细胞分析或与细胞分析有关的改进
阅读说明：本技术 细胞分析或与细胞分析有关的改进 (Improvements in or relating to cellular analysis ) 是由 温爱博 凯瑟琳·阿曼达·富勒 许若霖 于 2018-10-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种用于细胞分析的方法,该方法包括：制备血液样品,该血液样品包含具有表面、细胞质或核抗原(标志物)的有核细胞；采用抗体染色细胞标志物；固定和透化细胞；采用FISH探针与细胞染色体杂交；对细胞进行成像流式细胞术处理；分析通过进行成像流式细胞术处理获得的数据；以及根据数据分析诊断、预测或监测医疗状况。(The present invention provides a method for cell analysis, the method comprising: preparing a blood sample comprising nucleated cells having surface, cytoplasmic, or nuclear antigens (markers); staining the cell markers with antibodies; immobilizing and permeabilizing the cells; hybridizing a FISH probe with a cell chromosome; subjecting the cells to imaging flow cytometry; analyzing data obtained by performing an imaging flow cytometry process; and diagnosing, predicting, or monitoring a medical condition based on the data analysis.)
技术领域
本发明涉及细胞分析。在特定的非限制性方面，本发明涉及用于组织样品和/或细胞分析的诊断和预后方法。例如，本发明提供了用于医学状况或治疗状况的诊断、预后或监测的分析方法。
背景技术
背景技术的以下讨论仅旨在促进对本发明的理解。讨论并不是承认在申请的优先权日之前，所提到的任何材料是或曾经是公知常识的一部分。
细胞遗传学分析是许多疾病如恶性肿瘤、染色体数目异常的综合征(如21三体性疾病(唐氏综合征))和移植受体嵌合症评估中不可或缺的组成部分。
诊断实验室当前使用玻片(细胞涂片或组织切片)上的细胞的荧光原位杂交(FISH)分析来鉴定特定的基因组缺陷。FISH基于荧光标记的单链DNA探针与目标基因组中的互补序列退火，以检测DNA序列和亚微观遗传变化。探针设计用于靶向染色体基因座(区域)，以识别间期和中期全细胞的重排、缺失和获得。由于荧光显微镜用于检查与染色体结合的荧光探针的位置，因此限制了所分析细胞的数量(每个病例通常少于500个)。因此，该方法的灵敏度低。此外，尽管用于观察细胞染色体异常的FISH方法对于恶性疾病(特别是血液恶性肿瘤)和非恶性疾病(例如遗传性疾病的产前诊断)的诊断评估非常重要，但是它是劳动密集型的，并且没有明确识别目标细胞-仅显示细胞核，并且这些细胞核可以源自任何细胞类型。
当与目标细胞的表型鉴定(免疫表型)结合，即细胞抗原加FISH的整合免疫荧光标记结合时，基于玻片的FISH的特异性可以增加。这种组合被称为“immunoFISH”或“荧光免疫表型和相间细胞遗传学，作为研究肿瘤的工具(FICTION)”。ImmunoFISH/FICTION是基于可在细胞离心机制备物、细胞涂片或组织切片上进行的表型鉴定细胞遗传异常的有用工具，以检测通过表型鉴定的细胞(例如CD138阳性浆细胞)的特定遗传异常(图1)。这也使得能够通过表型(克隆异质性)区分存在于所有赘生性细胞中的原发性遗传异常(例如MYC易位)和存在于细胞亚群中的继发性变化。尽管免疫表型和遗传分析的结合(即FICTION)提高了FISH检测染色体异常的特异性，该方法仍然需要荧光显微镜来手动检查与染色体结合的荧光探针的位置，从而限制了所分析细胞的数量(按照FISH)。因此，该方法的灵敏度仍然很低。
