心脏。肝脏的主要变化包括：表面有出血点、淤血、水肿和呈黄褐色等，肺的主要病理变化为表面淤血水肿等，心脏的主要病变为心肌颜色变淡、冠状动脉充血。

2.2急性经口LD₅₀

给药结束后14天，根据各剂量组死亡率(见表5)，计算化合物2对大鼠的急性经口LD₅₀为1870.83mg/kg b.w.，其LD₅₀ 95％可信限为1516.98～2307.21mg/kg b.w.。

表5化合物2经口急性毒性试验中大鼠死亡率统计

组别	剂量(mg/kg b.w.)	动物数(只)	死亡动物数(只)	死亡率(％)
					1	700	10	0	0
2	1037	10	2	20
					3	1537	10	3	30
4	2277	10	7	70
					5	3374	10	8	80
6	5000	10	10	100

3试验结论

本试验所得化合物2对Wistar大鼠的急性经口LD₅₀为1870.83mg/kg b.w.，根据化学物急性毒性(LD₅₀)剂量分级表(表4)，化合物2经口急性毒性级低毒。

实施例4.2化合物2的鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验

试剂：化合物2(异丙氧苯胍，批号：20150419)，由广州英赛特生物技术有限公司提供，4℃密封保存备用；标准诱变剂为叠氮化钠、2-氨基芴、敌克松，均为分析纯；磷酸氢钠胺、枸椽酸、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钠、氯化钾、氯化镁、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、二甲基亚砜、D-生物素、L-组氨酸、葡萄糖、6-磷酸葡萄糖、还原型辅酶Ⅱ、琼脂粉、牛肉膏、胰胨等，均为分析纯试剂。

仪器设备：双人单面超净工作台、JA2003电子天平、SZ-2自动双重蒸馏器、QYC-200C空气恒温摇床、D98-9052B-2隔水式电热恒温培养箱、YXQ.SG41.280手提式压力蒸汽灭菌器、微量移液器(10μL、100μL、200μL、1000μL)、超低温冰箱(-80℃)、Centrifuge 5415R高速冷冻离心机、电热恒温水浴箱、D98-9052B-2电热恒温培养箱、菌落计数器、培养皿等。

1.1.培养基及试剂配制

营养肉汤培养基：牛肉膏2.5g、胰胨5.0g、氯化钠2.5g、磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)1.3g、加蒸馏水至500.0mL。加热溶解，用1N氢氧化钠溶液调pH至7.4，分装后于0.103MPa下高压灭菌20min，4℃保存备用。

营养肉汤琼脂培养基：琼脂粉1.5g、营养肉汤培养基100.0mL。加热融化后，用1N氢氧化钠溶液调pH至7.4，于0.103MPa下高压灭菌20min，趁热无菌倒入平皿(直径90mm)，约25mL/皿，待冷却凝固后，37℃培养过夜去除表面水分，4℃保存备用。

顶层培养基：L-组氨酸(MW：155)78.0mg、D-生物素(MW：244)122.0mg、加蒸馏水至1000.0mL，将各成分加热以溶解生物素得0.5mmol/L组氨酸-生物素溶液，然后在0.068MPa下高压灭菌20min，4℃保存备用。琼脂粉1.2g、氯化钠1.0g、加蒸馏水至200.0mL，各成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min，4℃保存备用。临用前加热融化，无菌加入0.5mmol/L组氨酸-生物素溶液20mL，混匀后分装于灭菌小试管中，每管2mL，45℃保温待用。

1.1.5 10％S9混合液配制

分别配置1.65mol/L氯化钾溶液、0.4mol/L氯化镁溶液、0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)、0.025mol/L辅酶Ⅱ(氧化型)溶液和0.05mol/L葡萄糖-6-磷酸溶液，氯化钾、氯化镁和磷酸盐缓冲溶液于0.103MPa下高压灭菌20min，4℃冰箱保存备用，辅酶Ⅱ(氧化型)溶液和葡萄糖-6-磷酸溶液过滤除菌，-20℃以下冰箱保存备用。

