阅读说明：本技术 一种适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法 (Hi-C high-throughput sequencing and database building method suitable for marine algae ) 是由 冯欢 于 2020-04-09 设计创作，主要内容包括：本发明提供的适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法包括：1)海洋藻类样品甲醛交联；2)液氮研磨和裂解液并行裂解交联物料,释放并收集细胞染色质；3)percoll纯化细胞染色质；4)纯化后的染色质依次经SDS灭活内源酶、MboI核酸内切酶酶切打断获得酶切物料；5)酶切物料依次经粘性末端补平、分子内连接获得分子内连接物料；6)解交联分子内连接物料并纯化,打断纯化后的DNA成利于测序的片段大小从而获得DNA测序文库。该方法设计合适的细胞壁去除方法、细胞核纯化方法,使分析阶段背景噪音干扰显著减少,同时也解决了海洋藻类细胞壁厚难释放细胞质、海洋藻类样品建库效果差的技术问题,实现了海洋藻类的Hi-C高通量测序建库,扩大了Hi-C技术的适用范围。(The Hi-C high-throughput sequencing and database building method suitable for marine algae provided by the invention comprises the following steps of: 1) formaldehyde crosslinking of marine algae samples; 2) grinding with liquid nitrogen and cracking the crosslinked material with cracking liquid, and releasing and collecting cell chromatin; 3) percoll purified cellular chromatin; 4) the purified chromatin is subjected to SDS (sodium dodecyl sulfate) inactivation endogenous enzyme and MboI endonuclease digestion interruption in sequence to obtain a digestion material; 5) the enzyme digestion material is orderly subjected to viscous terminal filling and intramolecular connection to obtain an intramolecular connection material; 6) and (3) connecting materials in the uncrosslinked molecules, purifying, and breaking the purified DNA into fragments with sizes favorable for sequencing so as to obtain the DNA sequencing library. The method designs a proper cell wall removing method and a proper cell nucleus purifying method, so that the background noise interference in the analysis stage is obviously reduced, the technical problems that the wall thickness of marine algae cells is difficult to release cytoplasm and the marine algae sample library building effect is poor are solved, the Hi-C high-throughput sequencing library building of the marine algae is realized, and the application range of the Hi-C technology is expanded.)

一种适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法。

背景技术

染色体构象捕获(Chromosome Conformation Capture，3C)技术是一种研究染色体和蛋白互作和染色体构象的技术，可以提供遥远的基因位点之间的关联性的详细信息，此关联性可以从甲醛固定的细胞核中捕获，并且可以从染色体的三维折叠方式被推断。近年来，在第二代测序技术的迅速发展下，由3C技术衍生出来的Hi-C则是以整个细胞核为研究对象，研究整个基因组范围内基因位点之间的关联性。在Hi-C技术中，以整个细胞系为研究对象，利用高通量测序技术，结合生物信息学方法，研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系；通过对染色质内全部DNA相互作用模式进行捕获，获得高分辨率的染色质三维结构信息。Hi-C技术应用十分广泛，贯穿当今生命科学研究的前沿及热点领域。现有的Hi-C技术对构建3C文库的过程进行了稍许修改。具体的，在连接前，使用生物素标记的核苷酸填充酶切产生的粘性末端。平末端连接后，提取DNA并使用超声波对DNA进行随机打断，最后捕获生物素标记了的DNA片段以确保用以后续分析的数据更多的来自真实的互作。将通过第二代测序得到的DNA序列对比对到参考基因组后，如果一对序列对应于不同的n段酶切片段，那么就认为这两个片段之间有n次相互作用，从而能够构建一个全基因组中所有酶切片段之间连接频率的矩阵。