相反，通过常规流式细胞术进行的免疫表型分析是一种自动的细胞表型分析方法，其分析了数千个细胞，提供了定量的群体数据并允许检测异常的细胞群体。但是，直到最近，这种方法还不能用于检测FISH探针的结合(图1)。
最近，已经对“悬浮的”细胞，即“FISH-IS”、“悬浮-FISH”或“S-FISH”细胞进行了FISH并通过流式细胞仪进行了分析。FISH-IS保留完整的细胞，并解决了在玻片上进行FISH的空气干燥过程时，原来的3维(或球形)相间核变平的问题。测试原理相同，但是杂交步骤与玻片的规程不同，因为细胞和DNA必须保持完整，同时杂交条件的严格性确保探针标记具有特异性。可以通过流式细胞仪分析相间FISH-IS标记的全细胞，与基于显微镜的方法相比，能够自动对数个细胞进行遗传分析。但是，它可以执行的FISH分析类型受到限制。
与传统的FISH方法相比，流式细胞术成像已被证明可以进一步提高灵敏度。自动化细胞成像流式细胞仪以每秒1,000-2,000个细胞的速度分析悬浮液中的细胞。该技术最多可以获取每个细胞的十二个图像，包括十个荧光图像，其质量可与x600显微镜相比。这种多参数方法将标准流式细胞仪的灵敏度和统计能力与数字显微镜相结合。利用这种技术，可以使用扩展的景深成像技术高精度地定位细胞内信号，包括结合的FISH探针荧光信号或“斑点”。因此，它具有使用荧光探针检测特定遗传异常的潜力。Minderman等人的最新报告清楚地表明，可以通过成像流式细胞术分析使用FISH-IS杂交的细胞(Minderman H,Humphrey K,Arcadi JK,et al.Image Cytometry-Based Detection of Aneuploidy byFluorescence In Situ Hybridization in Suspension.Cytometry Part A 2012；81A:776–784)。该分析方法已成功用于使用着丝粒探针确定白血病细胞中的染色体拷贝数。与常规流式细胞术相比，这种高通量自动化成像分析方法在评估FISH-IS方面具有一个重要的重大优势：这是成像方面，并且能够可视化和计数杂交“斑点”。它可以定量分析细胞群并以高通量对大量细胞进行“斑点”计数，从而提供对染色体异常的更准确分析。尽管具有优势，但FISH-IS分析每个样品的能力有限，在灵敏度和变异性方面仍有很大的改进空间。
因此，有利的是提供一种新的方法、装置和/或系统，该方法、装置和/或系统可以减少、限制、克服或改善与现有技术相关的一些问题或缺点，或者提供有效的替代方案。
发明内容
发明人已经试图通过开发用于医学或治疗状况的诊断、预后和监测的改进的细胞分析“immuno-flowFISH”技术来解决现有技术中的一个或多个缺陷。
该技术使用成像流式细胞仪结合了悬浮液中的细胞的免疫表型分析和FISH分析。成像流式细胞仪将高分辨率数字图像与从标准流式细胞仪获得的定量信息结合在一个平台上。广义地，根据本发明的用于诊断、预后或监测医学或治疗状况的细胞分析方法包括以下步骤：
a.使用流式细胞仪免疫表型根据其抗原谱选择待分析的细胞群；以及
b.成像流式细胞仪结果可在通过其精确表型鉴定的这些特定细胞中对FISH探针信号进行计数。
结果是，仅根据目标细胞(例如白血病细胞)的抗原表达模式或表型评估FISH染色体信号。
因此，根据第一形式，本发明提供了一种用于诊断或预测或监测细胞群体中的状况的方法，该方法包括以下步骤：
a.选择要分析的细胞群并通过使用流式细胞仪对细胞群进行免疫表型分析来分析细胞群的抗原谱，以检测是否存在一种或多种与要测量或评估的疾病相关的生物学标记或参数；以及