每10mL10％S9混合液由以下成分组成：0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)6.0mL、1.65mol/L氯化钾溶液0.2mL、0.4m ol/L氯化镁溶液0.2mL、0.05mol/L葡萄糖-6-磷酸溶液1.0mL、0.025mol/L辅酶II溶液1.6mL、大鼠肝S9 1.0mL。将各试剂置冰浴中预冷，然后按体积依次取出各成份加入一支预冷的灭菌试管中，混匀，置冰浴中待用。

1.2试验菌株及其生物学特性鉴定

试验菌株：采用TA97、TA98、TA100和TA102一组标准测试菌株，由江苏省疾病控制中心提供，储存于-80℃。试验菌于37℃水浴振荡培养24h，4℃保存。

增菌培养：将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，37℃振荡(100次/min)培养10h，该菌株培养物应每毫升不少于1～2×109活菌数。

生物学特性鉴定：采用鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验(GB 15193.4-2003)标准判断法进行试验菌株的生物学特性和自发回变菌落数的检测，试验结果表明，TA97、TA98、TA100和TA102一组标准测试菌株均符合表6的生物学特性要求。

表6试验菌株鉴定的判断标准

1.3大鼠肝微粒体酶的诱导和S9的制备

选择健康雄性成年SD大鼠2只，体重200～220g，采用多氯联苯(Aroclor1254)作为诱导剂，多氯联苯溶于玉米油中，浓度为200mg/mL，按500mg/kg b.w.无菌操作一次腹腔注射。动物诱导后每天给予正常的饮食和饮水，诱导后第5日颈椎脱臼处死动物，处死前12h停止饮食，正常饮水。

按GB 15193.4-2003方法制备S9。配制75％酒精4000mL分装于两只有盖大口容器内，将颈椎脱臼处死的动物放入1#容器内用75％酒精(0-4℃)消毒动物皮毛5min，再将动物捞出放入2#容器内继续用75％酒精(0-4℃)消毒动物皮毛5min，在无菌室超净工作台内，剖开腹部，取出肝脏，去除肝脏的结缔组织，用无菌的0.15mol/L氯化钾溶液(0℃)淋洗肝脏5次，按每克肝脏加入无菌的0.15mol/L氯化钾溶液(0℃)3mL。用组织匀浆器(20000r/min,1min)制成肝匀浆，在4℃条件下，以9000g离心10min，取其上清液分装于无菌塑料管中，每管1mL，经无菌检查、蛋白含量测定、生物活性鉴定合格后-80℃保存备用。

1.4样品处理和试验方法

化合物2对大鼠LD₅₀为1000mg/kg。依据受试物的理化性质，试验时先制备化合物2：试验前称取0.1g化合物2白色粉末紫外杀菌2h，试验时将其溶于10mL二甲基亚砜(DMSO)中，递次稀释至所需浓度，现用现配。按GB15193.4-2003鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)方法，检测样品致突变性。

1.5点试验法阳性对照

按每张纸片饱和吸水量为0.01mL计，加S9 TA97、TA98、TA100、TA102菌株均用2-乙酰氨基芴(2-AF)，浓度为2mg/mL，不加S9 TA97、TA98菌株用敌克松浓度为5mg/mL，TA100菌株用4-硝基喹啉-N-氧化物1mg/mL，TA102菌株用甲基磺酸甲酯0.2mL/mL。平板掺入法试验加S9 TA97、TA98、TA100、TA102菌株均用2-乙酰氨基芴(2-AF)，浓度为100μg/mL(10μg/100μL·皿)；不加S9 TA97、TA98用敌克松，浓度为0.5mg/mL，TA100用4-硝基喹啉-N-氧化物，浓度为5μg/mL，TA102用甲基磺酸甲酯，浓度为10μL/mL。

1.6平板掺入法试验

剂量组设计：将1mg/100μL·皿确定平板掺入法试验的最高剂量，下设4个剂量组，另外设阴性(溶剂)对照组及阳性对照组。每个剂量分加S9(+S9)和不加S9(-S9)两个系列，设3个平行平皿。

