阅读说明：本技术 一种从低值海洋生物下脚料中提取活性肽的方法 (Method for extracting active peptide from low-value marine organism leftovers ) 是由 房文涛 任海涛 张金秋 刘泓材 于 2020-04-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种从低值海洋生物下脚料中提取活性肽的方法,包括以下步骤：(1)将低值海洋生物下脚料清洗后加入水,打浆制备得到原料液；(2)在步骤(1)制得的原料液中接种类干酪乳杆菌,进行有氧发酵,制得发酵液；(3)将步骤(2)制得的发酵液离心分离得到沉淀物和上清液,将沉淀物中加入水,重复操作步骤(2)；(4)重复操作步骤(3),将每次离心得到的上清液混合得终发酵物；(5)将步骤(4)得到的终发酵物通过超滤膜膜分离,透过液蒸发浓缩,冷冻干燥得到活性肽。通过本发明提取方法制得的活性肽,活性肽产率高,不仅具有降尿酸的作用,还能够有效治疗乳腺增生疾病。(The invention discloses a method for extracting active peptide from low-value marine organism leftovers, which comprises the following steps: (1) washing the low-value marine organism leftovers, adding water, and pulping to prepare a raw material liquid; (2) inoculating lactobacillus casei to the raw material liquid prepared in the step (1), and carrying out aerobic fermentation to prepare fermentation liquid; (3) centrifuging the fermentation liquor prepared in the step (2) to obtain a precipitate and a supernatant, adding water into the precipitate, and repeating the step (2); (4) repeating the operation step (3), and mixing the supernatant obtained by each centrifugation to obtain a final fermented product; (5) and (4) separating the final fermentation product obtained in the step (4) by an ultrafiltration membrane, evaporating and concentrating the permeate, and freeze-drying to obtain the active peptide. The active peptide prepared by the extraction method has high yield, not only has the function of reducing uric acid, but also can effectively treat hyperplasia of mammary glands.)

一种从低值海洋生物下脚料中提取活性肽的方法

技术领域

本发明涉及低值海洋生物下脚料回收利用提取活性肽技术领域，具体涉及一种从低值海洋生物下脚料中提取活性肽的方法。

背景技术

在海洋生物加工过程中，鱼类、鱿鱼内脏等海洋生物下脚料一般不容易被利用，直接被废弃掉，一方面造成资源的浪费，另一方面造成环境污染，由于目前海洋生物下脚料的加工方式主要是采用高温蒸煮、机械压榨等方法，使得废弃物中的蛋白质变性，特别是与脂肪等交合在一起，就更加增加了分离的难度，导致海洋生物下脚料利用效果差。

乳腺增生病是乳腺导管和小叶在结构上的逆行性和进行性变化，以乳房疼痛和乳房肿块为主要临床表现，是育龄妇女最常见的乳腺疾病，此疾病严重影响患者的生活质量，目前的治疗方式一般是用激素类、维生素类药物治疗，但疗效尚无确切，副作用大，治疗效果差。目前还没有将低值海洋生物下脚料应用到防治乳腺增生的相关研究，本发明经过研究，通过本发明的方法提取得到的活性肽，对防治乳腺增生具有重要的作用。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种从低值海洋生物下脚料中提取活性肽的方法。按照本发明方法提取活性肽，活性肽产率高，且提取得到的活性肽不仅具有降尿酸的作用，还能够有效治疗乳腺增生疾病；本发明将低值海洋生物下脚料重新利用，避免了下脚料的浪费，开辟了低值海洋生物下脚料利用的新途径。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种从低值海洋生物下脚料中提取活性肽的方法，包括以下步骤：

