阅读说明：本技术 一种低质量dna二代测序文库构建方法 (Method for constructing low-quality DNA next-generation sequencing library ) 是由 杨静 杨俊波 林春艳 曾春霞 于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种低质量DNA二代测序文库构建方法,该方法先提取低质量样本中的DNA,然后利用高度降解样本中植物性DNA的检测引物对提取的低质量DNA样本进行多重PCR扩增,确定DNA中是否有植物性DNA；对含有植物性DNA的低质量DNA样本进行建库样品质量检测,检测后根据结果进行样品分类处理,最后采用处理后样品进行低质量DNA的二代测序文库构建,本发明方法操作简便、在保证文库质量的同时减少了试剂的用量,降低了实验成本,大大提高了低质量DNA的二代测序成功率。(The invention discloses a method for constructing a low-quality DNA next-generation sequencing library, which comprises the steps of extracting DNA in a low-quality sample, and performing multiple PCR amplification on the extracted low-quality DNA sample by using a detection primer for highly degrading plant DNA in the sample to determine whether the plant DNA exists in the DNA; the method is simple and convenient to operate, reduces the using amount of reagents while ensuring the quality of the library, reduces the experiment cost, and greatly improves the success rate of second-generation sequencing of low-quality DNA.)

一种低质量DNA二代测序文库构建方法

技术领域

本发明属于分子生物学和基因组学实验技术领域，主要涉及一种利用低质量植物样品（蜡叶标本、高度降解植物组织）中的DNA进行二代测序建库的方法。

背景技术

二代测序技术，又称下一代测序技术（Next-Generation Sequencing），可一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此又称为大规模并行测序；目前主流的测序平台主要包括利用焦磷酸测序的Roche/454FLX、边合成边测序的Illuminasequencingsystems(HiSeq系列、Genome Analyzer IIx、MiSeq) 和连接酶测序法的lifetechnologies Sequencing systems(Applied Biosystems SOLID及Ion Torren)。二代测序技术的出现使得可对一个物种的基因组和转录组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序（Deep Sequencing）。

较之一代测序技术，二代测序的成本大幅度降低，加之其超高的测序能力使得二代测序技术能够为更多的科研和临床应用服务；即便如此，所有二代测序平台都涉及到自成体系的文库制备过程，而文库制备对DNA的质量有一定要求，通常要求在琼脂糖凝胶电泳中要有可见的明显主带，无降解（或轻微降解），DNA浓度不小于15ng/μL；同时，建库的DNA起始量也有较高要求，通常需要1-0.5μg。这些制约条件影响了二代测序技术在更多研究领域内的发展和应用。在实际的植物研究工作中，往往需要对一些难以获取或者已经无法获取植物材料的物种开展研究，这就只能从馆藏蜡叶标本或者采集时间久远、存储方式不当的植物材料入手；又或者鉴定诸如经炮制的中草药、环境、土壤中的植物样本，甚至是残存的树皮木屑等。这些材料往往因为各种原因造成其提取出来的DNA高度降解、产量极低，不符合二代测序的实验要求，商业公司无法完成测序，科研用户自身也无法利用这类植物材料进行研究。

为了能够利用仅能从上述材料中提取出的这些低浓度、低质量的植物DNA进行科学研究，就需要提高现有二代测序建库技术，探索出一种适用于低质量DNA的文库构建方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种低质量DNA二代测序文库构建方法，该方法针对高度降解的低质量植物DNA提供了一种有效的二代建库方法；该方法操作简便、在保证文库质量的同时减少了试剂的用量，降低了实验成本，大大提高了低质量DNA的二代测序成功率。

本发明低质量DNA的二代测序文库构建方法如下：

（1）利用高度降解样本中植物性DNA的检测引物对提取的低质量DNA样本进行多重PCR扩增，确定DNA中是否有植物性DNA，以此判定低质量DNA样本的污染程度和作为是否进行下一步建库实验的依据；当扩增的3条目的片段出现一条的，即确认该样本中含有植物性DNA，并将该提取的低质量DNA样本用于下一步建库实验；

