阅读说明：本技术 一种小分子化合物ml-sa1的应用 (Application of small molecular compound M L-SA 1 ) 是由 徐国东 刘愈杰 曹志贱 郑从义 于 2019-12-24 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种小分子化合物ML-SA1在制备抗病毒药物中的应用。该发明通过在A549细胞和huh7细胞两种细胞系内,小分子化合物ML-SA1均以浓度依赖的方式抑制细胞内病毒RNA转录水平和E蛋白的表达水平,表明小分子ML-SA1在一定浓度梯度范围内对ZIKV和DENV-2的抑制效应不具有细胞特异性,而且小分子ML-SA1通过作用早期进入阶段发挥抗病毒效应,其抗ZIKV效应不依赖于病毒的滴度且不影响TRPML2蛋白的转录水平；另外,通过CCK-8法检测表明小分子化合物ML-SA1在抗病毒活性浓度梯度内无细胞毒性。(The invention provides an application of a small molecule compound M L-SA 1 in preparation of antiviral drugs, wherein in two cell lines of A549 cells and huh7 cells, the small molecule compound M L-SA 1 inhibits the transcription level of virus RNA and the expression level of E protein in cells in a concentration-dependent manner, so that the inhibition effect of the small molecule M L-SA 1 on ZIKV and DENV-2 in a certain concentration gradient range does not have cell specificity, the small molecule M L-SA 1 plays an antiviral effect in an early entry stage through action, the ZIKV resistant effect does not depend on the titer of viruses and does not influence the transcription level of TRPM L2 protein, and in addition, the detection of a CCK-8 method shows that the small molecule compound M L-SA 1 has no cytotoxicity in an antiviral activity concentration gradient.)

一种小分子化合物ML-SA1的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小分子化合物ML-SA1的应用。

背景技术

寨卡病毒(zika virus,ZIKV)属于黄病毒科黄病毒属，主要通过虫媒传播，也可通过性交和胎盘进行人与人之间传播。自2007年开始，寨卡疫情在大洋洲暴发并迅速蔓延至66国家和地区，除发热、皮疹、关节痛和肌无力等黄病毒所引发的典型症状外，越来越多的研究表明寨卡病毒的感染与新生儿小头症和成人的格林巴利综合征紧密相关。然而，目前尚无有效的疫苗和临床药物用于寨卡病毒的治疗。

随着研究的深入，越来越多特异性靶点的小分子抑制剂逐渐被发现，如针对病毒本身蛋白的E蛋白抑制剂、作用于NS5的RNA聚合酶抑制剂和甲基化转移酶抑制剂、作用于NS2B-NS3复合体的蛋白酶抑制剂等(崔香玲等，2018)。其中，作为复制的关键酶—NS5 RdRp是研究病毒抑制剂最有前景的靶点，如Zmurko J等用ZIKV感染AG129小鼠，发现7-去氮-2’-C-甲基腺苷(7DMA)能有效抑制寨卡的复制(Zmurko J et al.,2016)；Lu G等人发现2’-C-甲基和2’-C-乙炔基取代的5’-三磷酸腺苷能够有效抑制RNA聚合酶的活性(Lu G et al.,2017)，如核苷酸类似物NITD008。尽管RNA聚合酶可以作为小分子抑制剂的首选靶标，但由于此类分子的耐药性和细胞毒性，开发新型靶点的抗病毒小分子仍然任重而道远。

发明内容

本发明的目的是克服现有抗病毒小分子具有耐药性和细胞毒性，不利于抗病毒药物研究的问题。

为此，本发明提供了一种小分子化合物ML-SA1在制备抗病毒药物中的应用。

进一步的，所述病毒为寨卡病毒、登革病毒。

进一步的，所述小分子化合物ML-SA1的抗寨卡病毒活性浓度为50～400μM。

进一步的，所述小分子化合物ML-SA1的抗登革病毒活性浓度为10～400μM。

所述抗病毒药物包括活性成分以及药学上可接受的辅料，其中活性成分包括小分子化合物ML-SA1。

本发明中小分子化合物ML-SA1(CAS:332382-54-4)为TRPML通道特异性激活剂，其化学结构式如下：

本发明的有益效果：

本发明中小分子化合物ML-SA1作为宿主细胞TRPML通道特异性激活剂，因为其作用对象并非病毒，所以理论上病毒对该小分子药物不会产生耐药性；而且在A549细胞和huh7细胞两种细胞系内，小分子化合物ML-SA1以浓度依赖的方式抑制细胞内病毒(寨卡病毒ZIKV和登革病毒DENV-2)RNA转录水平和E蛋白的表达水平，小分子ML-SA1在一定浓度梯度范围内对ZIKV和DENV-2的抑制效应不具有细胞特异性，并且小分子ML-SA1通过作用早期进入阶段发挥抗病毒效应，其抗ZIKV效应不依赖于病毒的滴度且不影响TRPML2蛋白的转录水平；另外，通过CCK-8法检测表明小分子化合物ML-SA1在抗病毒活性浓度梯度内无细胞毒性。