(1)将低值海洋生物下脚料清洗后加入水，打浆制备得到质量浓度为10％-15％的原料液；

(2)在步骤(1)制得的原料液中接种类干酪乳杆菌，在温度为20-30℃的条件下有氧发酵2-3天，制得发酵液；

(3)将步骤(2)制得的发酵液离心分离得到沉淀物和上清液，将沉淀物中加入水，重复操作步骤(2)；

(4)重复操作步骤(3)，实现循环发酵，将每次离心得到的上清液混合得终发酵物；

(5)将步骤(4)得到的终发酵物通过超滤膜膜分离，膜分离得到透过液，将透过液蒸发浓缩，冷冻干燥得到活性肽。

优选的，所述低值海洋生物下脚料为鱼类、鱿鱼的内脏。

优选的，步骤(2)中，所述类干酪乳杆菌的接种量为10⁵-10⁶CFU/mL。

优选的，所述类干酪乳杆菌为中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，菌株编号为CICC20241和CICC6270，CICC20241和CICC6270的接种比例为1:(2-4)。

优选的，步骤(3)中，沉淀物与水的固液比为1g:(4-5)ml。

优选的，步骤(4)中，重复操作步骤(3)3-4次。

优选的，步骤(5)中，超滤膜的膜通量为5000Da。

优选的，步骤(5)中，膜分离前进行离心除杂，离心力为8000-10000g。

本发明的第二方面，提供利用上述方法提取得到活性肽。

本发明的第三方面，提供上述活性肽在制备治疗乳腺增生药物中的用途。

本发明的第四方面，提供一种用于治疗乳腺增生的药剂，所述药剂以上述活性肽为活性成分。

本发明的有益效果：

按照本发明方法提取活性肽，活性肽产率高，且提取得到的活性肽不仅具有降尿酸的作用，还能够有效治疗乳腺增生疾病；本发明将低值海洋生物下脚料重新利用，避免了下脚料的浪费，开辟了低值海洋生物下脚料利用的新途径；原料来源广，价格低廉，生产成本低，生产工艺简单，适用于各种规模生产。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分介绍的，目前海洋生物下脚料利用效果差，活性肽产率低。基于此，通过本发明的提取方法提取活性肽，活性肽产率高，且提取得到的活性肽不仅具有降尿酸的作用，还能够有效治疗乳腺增生疾病；本发明将低值海洋生物下脚料重新利用，避免了下脚料的浪费，开辟了低值海洋生物下脚料利用的新途径。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：一种从低值海洋生物下脚料中提取活性肽的方法，包括以下步骤：

(1)将鲳鱼内脏清洗后加入水，打浆制备得到质量浓度为15％的原料液；

(2)在步骤(1)制得的原料液中接种类干酪乳杆菌，接种量为10⁵CFU/mL，所述类干酪乳杆菌为中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，菌株编号为CICC20241和CICC6270，CICC20241和CICC6270的接种比例为1:2；在温度为20℃的条件下有氧发酵3天，制得发酵液；

(3)将步骤(2)制得的发酵液离心分离得到沉淀物和上清液，将沉淀物中加入水，重复操作步骤(2)，沉淀物与水固液比为1g:4ml；

(4)重复操作步骤(3)3次，实现循环发酵，将每次离心得到的上清液混合得终发酵物；

(5)将步骤(4)得到的终发酵物进行离心除杂，离心力为8000g，然后通过超滤膜膜分离，超滤膜的膜通量为5000Da，透过液蒸发浓缩，冷冻干燥得到活性肽。

采用双缩脲法测定活性肽含量

1.标准曲线的制作

取十个10ml的容量瓶，用5％的TCA依次配制0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8mg/ml的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液，然后分别取6.0ml标准溶液，加入4.0ml双缩脲试剂，混合均匀，静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于540nm下测定OD值。以活性肽的浓度为横坐标X(mg/ml)，OD值为纵坐标Y，制作标准曲线。