受试药物溶液配制：每皿加入受试药物溶液体积0.1mL，按设定的试验最高剂量10mg/mL，确定受试药物溶液需配制的最高浓度和需配制的体积。计算配制溶液时需称取受试药物的量。准确称取受试药物0.1g于试剂瓶内，加入适量DMSO溶解，转入10mL容量瓶内，混匀定容至10mL。即得试验最高剂量组所需的受试药物溶液。分取足量供最高剂量组试验用，剩余溶液用DMSO进行递次稀释，可获得其余4个剂量组所需的受试药物溶液。

试验操作：取备用底层培养基平皿192个，分4个菌株重复，每个重复8组，每组6个平皿，在平皿上做好标记。取已融化并在45℃水浴中保温的顶层培养基一管(2mL)，用移液管依次加入受试药物溶液0.1mL，测试菌液0.1mL(+S9组同时加入10％S9混合液0.5mL)，迅速混匀，倒在底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，37℃培养48h，观察结果。如第一次平板掺入法试验结果阴性，需再重复一次试验；如第一次平板掺入法试验结果阳性，需再重复两次试验。

试验结果判断与评价：整理各次试验结果，菌株回变菌落数表述为/皿。如阴性对照组每皿自发回变菌落数在正常范围内，试验组每皿回变菌落数增加1倍以上(即试验组回变菌落数等于或大于阴性对照组回变菌落数的2倍)，并有剂量-反应关系或至少某一测试点有重复的并有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试药物为诱变阳性；当试验组受试药物浓度达到1mg/100μL·皿，每皿回变菌落数与阴性对照组比较无统计学差异，可认为是诱变阴性。阳性结果至少进行三次重复测试，阴性结果至少进行二次重复测试，才能对受试药品作出最终评价判定。受试药物的点试法试验结果要用平板掺入法进行确证。如果受试药物对4种菌株(加S9和不加S9)的平皿掺入试验均得到阴性结果，可认为此受试药物对鼠伤寒沙门氏菌无致突变性。如受试药物对一种或多种菌株(加S9或不加S9)的平皿掺入试验得到阳性结果，即认为此受试药物是鼠伤寒沙门氏菌的致突变物。

2试验结果

两次重复试验结果见表7和表8，4种试验用鼠伤寒沙门氏菌株菌苔生长正常，阳性对照试验各菌株回变菌落平均数均超过其相应阴性对照组回变菌落平均数的二倍以上，证实鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型突变菌株对受试物的检测有效，各菌株反应合格。化合物2每皿剂量在1mg～0.0016mg范围内，有或无代谢活化系统(S9)时，4种鼠伤寒沙门氏菌试验株的每皿平均回变菌落数均在溶剂对照的两倍以内，未见剂量-反应关系，两次试验结果一致，表明化合物2在有、无S9的情况下均无诱变活性，对鼠伤寒沙门氏菌无致突变性。

实施例4.3化合物2的小鼠骨髓细胞微核试验

1材料与方法

1.1材料

实验动物：清洁级健康ICR小鼠60只，体重18～20g，雌、雄各半，购自扬州大学比较医学中心。

试剂：受试药物化合物2，由广州英赛特生物技术有限公司提供，临用前1.0％羧甲基纤维素钠配制成所需浓度混悬液；致突变阳性对照物环磷酰胺，含量99.00％；甲醇、甘油、磷酸二氢钾、姬姆萨(Giemsa)染料均为分析纯；小牛血清，过滤除菌后放入56℃恒温水浴中保温1h进行灭活，于4℃储存备用；Giemsa贮备液自配；1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)自配；Giemsa工作液配制由1份Giemsa贮备液与6份1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)，混合即成，临用时配制。