以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明中A549细胞内小分子ML-SA1对病毒感染的影响效果图；

图2是本发明中huh7细胞内小分子ML-SA1对病毒感染的影响效果图；

图3是本发明中小分子ML-SA1对细胞毒性影响效果图；

图4是本发明中小分子ML-SA1对不同Zika病毒感染复数的抗病毒效果图；

图5是本发明中小分子ML-SA1在不同阶段的抗病毒效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

本实施例探究了小分子化合物ML-SA1对病毒感染的影响，选取虫媒病毒中的Zika病毒(PRVABC59)和Dengue病毒(DENV-2的TSV01)作为研究对象，在A549细胞系中，将小分子ML-SA1以0、12.5、25、50、100μM不同终浓度分别与MOI为1的Zika病毒混合；另外将0、6.25、12.5、25、50μM不同终浓度小分子ML-SA1分别与MOI为0.1的Dengue病毒混合孵育，感染24h之后，分别对细胞内的病毒RNA转录水平和E蛋白的表达水平进行检测，检测结果如图1所示。其中，a为作用于Zika病毒的mRNA荧光定量PCR(即qRT-PCR)检测结果，b为作用于Zika病毒的Westernblot检测结果，c为作用于Dengue病毒的mRNA荧光定量PCR检测结果，d为作用于Dengue病毒的Westernblot检测结果。

图1中a和c的qPCR结果显示，小分子ML-SA1在不同浓度对细胞内病毒RNA的抑制具有浓度依赖效应；b和d的Western blot结果显示，不同浓度ML-SA1对细胞内Zika病毒和Dengue病毒的E蛋白的表达具有较好的浓度依赖抑制效应。综上所述，在A549细胞系中，小分子ML-SA1在一定浓度梯度范围内对Zika病毒和Dengue病毒具有较好的抑制效应。

实施例2：

本实施例探究了小分子ML-SA1抗病毒效应是否具有细胞特异性，选取huh7细胞系作为研究材料，同时采用同实施例1相同的病毒(Zika病毒和Dengue病毒)分别和不同浓度的小分子ML-SA1共同孵育，小分子浓度梯度设置和同实施例1中A549细胞系中一样，即Zika病毒(0、12.5、25、50、100μM)和Dengue病毒(0、6.25、12.5、25、50)，感染24h之后，分别对细胞内的病毒RNA转录水平和E蛋白的表达水平进行检测，检测结果如图2所示。其中，a为作用于Zika病毒的mRNA荧光定量PCR(即qRT-PCR)检测结果，b为作用于Zika病毒的Westernblot检测结果，c为作用于Dengue病毒的mRNA荧光定量PCR检测结果，d为作用于Dengue病毒的Westernblot检测结果。

由图2可以看出，本实施例的huh7细胞系跟实施例的A549细胞体系中结果相似，小分子ML-SA1在病毒RNA和蛋白水平都能浓度依赖的抑制Zika病毒和Dengue病毒的复制，这也说明小分子ML-SA1可能通过影响细胞某个生理过程抑制病毒的复制，进而发挥它的广谱抗病毒活性，其抗病毒效应不具有细胞特异性。

实施例3：

本实施例考察了小分子ML-SA1对细胞的毒性影响，通过CCK-8法检测了A549细胞和huh7细胞的活力，其中设置了0、25、50、100、200、400μM的小分子浓度梯度，分别对A549细胞处理24h和48h；同时设置了0、50、100、200、400μM的浓度梯度，分别对huh7细胞处理24h和48h；检测结果如图3所示，a为A549细胞的活力检测结果，b为huh7细胞的活力检测结果。

由图3可以看出，小分子ML-SA1对两种细胞的毒性较低，且抗病毒浓度梯度都保持在一定毒性范围内。

实施例4：

本实施通过用相同浓度梯度的小分子ML-SA1对不同Zika病毒感染复数(MOI)进行实验，并对细胞内的病毒RNA转录水平及TRPML2蛋白的表达水平进行检测，检测结果如图4所示，a为相同浓度梯度的小分子ML-SA1作用于不同MOI的Zika病毒的mRNA荧光定量PCR(即qRT-PCR)检测结果，b为相同浓度梯度的小分子ML-SA1作用于不同MOI的Zika病毒的TRPML2表达量检测结果。

由图4可以看出，小分子ML-SA1对不同Zika病毒感染复数(MOI)都能浓度依赖的抑制ZIKV的复制，同时小分子ML-SA1虽然能够激活TRPML2通道，但是不影响其表达。