b.使细胞群至少接受FISH探针，该探针可使细胞可视化并计数，从而允许通过其精确表型鉴定特定细胞，并允许鉴定通过表型鉴定的细胞中的基因组畸变。
根据该方法的第一步，通过使用流式细胞术对细胞群进行免疫表型分析，可以同时评估多个荧光参数。该步骤还可以观察到细胞群的细胞形态(细胞特征)，可以对细胞进行免疫表型鉴定，还可以鉴定抗原在细胞膜上，在细胞质中还是在细胞核中的位置。可以通过可视化标记的定位或通过使用区分细胞膜、细胞质或核抗原的不同标记或测量参数来获得以后的结果。
优选地，FISH探针在由它们的精确表型(即，在步骤(a)中选择的)识别的这些特定细胞中产生荧光“斑点”或另一信号，以进行计数(或测量)。
Immuno-flowFISH分析是复杂的，需要仔细的平衡以保持细胞完整性，用于抗体结合的表位以及与特定染色体基因座的探针杂交。尽管在技术上具有挑战性，但与以前的基于载玻片的FISH相比，immuno-flowFISH提供的数据要多得多，并且比以前描述的免疫S-FISH(仅限于每个样品<80％的细胞)具有更高的灵敏度和更少的变异性。Immuno-flowFISH能够对通过细胞表型鉴定的大量细胞进行自动FISH分析，即使它们仅构成样品中的一部分细胞。
由于成像流式细胞仪具有多光谱成像能力，因此它们提供了“immuno-flowFISH”的能力，即悬浮细胞的immunoFISH。Immuno-flowFISH能够提供集成的自动化高通量单平台测试，以鉴定通过表型鉴定的细胞中的基因组畸变，从而提高灵敏度。
将悬浮液中的细胞FISH(FISH-IS)与细胞表型结合起来可以实现基因座特异性探针(即针对特定基因序列的探针；该序列可以是正常基因或异常基因，具体取决于所研究的材料)，用于在单个高通量自动化测试中通过表型鉴定门控(“选择”)细胞的基因型。由于可以分析的细胞数量众多，因此具有为基于玻片的immunoFISH增加功能的能力，由于能够基于悬浮的表型鉴定目标细胞群，因此具有流式FISH-IS的功能。
发明人的技术试图减轻归因于当前的手动FISH、FISH-IS和FICTION方法或通过常规流式细胞术进行的免疫表型化的缺点。特别地，发明人认为immuno-flowFISH与当前的FISH和FICTION技术实现了以下至少一种区别：
a.可在单个高通量成像流式细胞仪平台上对全部完整肿瘤细胞的形态、表型和基因型进行整体评估；
b.比目前的手动FISH方法(1-3％细胞)具有更高的灵敏度(大于1：10,000个细胞)；
c.比目前的手动FICTION方法要快(特别是，在评估完整细胞时，它更快且整体上更准确)。FICTION可能会产生错误的结果，因为免疫表型和FISH是在3-4μm的组织切片上进行的。这可能会产生错误的结果，因为测试不会评估整个细胞，而是评估一部分；
d.使用类似于常规流式细胞术方法的免疫表型样品制备方法；
e.与目前使用FISH或FICTION方法的数百个细胞相比，提供了一种分析数千个细胞的方法；
f.与目前的FISH相比，在检测目标细胞群(如血液系统恶性肿瘤中的肿瘤细胞)的染色体异常方面具有更高的灵敏度；或者
g.在成像流式细胞仪上使用基于抗原的门控策略，因此可以可靠地分析具有少量目标细胞的样品。可以检测到低水平的目标细胞，因此可以用于残留疾病评估(监测)。这将有助于以较低的疾病负担检测疾病，从而允许尽早引入大剂量疗法，包括移植，并有望改善患者的预后。
在第二方面，本发明提供了一种用于细胞分析的方法，包括：
a.制备包含表达在细胞表面膜上、细胞质或细胞核中存在的细胞抗原(也称为细胞标志物)的有核细胞的单细胞悬浮液；
b.采用抗体染色细胞抗原；
c.固定细胞；
d.对细胞进行细胞遗传学技术处理(如本文所述)，以检测细胞核中的染色体区域/基因座/特征；以及
e.对细胞进行成像流式细胞术处理。
优选地，细胞遗传学技术包括将细胞与适合于检测细胞核中的染色体区域/基因座/特征的探针，优选与FISH探针杂交。这可以通过使细胞DNA变性，阻断非特异性探针DNA结合以及将FISH探针与受检细胞中的核材料杂交来实现。优选地，杂交后将细胞在冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中淬灭，然后离心。