2.活性肽含量的测定

活性肽含量的测定程序：取2.5ml样品液体，加入2.5ml 10％(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，然后在4000r/min下离心15min，将上清液全部转移到50ml容量瓶中，并用5％的TCA定容至刻度，摇匀。然后取6.0ml上述溶液置另一试管中，加入双缩脲试剂4.0ml(样液:双缩脲试剂＝3:2，V/V)，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于540nm下测定OD值，对照标准曲线求得样品溶液中的活性肽浓度，进而可求得样品中活性肽含量。

双缩脲配制方法：先将双缩脲试剂A加入组织样液，振荡均匀(必须营造碱性环境)，再加入双缩脲试剂B，振荡均匀；双缩脲试剂A的成分是氢氧化钠的质量分数为0.1g/mL的水溶液；双缩脲试剂B的成分是硫酸铜的质量分数为0.01g/mL的水溶液。

计算活性肽的产率：

活性肽产率(％)＝(超滤膜透过液中多肽含量-原料液中多肽含量)/总蛋白含量

总蛋白含量通过现有的酚试剂法进行测定，总蛋白含量采用酚试剂法测定属于现有常规技术，在此不再赘述。

计算活性肽产率为89.5％。

实施例2：一种从低值海洋生物下脚料中提取活性肽的方法，包括以下步骤：

(1)将大黄鱼内脏清洗后加入水，打浆制备得到浓度为10％的原料液；

(2)在步骤(1)制得的原料液中接种类干酪乳杆菌，接种量为10⁶CFU/mL，所述类干酪乳杆菌为中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，菌株编号为CICC20241和CICC6270，CICC20241和CICC6270的接种比例为1:4，在温度为30℃的条件下有氧发酵2天，制得发酵液；

(3)将步骤(2)制得的发酵液离心分离得到沉淀物和上清液，将沉淀物中加入水，重复操作步骤(2)，沉淀物与水的固液比为1g:5ml；

(4)重复操作步骤(3)3次，实现循环发酵，将每次离心得到的上清液混合得终发酵物；

(5)将步骤(4)得到的终发酵物进行离心除杂，离心力为10000g，然后通过超滤膜膜分离，超滤膜的膜通量为5000Da，透过液蒸发浓缩，冷冻干燥得到活性肽。活性肽的产率为90％。

实施例3：一种从低值海洋生物下脚料中提取活性肽的方法，包括以下步骤：

(1)将鱿鱼内脏清洗后加入水，打浆制备得到浓度为12％的原料液；

(2)在步骤(1)制得的原料液中接种类干酪乳杆菌，接种量为10⁶CFU/mL，所述类干酪乳杆菌为中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，菌株编号为CICC20241和CICC6270，CICC20241和CICC6270的接种比例为1:3，在温度为25℃的条件下有氧发酵2天，制得发酵液；

(3)将步骤(2)制得的发酵液离心分离得到沉淀物和上清液，将沉淀物中加入水，重复操作步骤(2)，沉淀物与水的固液比为1g:4ml；

(4)重复操作步骤(3)4次，实现循环发酵，将每次离心得到的上清液混合得终发酵物；

(5)将步骤(4)得到的终发酵物进行离心除杂，离心力为9000g，然后通过超滤膜膜分离，超滤膜的膜通量为5000Da，透过液蒸发浓缩，冷冻干燥得到活性肽。活性肽的产率为91.6％。

对比例1

一种从低值海洋生物下脚料中提取活性肽的方法，包括以下步骤：

(1)将鱿鱼内脏清洗后加入水，打浆制备得到浓度为12％的原料液；

(2)在步骤(1)制得的原料液中接种球形乳酸菌，接种量为10⁶CFU/mL，在温度为25℃的条件下有氧发酵2天，制得发酵液；

(3)将步骤(2)制得的发酵液离心分离得到沉淀物和上清液，将沉淀物中加入水，重复操作步骤(2)，沉淀物与水的固液比为1g:4ml；

(4)重复操作步骤(3)4次，实现循环发酵，将每次离心得到的上清液混合得终发酵物；

(5)将步骤(4)得到的终发酵物进行离心除杂，离心力为9000g，然后通过超滤膜膜分离，超滤膜的膜通量为5000Da，透过液蒸发浓缩，冷冻干燥得到活性肽。活性肽的产率为71.6％。