仪器设备：台式离心机、生物显微镜(带100×油镜头)、恒湿水浴(温控误差±0.5℃)、细胞计数器、解剖器械、载玻片、注射器、灌胃针头等实验室常用仪器设备。

1.2试验步骤

剂量组设计：将60只小鼠按设定的组数随机分为5组，每组12只(雌雄各半、雌雄分笼)进行试验。化合物2对小鼠经口染毒LD5为1000mg/kg，依据化合物2LD50及其理化性质，试验时设500mg/kg体重(高)、250mg/kg体重(中)、125mg/kg体重(低)三个剂量组。另设一个阳性对照组和一个阴性(溶剂)对照组。阳性对照组选用环磷酰胺，剂量为40mg/kg b.w.。

受试物溶液配制：将受试物化合物2用1.0％羧甲基纤维素钠作溶媒梯度稀释，按不同浓度、相同体积给予口服，现用现配。

给药：采用灌胃给药，给药两次，两次给药间隔24h。每次给药先称取小鼠体重，按0.1mL/10g b.w.要求给予小鼠受试物，用注射器吸取受试物混悬液通过灌胃对各小鼠进行给药。阳性对照选用环磷酰胺40mg/kg b.w.(0.1mL/10g b.w.)腹腔注射染毒。阴性对照选用0.5％羧甲基纤维素钠溶液，口服体积为0.1mL/10g b.w.。

标本制备：在第二次给予受试物6h后，采用颈椎脱臼法每组处死雌鼠和雄鼠各5只。取下每只小鼠的两侧股骨，剔去肌肉，用滤纸或纱布擦去表面血污，剪去股骨两端。用配有6号针头的1mL注射器吸取小牛血清约0.2～0.5mL冲洗骨髓腔数次，将冲洗物滴在已对应编号的载玻片上。将玻片上的骨髓腔冲洗物调匀后，推片，每只小鼠2张，迅速干燥。将干燥的涂片置甲醇中固定5～10min，取出晾干。固定好的涂片用吉姆萨应用液染色15～30min，蒸馏水冲洗，晾干，待检。

1.3数据整理与分析

双盲法阅片，并记录各组每只小鼠嗜多染红细胞(PCE)检查数、含微核PCE细胞数、成熟红细胞(RBC)数等，分别计算雌雄小鼠各试验组的嗜多染红细胞(PCE)数、含微核PCE细胞数及成熟红细胞(RBC)数，将计算结果列表。

按下列公式计算雌雄小鼠各试验组的PCE微核率和PCE/RBC比值，同时计算各自的标准差，将结果列表。

实验数据采用SPSS 11.0统计软件处理，分析结果表示，微核发生率按X²检验(α＝0.05)作统计学处理。

2试验结果

实验结果见表9和表10。各组嗜多染红细胞与成熟红细胞比值(PCE/RBC)在正常范围内。化合物2三个剂量组雌、雄小鼠骨髓含微核嗜多染红细胞(PCE)率与阴性(溶剂)对照组比较无显著性差异(P>0.05)。而阳性对照组与试验组、阴性对照组微核率比较(P<0.01)，差异有统计学意义。受试物同一剂量组内雌雄之间微核无明显的性别差异。试验结果表明，化合物2经处理后的小鼠骨髓细胞微核试验结果为阴性，可认为在本试验条件下化合物2不具有遗传毒性。

表9化合物2的小鼠骨髓细胞微核试验结果(雌性小鼠，n＝5，)

表10化合物2的小鼠骨髓细胞微核试验结果(雄性小鼠，n＝5，)

实施例4.4化合物2的小鼠精子畸形试验

1材料与方法

1.1试验材料

实验动物：清洁级健康雄性ICR小鼠60只，雄性，体重18～20g，购自扬州大学比较医学中心。

试剂：受试药物化合物2，由广州英赛特生物技术有限公司提供，临用前以1.0％羧甲基纤维素钠配制成所需浓度混悬液；致突变阳性对照物环磷酰胺，含量99.00％；其他试剂还包括氯化钠、甲醇、伊红，均为分析纯；生理盐水自配；2％伊红水溶液自配。