常规的植物Hi-C高通量测序建库以植物叶片组织作为研究对象，其染色质环境相对海洋藻类较单一，更容易获得比较好的结果，但是限制了其使用范围，距离研究普遍揭示生物学功能的目标还很遥远。如海洋藻类不同于叶片组织，其复杂的细胞壁结构不能用单纯裂解细胞的方式释放细胞核。同时，试验发现，采用现有技术处理海洋藻类样本时，细胞核无法释放完全，同时内源多糖、多酚、矿物质影响后续酶切反应效果，从而影响文库数据的有效性。因此有必要开发一种适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明通过大量实验对比分析，提出了一种适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法，该方法通过设计合适的细胞壁去除方法、细胞核纯化方法，解决了海洋藻类细胞壁厚难释放细胞质、海洋藻类样品建库效果差的技术问题，实现了海洋藻类的Hi-C高通量测序建库，扩大了Hi-C技术的适用范围。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法，包括如下步骤：

1)对海洋藻类样品进行甲醛交联；

2)液氮研磨和裂解液并行裂解交联物料，释放并收集细胞染色质；

3)percoll纯化细胞染色质；

4)纯化后的染色质依次经SDS灭活内源酶、MboI核酸内切酶酶切打断获得酶切物料；

5)酶切物料依次经粘性末端补平、分子内连接获得分子内连接物料；

6)解交联分子内连接物料并纯化，打断纯化后的DNA成利于测序的片段大小从而获得DNA测序文库。

进一步地，所述甲醛交联步骤包括：将海洋藻类样品与预冷的交联体系混合后置于冰上真空孵育30-40min进行甲醛交联，孵育结束后加入甘氨酸终止交联。

进一步地，所述percoll纯化步骤为：

1)取2mL 2.5M蔗糖、5mL percoll溶液和1mL NIB重悬的细胞核悬液于离心管中；所述percoll溶液由NIB裂解液稀释，质量浓度为30％；

2)3000g离心30min，取percoll层3.5-6.5mL溶液；

3)用NIB裂解液稀释步骤2)的溶液3-5倍后，2500g离心5min，弃上清。

进一步地，所述灭活内源酶的步骤包括：

1)重悬percoll纯化后的沉淀于100μL的1.2×NEBuffer 2.1，每管添加1.5μL20wt％的SDS溶解染色质，吹打混匀，重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫；

2)依次65℃ 900rpm孵育10min、37℃ 900rpm孵育30min，并立即放置冰上，瞬时离心以移除管盖液体。

更进一步地，灭活内源酶未反应的SDS采用Triton X-100中和，SDS中和的具体方法为：向步骤2)中获得的灭活内源酶体系中添加400μL的1×NEBuffer 2.1和70μL的20wt％TritonX-100，重悬细胞碎片，37℃950rpm震荡15min。

进一步地，所述MboI核酸内切酶的浓度为5000units/mL，所述酶切反应条件为：900rpm，37℃孵育4h。

进一步地，所述步骤5)中末端补平的反应体系包括以下用量的各组分：酶切物料500μL、NE Buffer 2.1(10×)10μL、10mM dATP 2.0μL、10mM dGTP 2.0μL、10mM dTTP 2.0μL、5mM biotin-14-dCTP 4.0μL、灭菌水65μL、5U/μL Klenowpolymerase 15μL。

进一步地，所述步骤5)中分子内连接反应体系包括以下用量的各组分：10％TritonX-1001mL、10×T4 ligationbuffer 1mL、BSA(10mg/mL)100μL、H₂O 7.85mL、5U/μLT4DNAligase 50μL。

进一步地，所述步骤6)中纯化反应体系包括以下用量的各组分：解交联物料1μg、10x NEBuffer2.110μL、10mM dATP 1μL、3U/μLT4 DNAPolymerase 1.67μL、水85.33μL；所述纯化反应条件为：12℃反应4h，2μL 0.5M EDTA终止反应。