对比例1与实施例3相比，发酵所用菌种不同。

对比例2

一种从低值海洋生物下脚料中提取活性肽的方法，包括以下步骤：

(1)将鱿鱼内脏清洗后加入水，打浆制备得到浓度为12％的原料液；

(2)在步骤(1)制得的原料液中接种类干酪乳杆菌，接种量为10⁶CFU/mL，所述类干酪乳杆菌为中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，菌株编号为CICC20241和CICC6270，CICC20241和CICC6270的接种比例为1:3，在温度为25℃的条件下有氧发酵5天，制得发酵液；

(3)将步骤(2)制得的发酵液离心分离得到上清液；

(4)将步骤(3)得到的上清液进行离心除杂，离心力为9000g，然后通过超滤膜膜分离，超滤膜的膜通量为5000Da，透过液蒸发浓缩，冷冻干燥得到活性肽。活性肽的产率为79.6％。

对比例2与实施例3相比，发酵条件不同且未采用循环发酵。

将实施例1-3提取得到的活性肽进行动物试验，验证其治疗乳腺增生的效果。

动物试验：

Wistar大鼠(山东省实验动物中心提供)，体重在220-240g，验前适应性预饲养1周；将大鼠随机分为5组，每组大鼠数量为10只，5组大鼠分为空白组、模型对照组、实施例1组、实施例2组和实施例3组。除空白组，其他组大鼠分别皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0.5mg/kg，每日一次，连续25天，空白组皮下注射等体积生理盐水，第26日开始改为肌注黄体酮4mg/kg，连续5天，空白组皮下注射等体积生理盐水。30天后建模成功。

建模成功后，空白组、模型对照组分别灌服生理盐水2ml/只，实施例1组灌服实施例1制备的活性肽2g/kg，每天1次，连续20天；实施例2组灌服实施例2制备的活性肽2g/kg，每天1次，连续20天；实施例3组灌服实施例3制备的活性肽2g/kg，每天1次，连续20天。

末次给药后用游标卡尺测量各组各大鼠第二对乳头直径、高度，测量结果如表1所示。

表1：

组别	乳头直径(mm)	乳头高度(mm)
			空白组	1.05±0.28	1.08±0.22
模型对照组	1.33±0.43	1.36±0.40
			实施例1组	1.22±0.29	1.24±0.31
实施例2组	1.20±0.28	1.23±0.33
			实施例3组	1.15±0.29	1.19±0.31

病理检测：取下大鼠第2对完整的乳腺，10％福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色后光镜观察乳腺病理组织。将乳腺组织根据病理增生状况分为四级，并计分。

无增生；仅见小叶稀疏分布，每小叶内腺泡数5-10个腺泡，导管内无分泌，腺泡间有结缔组织，计0分；

轻度增生：小叶稍增，每个低倍视野可见5-10个小叶，小叶中的腺泡数也增至10个左右，腺泡间有少量结缔组织，有的导管扩张，计1分；

中度增生：低倍镜下可见10多个小叶，广泛分布，每个小叶有近20个腺泡，腺体呈“背靠背”状，导管扩张或有分泌，计2分；

重度增生：小叶较多，低倍视野下约占1/2-3/4，肌肉、皮下均有小叶分布，小叶、腺泡广泛增生，导管及小导管均有较多分泌物，计3分；

测定结果如下表2所示。

表2：

由上表1可知，实施例1组、实施例2组和实施例3组的乳头高度明显降低，乳头直径明显缩小，由上表2可知，实施例1组、实施例2组和实施例3组镜下观乳腺增生程度明显降低，表明本发明提取的活性肽对乳腺增生病有抑制作用。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。