仪器：生物显微镜(带滤光片及100×物镜)、细胞计数器等。

1.2试验步骤

剂量分组及受试物溶液配制：化合物2对小鼠经口染毒的LD₅₀＝1000mg/kg，依据化合物2的LD₅₀及其理化性质，试验时设500mg/kg体重(高)、250mg/kg体重(中)、125mg/kg体重(低)三个剂量组。将受试物化合物2用1.0％羧甲基纤维素钠作溶媒梯度稀释，按不同浓度、相同体积给予口服，现用现配。另设一个阳性对照组和一个阴性(溶剂)对照组。阳性对照选用环磷酰胺40mg/kg体重。

试验动物分组：60只健康雄性小鼠进行个体称重和标记编号，采用完全随机法，分为5组，每组12只。确保给药后每组存活10只动物供采样、制片。

给药：给药方法按GB15193.7-2003进行，试验组、阴性对照组和阳性对照组均经口给予受试物，1次/d，连续5d。每次给药先称取小鼠体重，按小鼠0.2mL/10g b.w.要求计算各小鼠应给予的受试物体积。

采样与制片：在第一次给药后第35d颈椎脱臼法处死小鼠，进行采样、制片，每个剂量组采样10只小鼠。剪开腹腔，分离并摘取两侧附睾，放入盛有2mL生理盐水的平皿中；以眼科剪将附睾纵向剪2刀，用吸管吸取其中的生理盐水吹打数次，静置3min；用4层擦镜纸过滤除去组织碎片，吸取滤液滴1滴于载玻片上，推片，每只小鼠制片4张；空气中推片自然干燥后，用甲醇固定10min，干燥；用2％伊红染色1h，用水轻轻洗去染液，自然晾干后镜检。

数据整理与分析：阅片，统计各剂量组小鼠的正常精子检查数、畸形精子数及各类畸形精子数。计算各剂量组小鼠的精子畸形率(％)及各类畸形精子百分率(％)，并计算各剂量组小鼠精子畸形率的标准差。计算公式如下：

每个剂量组的小鼠精子畸形率分别与阴性(溶剂)对照组的小鼠精子畸形率进行统计比较。实验数据采用SPSS 11.0统计软件处理，分析结果表示，精子畸形发生率按X²检验(α＝0.05)作统计学处理。

结果判定：首先观察阳性对照组和阴性对照组的试验结果。要求阴性对照组的畸形精子率应在质控范围(一般为0.8％～3.4％)之内，并且阳性对照组的畸形精子率与阴性对照组的畸形率有显著性差异(P<0.01)。当试验组小鼠的精子畸形率为阴性对照组的2倍或2倍以上，或经统计有显著性差异，并且有剂量-反应关系，试验结果也能重复，可判断试验结果为阳性，即受试药品为精子畸形诱变剂。如果试验组的给药剂量已使动物发生死亡，而精子畸形仍未见增加，则可判定试验结果阴性。

2试验结果

化合物2的小鼠精子畸形试验结果见表11。从表中可以看出，经统计学处理，化合物2三个剂量组的精子畸形率与阴性对照组比较无显著性差异(P>0.05)，而阳性对照组与三个给药剂量组、阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，差异显著。试验结果表明，经化合物2处理后的小鼠精子畸形试验结果为阴性，可判断化合物2不具有生殖遗传毒性。

实施例4.5化合物2对大鼠的致畸试验

1材料与方法

1.1实验动物

Wistar大鼠，体重220～250克。购自扬州大学比较医学中心。

1.2药品和试剂

受试药物：化合物2，批号：20150713，由广州英赛特生物技术有限公司提供。

其他试剂：甲醛、冰乙酸、2,4,6-三硝基酚、氢氧化钾、甘油、茜素红、戊巴比妥钠、茜素红贮备液(冰乙酸5.0mL，甘油l0.0mL，l％水合氯醛60.0mL配成混合液，取适量茜素红边加边搅拌，直至饱和为止。置棕色瓶中保存)、茜素红应用液(取茜素红贮备液lmL，加1％氢氧化钾溶液稀释至1000mL，置棕色瓶中。临用时配制)、透明液A(甘油200mL，氢氧化钾10g，加蒸馏水至l000mL混合)、透明液B(甘油与蒸馏水等量混合)、固定液Bouins液(2,4,6-三硝基酚(苦味酸)饱和液75份、甲醛20份、冰乙酸5份混合)。