进一步地，所述方法还包括捕获目的片段与文库扩增。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明提出的一种适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法，该方法针对海洋藻类细胞的特殊结构，设计合适的细胞壁去除方法、细胞核纯化方法，使分析阶段背景噪音干扰显著减少，同时也解决了海洋藻类细胞壁厚难释放细胞质、海洋藻类样品建库效果差的技术问题，实现了海洋藻类的Hi-C高通量测序建库，扩大了Hi-C技术的适用范围。本发明的建库方法操作流程简便，可以复制到其他具备分子生物学基础的其他实验室。

(2)本发明的建库方法增加了percoll纯化细胞核步骤，较传统Hi-C方法，显著提升了细胞核的纯度，减少了多糖、多酚及矿物质对于Hi-C建库过程中酶活的影响，此方法可以显著改善杂质对实验结果及分析过程造成的影响。

(3)本发明的建库方法在细胞壁裂解步骤中，通过梯度条件摸索，得到了细胞壁裂解效果好、基因组完整性相对较好的破壁条件。

(4)本发明的建库方法在内源酶灭活和SDS中和步骤上，较传统Hi-C方法，显著缩短了反应时间和提高了灭活效果；尤其针对杂质含量多的海洋藻类样品，此方法可以显著降低杂质多对实验结果及分析过程造成的影响；内源酶灭活体系上采用小体系灭活、大体系中和的原则，提高了样品的灭活效果；

(5)在工具酶的选择上，选用适用性较广的MboI，整个反应体系全部可以使用NEBBuffer 2.1，省去了传统Hi-C方法频繁更换缓冲液体系的步骤，大大简化了操作步骤，MboI是四碱基酶，较传统方法的六碱基酶，提高了酶切的分辨率。

(6)本发明构建的Hi-C文库测序数据不仅仅可以用于基因表达调控的研究，还可以用于辅助基因组组装。

附图说明

图1为本发明的适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法流程图。

图2为实施例1鉴定紫菜基因组完整性、酶切效果的琼脂糖凝胶电泳图谱。

图3为实施例1构建的紫菜文库大小分布结果示意图。

图4为对比例使用传统Hi-C方法鉴定紫菜基因组完整性、酶切效果的琼脂糖凝胶电泳图谱。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：

本实施例以紫菜为研究对象，对新鲜叶片进行甲醛交联、裂解细胞核、percoll纯化细胞核、释放染色质，再经消化染色质、生物素标记、分子内连接、超声打断，最后进行文库构建。本发明的适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法如图1所示。

1、甲醛交联

利用甲醛变性蛋白的能力，将海洋藻类样本加入一定浓度的甲醛交联固定蛋白，使得染色体的互作形态被固定下来；然后甘氨酸中和甲醛，终止交联。

具体操作方法如下：

1)取0.5g紫菜叶状体，剪成约0.5cm大小的碎片装入50mL离心管，并于离心管中加入预冷的35mLNIB裂解液(反应前加入35μL巯基乙醇和35μL 100mM PMSF)和2mL约37％的甲醛溶液(终浓度2wt％)，冰上抽真空40min。

2)加入7.5mL 2.0M甘氨酸并在真空下处理5min终止交联。

3)去除溶液并用灭菌超纯水清洗2-3次，灭菌滤纸完全擦干叶片上的水；

4)交联好的组织在-80℃冻存，可干冰运输。

2、裂解、细胞核纯化及酶切

液氮研磨交联物料10min至样本呈沙粒状后，用裂解液并行裂解研磨后物料，使裂解细胞释放细胞染色质并收集细胞核；细胞核进行percoll化，纯化后的细胞染色质依次经SDS灭活内源酶、经MboI核酸内切酶酶切打断获得酶切后物料。

1)准备研钵，纯水洗净，使用锡箔纸包裹，倒入酒精，烧5min，室温放凉，研钵中加入液氮预冷，将保存的交联组织倒入盛有液氮的研钵中，迅速磨碎样本(样品不要磨太碎，太碎容易降解，影响后续实验)。