所述高度降解样本中植物性DNA的检测引物来源于申请号201810111142.3“高度降解样本中植物性DNA的检测引物”中，序列如下：

100碱基引物对，其序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

70碱基引物对，其序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

50碱基引物对，其序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；

（2）针对低质量的DNA样本，为了提高前期质控的精确度，更好地指导后续建库实验，对含有植物性DNA的低质量DNA样本进行建库样品质量检测，即采用E-Gel预制琼脂糖凝胶电泳系统对低质量DNA样本进行电泳检测，判断DNA降解程度和片段大小的（这类样品DNA一般都小于500bp），同时使用Qubit3.0核酸蛋白荧光定量仪结合Qubit® dsDNA HS（高敏感度）分析试剂盒，对低质量DNA样本进行精确定量；

（3）经步骤（2）电泳检测样本显示无主带，但可见DNA弥散带，且样本浓度大于0.04ng/μL的低质量DNA样本，将样本稀释至0.04ng/μL浓度后，取稀释液进行建库；经步骤（2）电泳检测样本无主带的，有微弱DNA弥散带或者无弥散带，且样本浓度过低，Qubit3.0核酸蛋白荧光定量仪无法定量的低质量DNA样本，直接使用原液进行建库；

（4）取25μL低质量DNA样本的稀释液或原液进行末端补平及加A尾反应，反应体系为30μL体系；

反应体系为DNA 样本25μL、UltraⅡEnd Prep Enzyme Mix 1.5μL、UltraⅡEndReaction Buffer 3.5μL；反应条件为20℃，30min；65℃，30min；4℃，保存；

（5）取步骤（4）反应产物进行接头连接反应，反应体系为46.7μL体系，使用的接头为NEBNext Adaptor #E6609；

反应体系为步骤（3）产物30μL、Ultra Ⅱ Ligation Master Mix 15μL、LigationEnhancer 0.5μL、0.6μmol/L NEBNext Adaptor 1.2μL；反应条件为20℃，15min；程序执行中关闭PCR仪热盖；反应结束后立即在上述连接产物中加入1.5μL的USER^TM Enzyme，混匀后置于37℃，15min，程序执行中PCR仪热盖温度大于等于50℃；

（6）在步骤（5）反应产物中添加0.9～1×AMPure XP Beads磁珠进行纯化，纯化完成，用ddH₂O将纯化后的DNA洗脱下来；

（7）对步骤（6）纯化产物进行PCR扩增富集，反应体系为步骤（6）纯化产物20μL、Idex/Universal Primer Mix 5μL、UltraⅡQ5 Master Mix 12.5μL；

反应条件：98℃预变性，30s；98℃变性，10s；65℃退火/延伸，75s；进行16个循环；65℃最后延伸，5min；4℃，保存；使用0.9～1×AMPure XP Beads磁珠对PCR产物进行纯化，纯化后的上清液即为建好的文库；

（8）PCR纯化产物采用Agilent 2100 BioAnalyzer检测纯化产物的长度分布范围，Qubit3.0核酸蛋白荧光定量仪结合Qubit® dsDNA HS分析试剂盒，对文库进行精确定量。

所述E-Gel预制琼脂糖凝胶电泳系统中琼脂糖凝胶的质量体积浓度为2%。

本发明的优点和技术效果：

本发明方法能够利用常规方法无法使用的高度降解、浓度极低（DNA样本浓度≤0.04ng/μL）的低质量植物DNA，在较短工作时间内使用尽可能少的试剂的条件下，完成二代测序文库的构建，且成功率较高。

本发明方法操作简便、在保证文库质量的同时减少了试剂的用量，降低了实验成本，大大提高了低质量DNA的二代测序成功率。

附图说明

图1为多重PCR扩增产物检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明；以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，该领域的技术人员可以根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整；本发明提供的二代测序文库构建方法中所用试剂均可由市场购买；除非另行定义，文中所使用的所有专业和科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。