优选地，当使用阻断时，阻断非特异性探针DNA与FISH探针杂交的结合。这可以通过将样品暴露于PBS/BSA然后洗涤细胞来实现。然后可以除去所得的上清液，并将细胞重悬在杂交缓冲液中以进行FISH探针分析。然后以本发明的这种形式将细胞加热以使DNA变性和/或促进探针退火。该步骤优选在自动热循环仪中进行。然后可以将细胞在严格溶液中洗涤至少一次并重悬。然后对细胞进行核DNA染色。
在本发明的形式中，该方法进一步包括以下步骤：分析从成像流式细胞术获得的数据。
在诸如IDEAS(美国西雅图的AMEAS Merck)等成像流式细胞术软件中分析数据，以确定样品信息，例如细胞群的免疫表型、细胞群中的细胞数量、探针的存在/位置以及每个细胞中存在的探针斑点的数量(即细胞遗传学)。
或者，可以在没有明场技术的情况下分析单个染色的细胞，并且可以计算补偿矩阵。
优选地，对细胞进行成像流式细胞术包括使用激发激光器，并捕获发射物。激发激光器可以包括100mW 405nm和/或50mW 488nm，和/或150mW561nm，和/或150mW 592nm和/或120mW 642nm激光器。在这方面，在对细胞进行成像流式细胞术时，在成像流式细胞仪(例如，美国西雅图AMNIS的AMNIS ImageStreamX markII)上分析细胞并记录数据，例如明场(形态)图像和荧光图像以及荧光强度。
进行成像细胞计数优选地涉及以至少40x物镜捕获图像。可以在30倍至70倍的物镜范围内捕获图像。优选地，以大约60倍的物镜捕获图像。
进行成像细胞计数还可包括在散点图中识别细胞。优选地，样品中记录了约10,000-20,000个细胞。
在本发明的另一个或替代形式中，该方法包括以下步骤：基于数据分析，诊断、预后或监测医学或治疗状况。
根据本发明的一种形式，在成像流式细胞术步骤中，使用图像分析软件进行immuno-flowFISH数据分析。数据分析可以包括通过测量图像的清晰度或质量来选择聚焦图像。优选地，在散点图中准备数据。散点图采用纵横比与明场面积的一种优选形式。
分析还可以包括通过排除具有高荧光强度的细胞来鉴定荧光强度直方图中的有核非分裂细胞。这样的数据分析将根据应用和所使用的细胞标志物，理想地包括基于诸如正常和赘生性细胞(例如淋巴细胞、白血病细胞)之类的标志物的荧光强度的目标门控细胞群。
优选地，数据分析包括使用掩蔽区域内两个图像线性相关程度的度量来确定FISH探针信号与核染色剂的共定位。数据分析可包括使用峰、斑点或强度掩模对每个细胞的FISH探针斑点进行计数。这可能涉及基于每个像素是连接到特定点还是背景来检查每个像素的连通性。优选地，通过单参数直方图验证斑点数，比较每个斑点数群的FISH信号的测量荧光强度，以确认1个斑点、2个斑点和3个或更多斑点数，或者在发生染色体易位时重叠斑点。可以进行细胞群之间斑点数的比较，以确定是否存在与FISH探针相关的细胞遗传学。例如，可以计算异常细胞核中的“斑点”数目与正常细胞相比的比率，例如与正常淋巴细胞相比，白细胞核中有斑点，从而得到斑点比率。
在第三方面，本发明提供了一种用于细胞分析的诊断方法，包括以下步骤：
a.从细胞样品制备单细胞悬浮液；
b.采用抗体将悬浮液染色以检测一种或多种细胞标志物；
c.固定细胞；
d.使悬浮液中的细胞DNA变性；
e.使至少一个FISH探针与步骤(d)的细胞DNA杂交；
f.对细胞进行成像流式细胞术处理，以获取明场图像、荧光图像以及免疫表型标记和FISH探针强度测量的数据；以及
g.分析数据以诊断、预测或监测医疗状况的存在或不存在。
优选地，对对照和样品细胞执行以上方法，从而可以识别清楚的分界。
在第四方面，本发明提供了一种诊断试剂盒，其包含本发明方法的一个或多个部件，以及关于如何在该方法中使用该试剂盒的说明。