2)液氮研磨的样本装入-80℃预冷的空50mL离心管中，留存于-80℃冰箱或置于干冰中运输。

3)把磨碎的紫菜样本加入50mL预冷的NIB裂解液(反应前加入50μL巯基乙醇和1片蛋白酶抑制剂)，置于冰上，摇床上混匀15min。

4)将1层预冷的神奇滤布置于预冷的细胞筛上，过滤样本，滤液置于离心管中。

5)4℃ 3000g离心15min收集裂解物；弃上清，重悬沉淀于500μL的1.2×NEBuffer2.1；4℃ 2500g离心5min，弃上清。

6)15mL离心管中加入2mL 2.5M蔗糖，再加入5mL NIB裂解液稀释的30wt％percoll溶液，最后加入1mL NIB重悬的细胞核悬液。

7)3000g离心30min，取percoll层3.5-6.5mL溶液；

8)用NIB裂解液将上步得到的溶液稀释3-5倍后，2500g离心5min，弃上清。

9)重悬沉淀于100μL的1.2×NEBuffer 2.1，每管溶解染色质添加1.5μL20wt％的SDS，吹打混匀，重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫。

10)依次65℃ 900rpm孵育10min、37℃ 900rpm孵育30min，并立即放置冰上，瞬时离心以移除管盖液体。

11)中和SDS：添加400μL的1×NEBuffer 2.1、70μL的20wt％Triton X-100每管至终浓度3wt％，重悬细胞碎片并避免形成气泡，37℃950rpm震荡15min。

12)每管加入150U限制性内切酶(MboI，5000units/mL)，900rpm 37℃4h(终体积530μL)。

3、末端补平

1)瞬时离心去除管盖液体；

2)每管加入以下试剂，终体系600μL；生物素补平体系如表1所示：

表1

3)加入补平体系于每个Hi-C反应(终体积700μL)，混匀后，37℃孵育2h。

4.分子内连接

1)DNA分子内连接反应，分子连接体系如表2所示：

表2

2)每管加入10mL以上混合液于冰上放置的15mL离心管。

3)转移每个Hi-C反应体系至上述15mL离心管，轻柔颠倒混匀。

4)16℃孵育连接反应4h，每小时颠倒混匀。

5、解交联

1)每管加入20μL 20mg/mL蛋白酶K 65℃过夜。

2)将反应混合液冷却到室温，转移每个反应至一个50mL离心管，一倍氯仿分离回收上清，加入3/4体积异丙醇室温沉淀10min，两次75vol％乙醇清洗(弹起沉淀)，吹干，回收产物溶解在50μL EB，通过添加2μL 1mg/mL RNAse在37℃温育30min以降解所有的RNA。Qubit测定浓度，大约20-100ng/μL为正常浓度范围。(store at-20℃)；

3)通过琼脂糖凝胶电泳图谱鉴定基因组完整性、酶切效果、连接效果。琼脂糖凝胶电泳图谱如图2所示。图2表明：本实施例得到的DNA为正常的完整基因组DNA条带明显无拖尾；酶切效果明显，DNA片段整个下移；连接效果明显，DNA条带上移；说明酶切连接均达到预期效果，可以进行下步实验。