1.3仪器设备

生物显微镜及体视显微镜，游标卡尺(百分尺)，实验室其它常用设备。

1.4剂量组设计

将64只Wistar孕鼠分为4组，每组16只进行试验。设30mg/kg体重(高)、8mg/kg体重(中)、2mg/kg体重(低)三个剂量组，另设一个阴性(溶剂)对照组。

1.5样品处理及给药

将受试物化合物2以0.5％羧甲基纤维素钠配制成所需浓度混悬液，采用经口给予试验Wistar大鼠，给药体积为1mL/100g体重。

1.7操作步骤

试验操作按GB15193.14-2015《致畸试验》进行。

给药方案：采用经口灌胃给药。从受孕的第6天～第15天，1次/d，连续10d给予受试物。分别在受孕的第0日、第7日、第12日、第16日及第20日对孕鼠进行称重。

临床观察：在试验期间检查记录妊娠大鼠的摄食、饮水及增重情况，观察妊娠大鼠的一般行为表现、中毒及死亡情况。

孕鼠的处死、检查及记录项目：于妊娠第20天称取孕鼠体重，腹腔注射2％戊巴比妥钠溶液0.6～0.8mL/只麻醉后处死孕鼠，剖腹取出卵巢、子宫，检查黄体数、吸收胎数、死胎数、活胎数，活胎鼠雌雄比，称取子宫连胎鼠重、子宫重等。

活胎鼠检查及记录项目：测量活胎鼠的体重、体长，尾长，检查活胎鼠外观畸形。胎鼠体表检查部位包括头部、躯干部和四肢，头部检查项目包括无脑、脑膨出、顶骨裂、脑积水、小头症、颜面裂、小眼症、眼球突出、无耳症、小耳症、耳低位、无颚症、小颚症、下颚裂、口唇裂，躯干部检查项目包括胸骨裂、胸部裂、脊椎裂、腹裂、脊椎侧弯、脊椎后弯、脐疝、尿道下裂、无肛门、短尾、卷尾、无尾，四肢检查项目包括多肢、无肢、短肢、半肢、多趾、无趾、并趾、短趾、缺趾。

胎仔骨检查及记录项目：将每窝一半的活胎制作胎仔骨标本；将胎仔标本放入小平皿中，用透射光源，在体视显徽镜下作整体观察，然后逐步检查骨骼，检查部位及项目包括枕骨(骨化中心缺失)、脊柱骨(数目、形状异常、融合、纵裂、部分裂开、骨化中心缺失、缩窄、脱离)、盆骨(骨化中心缺失、形状异常、融合、裂开、缩窄、脱离)、四肢骨(数目、形状异常)、腕骨(骨化中心缺失)、掌骨(形状异常)、趾骨(形状异常)、肋骨(数目、形状异常、融合、分叉、缺损)和胸骨(数目、融合、骨化中心缺失)。

胎仔内脏检查及记录项目：将每窝的另一半活胎鼠放入固定液中，固定两周后作内脏检查，检查部位包括头部(脊髓)、胸部和腹部，头部检查项目包括嗅球发育不全、侧脑室扩张、第三脑室扩张、无脑症、无眼球症、小眼球症、角膜缺损和单眼球，胸部检查项目包括右位心、房中隔缺损、室间隔缺损、主动脉弓、食道闭锁、气管狭窄、无肺症、多肺症、肺叶融合、隔疝、气管食管篓、内脏异位，腹部检查项目包括肝分叶异常、肾上腺缺失、多囊肾、马蹄肾、膀胱缺失、睾丸缺失、卵巢缺失、卵巢异位、子宫缺失、子宫发育不全、肾积水、肾缺失、输卵管积水。