特别地，本发明扩展到试剂盒，该试剂盒包括(a)至少一种适合标准流式细胞术的标志物检测系统，(b)一种或多种本发明的FISH探针，(a)和(b)的每一个都放在一个或多个容器中，并与说明手册或信息手册合并，该手册提供关于在本发明的方法中使用(a)和(b)的指令和/或信息。
此外，试剂盒还可在一个或多个容器中包含：一种或多种适用于本发明方法的缓冲液。
优选地，试剂盒中存在的标志物检测系统是适合于对细胞样品进行免疫表型鉴定的抗体。
可以使用该技术的用途包括但不限于：非恶性疾病识别，例如产前应用，包括对具有染色体缺陷或与母体血液有差异的疾病进行产前诊断，鉴定母体循环中的胎儿细胞(例如有核红细胞、滋养细胞或淋巴细胞)，鉴定胎儿来源的有核红细胞，免疫表型鉴定以HbF(细胞内的胎儿血红蛋白)、CD71(细胞表面的转铁蛋白受体)、HLA-G的抗体鉴定有核红细胞，以鉴定滋养层细胞，针对目标疾病的探针鉴定，例如CEP21用于唐氏综合症的21三体症；鉴定母体血液中的男性胎儿淋巴细胞(Y染色体FISH探针)：免疫表型分析：包括通过CD45、HbF、HLA-G、CD71进行鉴定；嵌合体的鉴定，包括移植后性别不匹配的移植和免疫分型以通过CD45鉴定淋巴细胞。
或者，它可用于鉴定恶性疾病，例如血液系统恶性肿瘤(血液癌症)或其他类型的癌症；通过表型鉴定肿瘤细胞中的染色体畸变。基于WHO利用表型和染色体分类的疾病分类，数值异常(“非整倍性”)：单体型、三体型、四体型、超二倍体、次二倍体(例如：急性白血病，慢性白血病，浆细胞骨髓瘤，骨髓增生异常综合症，非霍奇金淋巴瘤)；结构异常：缺失、易位、重复、扩增(例如：急性白血病、慢性白血病、浆细胞骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、慢性嗜酸性粒细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤)。检测血液中其他类型癌症中的染色体异常(无论是数值异常还是结构异常)，也称为“液体活检”(即血液样本以识别循环中的肿瘤细胞)或从组织样本中获得的癌细胞。特别地，该方法可以用于来自任何身体部位(例如，淋巴结、乳房、皮肤)的分类的组织样品以检测染色体异常。
或者，它可以用于非人类基因型评估，例如细胞内病毒检测：检测整合到通过表型鉴定的人类细胞中的病毒基因组DNA序列。Epstein-Barr病毒(EBV)感染B细胞，是一种已知的癌病毒，可调节细胞复制和凋亡(例如劫持MYC和BCL2L11基因)。根据WHO的分类，非霍奇金淋巴瘤(例如弥漫性大B细胞淋巴瘤或伯基特淋巴瘤)等血液恶性肿瘤与EBV感染密切相关。可使用用于检测EBV DNA或相关转录本的商业探针(例如肽核酸探针)以及合成与各种类型的荧光团偶联的特异性寡核苷酸探针以进行EBV基因组特异性检测的能力。
它可用于告知治疗决策：基于表型确定的特定疾病(例如慢性淋巴细胞性白血病和del(17p)；del(5q)的骨髓增生异常综合征)中染色体缺陷的存在而选择治疗方案。
它可用于告知预后：以染色体异常分类的疾病，例如慢性淋巴细胞性白血病、浆细胞骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、急性髓细胞性白血病和急性淋巴细胞性白血病、EBV阳性淋巴瘤。
它可以用于通过基于由其表型鉴定的特定细胞中的染色体缺陷来告知包括最小残留疾病负担在内的残留疾病。或者，在收获用于自体移植之前，它可以用于基于新的染色体缺陷或疾病根除来告知新克隆的获得。
它可以用于告知非造血细胞的诊断和分类，例如原发肿瘤，组织的鉴别诊断，从组织中提取的细胞。数字异常：非整倍性(例如，黑色素瘤与非典型痣的鉴别诊断)和结构异常：缺失、融合。
它可以用于基于通过表型鉴定的特定疾病中染色体缺陷的存在来告知治疗选择。这包括在怀孕期间检测母体血液中异常的胎儿细胞。
它可以用于通过表面或细胞内非肿瘤性抗原特征来鉴定包括循环肿瘤细胞在内的赘生性细胞。例如：乳房；黑色素瘤和骨髓转移细胞。