6.末端去生物素

1)取3μg解交联样品1×Ampure XPbeads纯化后Qubit测定浓度。

2)取1μg样品用于末端去生物素，去生物素体系如表3所示。

表3

4)12℃反应4h，2μL 0.5M EDTA终止反应。

7、DNA打断

1)使用130μL超声体系在Covaris上超声片段至400bp左右，超声选择400bp程序90s进行1次。

2)1×Ampure XP beads回收DNA，溶解于52μL Tris，Qubit测定浓度大约10ng/μL左右为正常浓度范围。

8、Illumina试剂盒建库

1)Illumina建库试剂盒(NEBNext Ultra DNALibrary Prep Kit for Illumina)补平末端并+A及+Adaptor；

2)使用Illumina建库试剂盒的Ampure Beads纯化回收步骤，回收+Adaptor后的DNA。

9、生物素捕获

生物素捕获使用试剂盒(MyOne^TM Streptavidin C1，ThermoFisher)，操作过程按照试剂盒说明书执行。

10、Illumina试剂盒扩增嵌合片段

1)Illumina试剂盒建库(100μL，PCR至6cycles，分别取3微升摸索循环数6、8、10、12cycles)，选取能扩增出足量产物的最低循环数。

2)1.5％agarose凝胶回收400-600bp条带。

3)回收产物对文库大小分布进行检测，检测结果如图3所示。图3表明，文库大小集中在400-600bp之间，与凝胶回收预期范围一致。文库大小合适、分布均匀，可以进行高通量测序。

11、对质控得到的clean data，使用ICE3软件对数据进行迭代比对，并进行噪音reads过滤。

表4本专利Hi-C方法对紫菜进行实验数据分析结果说明

对比例：

本实施例以紫菜为研究对象，使用传统Hi-C方法(CN201811086366.X)进行甲醛交联、裂解细胞释放染色质，再经消化染色质、生物素标记、分子内连接、超声打断，最后进行文库构建，具体实验过程参考专利CN201811086366.X。通过琼脂糖凝胶电泳图谱鉴定基因组完整性、酶切效果、连接效果，琼脂糖凝胶电泳图谱如图4所示，图4表明：紫菜叶状体的完整基因组DNA条带明显无拖尾；酶切效果明显，DNA片段整个下移；连接效果明显，DNA条带上移；说明酶切连接均达到预期效果，可以进行下步实验。

对质控得到的clean data，使用ICE3软件对数据进行迭代比对，并进行噪音reads过滤：

表5传统Hi-C方法对紫菜进行实验数据分析结果说明

注：为SE(Single End)数据，其它均为PE(Paired End)数据。Hi-C测序数据中主要reads类型包括，valid pair，single side，selfcircles，dangling ends及unmapped等类型。其中：valid pair是指符合Hi-C实验预期，由补平并携带生物素标记的酶切位点将基因组上不同位点DNA连接在一起形成的嵌合体DNA片段；single side是指，仅有一端序列可以唯一匹配到基因组上的DNA片段；selfcircles是指同一位点DNA环化连接形成的DNA，它主要由单一酶切片段两端相连接，经超声波打断，捕获并测序产生；dangling ends是指双端均在同一位点的DNA片段，它源自未经过连接反应，最终却被捕获测序产生的数据；unmapped是指双端均无法唯一匹配到基因组上的DNA片段。在Hi-C分析中，仅validpair可以反映基因组上位点与位点间的互作信息。因此，非重复的valid pair所占的比例是评估Hi-C文库质量的重要指标。

结果分析：

基于表4和表5的数据分别计算实施例与对比例测序的酶切率、dangling ends比例、extra dangling ends比例，计算结果如表6。

表6实施例与对比例结果对比情况

项目名称	酶切率	dangling ends率	extra dangling ends率	有效数据率
					实施例	50.4％	37.41％	14.46％	43.3％
对比例	6.8％	71.26％	24.60％	3.5％

表6的数据显示实施例的酶切率显著高于对比例，实施例的dangling ends率、extra dangling ends率显著低于对比例，该结果表明本发明要求保护的建库方法用于海洋藻类的HI-C建库时，裂解得到的细胞核更干净，限制性内切酶工作效率更高，建库时获得的无效信息更少，从而使分析阶段背景噪音干扰显著减少。从有效数据率来看，本发明的方法能够成功用于海洋藻类的HI-C高通量测序建库。

因此，本发明提出的一种适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法，该方法通过设计合适的细胞壁去除方法、细胞核纯化方法，解决了海洋藻类细胞壁厚难释放细胞质、海洋藻类样品建库效果差的技术问题，实现了海洋藻类的Hi-C高通量测序建库，扩大了Hi-C技术的适用范围。本发明的方法构建的Hi-C文库测序数据不仅仅可以用于基因表达调控的研究，还可以用于辅助基因组组装。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。