实施例1：本低质量DNA二代测序文库构建方法如下：

1、选取48份馆藏蜡叶标本（见表1），使用天根新型植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，具体方法参照说明书，以提取的DNA为模板，采用如下3对引物进行多重PCR反应：

100碱基引物对，其序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

70碱基引物对，其序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

50碱基引物对，其序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；

多重PCR的反应体系为：DNA 模板 2μL、2×Taq PCR MasterMix(TIANGEN公司) 11μL、混合引物(5μm) 1μL、dd H₂O 8μL；

多重PCR的程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸35s，进行35个循环；72℃延伸5min；4℃，保存；

表1为48份标本材料清单

；

2、多重PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测

取PCR扩增产物5μL、Marker 3μL，在4.5%琼脂糖凝胶 (含4S Green plus 核酸染色剂)中电泳；电压为140V，电流为60mA，电泳时间80min；检测结果见图1，从图中可以看出11份标本的PCR产物显示无带，扩增失败，证明这些标本材料中的植物性来源DNA已高度降解，无法作为下一步研究的材料；另外37份样品均扩增成功，至少可扩增出1条带（50碱基对左右的片段），证明这些标本材料虽然年代久远，采集和保存方式不详，但从中提取出的DNA含有植物性DNA，可作为下一步植物研究的材料。

3、对含有植物性DNA的低质量DNA样本进行建库样品质量检测

采用E-Gel预制琼脂糖凝胶电泳系统（含2%琼脂糖凝胶）对低质量DNA样本进行电泳检测，判断DNA降解程度和片段大小（这类样品DNA一般都小于500bp），同时使用Qubit3.0核酸蛋白荧光定量仪结合Qubit® dsDNA HS（高敏感度）分析试剂盒（ThermoFisher公司），对低质量DNA样本进行精确定量（使用方法参照说明书）。

2% E-Gel预制琼脂糖凝胶电泳（使用方法参照使用说明书）检测显示无主带，但可见DNA弥散带，且样本浓度大于0.04ng/μL的低质量DNA样本，将样本稀释至0.04ng/μL浓度后，取稀释液进行建库；电泳检测样本无主带的，有微弱DNA弥散带或者无弥散带，且样本浓度过低，Qubit3.0核酸蛋白荧光定量仪无法定量的低质量DNA样本，直接使用原液进行建库。

4、低质量DNA的二代测序文库构建

本实验方法中主要用到以下试剂：AMPure XP Beads(Beckman公司)、Ultra ⅡEndPrep Enzyme Mix（NEB公司）、Ultra ⅡEnd Reaction Buffer（NEB公司）、NEBNext Adaptor#E6609（NEB公司）、Ultra Ⅱ Ligation Master Mix（NEB公司）、Ligation Enhancer（NEB公司）、Idex/Universal Primer Mix （NEB公司）、Ultra ⅡQ5 Master Mix（NEB公司）、 HighSensitivity DNA Kit(Agilent公司)、Qubit® dsDNA HS分析试剂盒（ThermoFisher公司）、ddH₂O；

实验仪器和设备：移液器、E-Gel凝胶系统、磁力架、PCR仪、核酸蛋白荧光定量仪Qubit3.0；

（1）对DNA样本进行末端补平及加A尾反应，反应体系为30μL体系

取25μL低质量DNA样本的稀释液或原液于PCR管中，依次加入UltraⅡEnd Prep EnzymeMix 1.5μL、UltraⅡEnd Reaction Buffer 3.5μL，用移液器上下吹吸10次左右，使所有成分充分混匀；瞬时离心，使反应液集中；置于PCR仪上，反应条件为20℃，30min；65℃，30min；4℃，保存；

（2）取步骤（1）所得产物进行接头连接反应，该步骤反应体系为46.7μl体系；同时，为满足多样本混合测序，作为优选，该步骤使用的接头为NEBNext Adaptor #E6609；