1.8数据分析

各种率的统计用X2检验，孕鼠增重用方差分析，胎鼠身长、体重、平均活胎数、子宫连胎重量用t检验。

2结果与讨论

2.1受试物对妊娠大鼠的一般行为表现、中毒及死亡情况的影响

在试验过程中受试物各剂量组受孕鼠的采食、饮水等情况没任何异常，亦未出现中毒以及死亡的情况。

2.2受试物对孕鼠体重的影响

受试物对妊娠大鼠正常摄食、饮水，体重增长的影响见表12。经软件统计分析表明，除高剂量组孕鼠净增重少于对照组(P<0.05)外，其他各组间孕鼠增重无明显差异(P>0.05)。

表12化合物2对妊娠大鼠日增重的影响

2.3受试物大鼠生殖机能的影响

受试物对大鼠生殖机能的影响见表13。受试物各剂量组平均活胎数、吸收胎及死胎数与阴性对照组相比，均无显著差异(P>0.05)。

表13化合物2对大鼠生殖机能的影响

组别	孕鼠数	平均黄体数	平均死胎数	平均吸收胎数	平均着床数
						高	16	8.55±1.86	0.00±0.00	0.27±0.47	8.55±1.86
中	16	8.17±1.95	0.17±0.58	0.00±0.00	8.17±1.95
						低	16	8.40±1.96	0.00±0.00	0.10±0.32	8.40±1.96
阴性对照	16	8.58±1.51	0.08±0.29	0.17±0.39	8.58±1.51

2.4受试物对大鼠的胚胎毒性

受试物对大鼠胚胎的影响见表14和表15。受试物各剂量组着床率、吸收胎率、死胎率、活胎率、雌雄比与阴性对照组相比，均无显著差异(P>0.05)；各剂量组的子宫重、胎盘重、活胎体重、身长和尾长与对照组相比，亦无显著差异(P>0.05)。

表14化合物2对大鼠的胚胎毒性(一)

组别	孕鼠数	着床率(％)	吸收胎(％)	死胎率(％)	活胎率(％)	雌雄比
							高	16	100.00	2.13	0.00	97.87	0.97
中	16	100.00	0.00	2.00	98	0.84
							低	16	100.00	1.19	0.00	98.81	0.88
阴性对照	16	100.00	1.94	0.97	97.09	0.86

表15化合物2对大鼠的胚胎毒性(二)

2.5受试物对胎鼠的致畸作用

受试物对胎鼠外观畸形、骨骼发育、内脏发育的影响见表16。各剂量组外观畸形发生率与阴性对照组相比，均无显著差异(P>0.05)。骨骼发育方面，各剂量组胎鼠头顶骨、胸骨、肋骨、脊椎骨检查未见异常。内脏发育方面，胎鼠内脏固定切片检查，受试物各剂量组胎鼠未见异常，各剂量组内脏观察指标与阴性对照组比较，无显著差异。

表16化合物2对大鼠的致畸作用

3结论

以上结果表明，化合物2高剂量组孕鼠净增重少于对照组(P<0.05)外，其他各剂量组的孕鼠增重正常。GB15193.14-2015《致畸试验》中剂量组设计原则，对于能求出LD₅₀的受试物，各剂量组可根据LD₅₀设定各组剂量，且高剂量原则上应使部分孕鼠出现毒性作用，如体重减轻等。化合物2各剂量组平均活胎数、吸收胎数及死胎数与阴性对照比较，均无显著差异(P>0.05)；各剂量组活胎平均体重、身长和尾长与阴性对照组比较，差异均无显著意义(P>0.05)。化合物2各剂量组的外观畸形发生率与阴性对照组相比，均无显著差异(P>0.05)；胎鼠的骨骼检查未发现异常发育，各器官内脏检查亦未见异常或畸形。

综上所述，在本试验条件下，高剂量化合物2对大鼠具有轻微母体毒性，未发现化合物2对大鼠具有胚胎毒性和致畸作用。