实施例5：

本实施例考察了小分子ML-SA1抑制ZIKV和DENV-2感染的作用阶段。

首先，考察小分子ML-SA1对病毒吸附阶段(Attachment)的影响：用50μM的ML-SA1和MOI为1的Zika病毒4℃孵育细胞1h，另外用25μM的ML-SA1和MOI为0.1的Dengue病毒4℃孵育细胞1h，然后用预冷的PBS洗去孵育液，直接提取细胞总RNA(qRT-PCR)进行检测，检测结果如图5中a和b所示。由图5中a和b可以看出，小分子ML-SA1对病毒吸附阶段无影响。

然后，通过设置不同的加药时间点，其加药时间点如图5中c所示，依次为0、2、6、10、14h，分别对Zika病毒和Dengue病毒的一个感染周期(24h)进行效果检测，检测结果如图5中d和e所示；其中，d为作用于Zika病毒的Westernblot阶段检测结果，e为作用于Dengue病毒的Western blot阶段检测结果。由图5中d和e的检测结果可知，小分子ML-SA1均通过作用早期进入阶段发挥抗病毒效应。

上述实施例中涉及的细胞RNA提取及检测过程如下：

1、细胞总RNA的提取

本实验所涉及的RNA提取均采用TRIzol(Takara)法提取，整个过程涉及的枪头、Ep管均是无RNA酶的，具体方法如下：

(1)用800-1000μL无菌PBS洗涤细胞1次，每孔加入1mL的TRIzol裂解液，吹打细胞至完全裂解，转移到无RNAase的1.5mL的Ep管中，对应做好标记；

(2)加入200μL/管的氯仿(三氯甲烷)，振荡混匀，4℃，12000rpm离心15min，吸取400μL上清至新的无RNA酶的离心管中(小心不要吸到有机层)；

(3)加入等体积的异丙醇，充分颠倒混匀，室温静置20min；

(4)4℃，12000rpm离心10min，弃去上清，注意管底部有白色沉淀；

(5)加入700μL/管的80％的乙醇，轻轻上下颠倒使沉淀漂浮起来，4℃，12000rpm离心5min，弃去上清；

(6)将Ep管放入离心机短甩，用10μL枪吸去管中残留的乙醇，并打开静置直至沉淀晾干且变为透明，每管根据RNA的多少加入适量的DEPC水，吹匀；

(7)用Nanodrop测定细胞总RNA的浓度，然后根据反转录试剂盒的要求将一定量的RNA反转录成cDNA。

2、反转录

按照ThermoFisher的反转录试剂盒的说明书进行操作，步骤如下：

(1)先向0.2μL的无RNA酶的PCR管加入1μL的Random primer和1μg的RNA，然后用无RNAase的水补至12μL，混匀；

(2)将(1)中的混合体系放入PCR仪，程序设为65℃孵育5min；

(3)将(2)中孵育后的PCR管放在冰上使其冷却，同时按表1配制第二步反应体系；

表1：

(4)将(3)中配好的第二步反应体系混匀，分别加入(1)中，并按表2反应条件进行反应；

表2：

3、荧光定量PCR(qRT-PCR)

为了检测目的基因的表达水平，按照DBI公司的Bestar SybrGreen qPCRmastermix的说明书进行了荧光定量PCR。

(1)配制表3的反应体系：

表3：

(2)按照说明书及目的基因性质设置PCR反应程序，如表4所示；

表4：

(3)数据用GraphPad 5软件进行数据处理，绘制柱形图。

4、细胞总蛋白的提取及检测

为了检测目的基因的蛋白表达水平，需要提取细胞总蛋白并用Western blot技术检测，具体方法如下：

(1)用PBS洗涤细胞2次，加入一定体积的1％SDS细胞裂解液，冰上吹打细胞，收集细胞到预冷的1.5mL Ep管中；

(2)将收集的蛋白混合液放入沸水中，煮沸20min；

(3)4℃，12000rpm离心15min，转移上清至新的Ep管中；

(4)取5μL上清稀释6倍进行蛋白定量，取80μL左右的的蛋白上清加入1/5体积的蛋白上样缓冲液5×loading，振荡混匀后，煮沸10min，-80℃保存蛋白样；

(5)根据待检测的基因及上样顺序，进行Western blot检测。

5、CCK-8检测细胞活力

(1)将A549或Huh7细胞按照7000-10000个/孔铺96孔板，每孔加200μL培养基，37℃培养过夜；

(2)将小分子ML-SA1(Sigma)用100μL培养基按照0、25、50、100、200、400μM的浓度配好，加到细胞中，每个药浓设置5个平行，同时设置没有细胞的空白组，37℃培养24h或48h；

(3)培养一定时间后，向每孔中加入10μL的CCK-8试剂溶液，37℃培养箱中孵育1-2h，观察颜色变化；

(4)孵育一段时间后，用酶标仪490nm的波长测定光吸收值(OD值)；

(5)以多肽浓度为横坐标，以OD值为纵坐标，用GraphPad绘制柱形图。

以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。