在步骤（1）所得产物30μL中依次加入Ultra Ⅱ Ligation Master Mix 15μL、LigationEnhancer 0.5μL、0.6μmol/L NEBNext Adaptor #E6609 1.2μL，用移液器上下吹吸10次左右，使所有成分充分混匀；瞬时离心，使反应液集中；置于PCR仪上，反应条件为20℃，15min；程序执行中关闭PCR仪热盖；反应结束后立即在上述连接产物中加入1.5μL的USER^TMEnzyme，充分混匀后置于37℃，15min，程序执行中PCR仪热盖温度大于等于50℃；

（3）磁珠纯化步骤（2）所得产物（无须片段筛选），作为优选，该步骤使用0.9-1×AMPureXP Beads磁珠进行纯化，DNA洗脱体积为20μl；

将步骤（2）所得的48.2μL产物转移到一新的1.5mL离心管中，将平衡到室温的AMPureXP Beads磁珠在涡旋仪上充分混匀，取44μL加入上述1.5mL离心管中，用移液器上下吹吸10次左右，使所有成分充分混匀；瞬时离心，使反应液集中，室温平衡5min；将离心管放置在磁力架上约5min左右，使磁珠和上清液分离，等液体澄清时，轻柔地吸去上清液，并同时保证不干扰到吸附有DNA的磁珠；离心管保持在磁力架上不动，在离心管中加入现配的体积浓度80%的乙醇溶液，室温保持30s，然后轻柔地吸去上清液；重复上述乙醇洗涤步骤一次；保持离心管开盖置于在磁力架5min左右，使磁珠自然风干（管中无液滴，磁珠表面润泽即可，切忌过分干燥，影响DNA回收率）；从磁力架上取下离心管，将22μL ddH₂O轻轻滴于磁珠上，用移液器上下吹吸混匀，室温平衡2min；瞬时离心后，将离心管置于磁力架上，静置5min左右直到液体澄清，吸取20μL上清液于一新的PCR管中。

（4）对步骤3纯化产物进行PCR扩增富集，作为优选该步骤反应体系为37.5μL体系

在步骤（3）的纯化产物20μL中依次加入Idex/Universal Primer Mix 5μL、Ultra ⅡQ5Master Mix 12.5μL；用移液器上下吹吸10次左右，使所有成分充分混匀。瞬时离心，使反应液集中；置于PCR仪上，反应条件：98℃预变性，30s；98℃变性，10s；65℃退火/延伸，75s；进行16个循环；65℃最后延伸，5min；4℃，保存；

（5）PCR产物纯化

将步骤（4）所得37.5μL产物转移到一新的1.5mL离心管中；将平衡到室温的AMPure XPBeads磁珠在涡旋仪上充分混匀；取34μL磁珠与步骤（4）产物混合，后续操作与步骤（3）相同；最后吸取20μL上清液于一新的PCR管中，该上清液即为建好的文库；

（6）文库质控

PCR产物纯化后，选用Agilent 2100 BioAnalyzer检测产物的长度分布范围（使用方法参照使用说明书），Qubit3.0核酸蛋白荧光定量仪结合Qubit® dsDNA HS（高敏感度）分析试剂盒，对文库进行精确定量（使用方法参照使用说明书）；定量结果显示，文库核酸量均大于5nmol/L，可用于二代测序；

通过上机测序，结果显示以该方法构建的二代测序文库可以用于基因组浅层测序中叶绿体基因组的数据获取和组装分析，具体结果见下表：

从上表可以看出：使用本发明方法对低质量植物DNA构建的二代测序文库成功率较高，下机数据在叶绿体基因组分析时基本都能完成拼接，构建成环；一部分样品拼接成环后出现少量gap(空隙)，且gap较小，可以通过其它实验方法很容易地补上gap，不影响最终结果。本发明的二代测序建库方法能够解决低质植物DNA样品的建库问题，使馆藏腊叶标本、经炮制的中草药、环境及土壤中的植物样本，甚至是残存的树皮木屑中提取出的低浓度、高度降解的DNA的研究利用成为可能。

序列表

<110> 中国科学院昆明植物研究所

<120> 一种低质量DNA二代测序文库构建方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

agcagtccaa ggggttggtt 20

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

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<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

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