它也可以用于通过探针识别转基因载体序列的CAR-T细胞持久性。特别地，它可以用于检测工程引入的核酸序列及其在细胞中的表达。
在以下几个非限制性实施例的描述中，将更全面地描述本发明的其他特征。仅出于举例说明本发明的目的而包括该描述。不应将其理解为对如上所述的本发明的广泛概括、公开或描述的限制。
附图说明
将参考附图进行描述，其中：
图1示出了目前用于细胞分析的诊断方法，包括手动FISH(带有核蓝复染的VysisCLL探针试剂盒)、通过自动流式细胞术进行免疫分型(无法执行FISH)以及将混合免疫分型与FISH结合在玻片上的细胞上的手动FICTION方法。
图2示出了根据本发明合适的实施例，使用细胞分析方法评估代表性CLL血液样品的12号染色体拷贝数。(A)基于免疫表型标记的组合的表达来控制细胞群。(B)每个CD3+T细胞中“斑点数”或Vysis CEP12FISH探针杂交斑点的数量。(C)每个CD19+B细胞中“斑点数”或Vysis CEP12FISH探针杂交斑点的数量。门控细胞群也可以在图库中查看。(D)细胞639是CD19-BV480阴性、CD3-AF647阳性、CD5-BB515阳性和CEP12二体性T细胞。细胞326是CD19-BV480阳性、CD3-AF647阴性、CD5-BB515阳性和CEP12二体性B细胞。细胞164是CD19-BV480阳性、CD3-AF647阴性、CD5-BB515阳性和CEP12三体性B CLL细胞。重叠图像是免疫表型、CEP12探针和核SYTOX AADvanced图像的合并。
图3示出了展示根据本发明合适的实施例使用细胞分析方法的代表性急性淋巴细胞白血病(ALL)骨髓样品和Reh(ALL)细胞系的免疫表型的实例的图像库。(A)ALL细胞5634和8370为CD22-BB700阳性、TdT-BV421阳性，CD19-AF647阳性和CD33-BV605阴性。(B)Reh细胞390和403为CD22-BB700阳性、CD34-BV421阴性、CD45-V500c阳性、CD10-BV605阳性、CD19-AF647阳性和FVDeFluor780阴性，表明它们是免疫表型评估时的活细胞。缩写：AFAlexaFluor、BB艳蓝荧光、BF明场、BV艳紫荧光、FVD可固定的活性染料。
图4示出了展示根据本发明合适的实施方案的使用细胞分析方法的代表性浆细胞骨髓瘤骨髓样品的免疫表型的实例的图像库。顶部和中间细胞是CD138-V500c阳性、CD45-BV480阴性、CD19-AF647阴性的血浆骨髓瘤细胞，而底部细胞是CD138-V500c阴性、CD45-BV480阳性、CD19-AF647阳性的正常浆细胞。缩写：AF Alexa Fluor、FVD可固定的活性染料。
图5示出了使用根据本发明合适的实施例的细胞分析方法对急性淋巴细胞白血病(ALL)骨髓样品的评估。(A)细胞1570具有3个拷贝的4号染色体或4号三染色体细胞(绿色斑点)。三染色体细胞通过与SYTOX AADvanced核染色剂的共定位分析得到证实。叠加图像是CEP4探针和核SYTOXAADvanced图像的合并。(B)细胞1853是具有ETV6-RUNX1易位的ALL细胞，从ETV6-SG/RUNX1-SO叠加图像中的重叠点可以看出，一个拷贝的ETV6(绿色斑点)和一个拷贝的RUNX1(橙色斑点)并置。缩写：BF和BF1明场、CEP4 4号染色体探针、SGSpectrumGreen、SO SpectrumOrange、SYTOXAADv SYTOX AADvanced。
图6示出了根据本发明合适的实施例的固定和透化溶液对免疫表型性能的影响。将健康的外周血单核细胞(PBMC)用与BB515偶联的CD3克隆SK7染色，以测试不同的固定和通透性方法。在细胞表面染色(染色后)、固定和透化(固定/渗透后)、1M盐酸变性(酸后)和荧光原位杂交(FISH；杂交后)后，取出两种方案的等分试样，以便在AMNIS ISX MKII上进行分析。来自该代表性实验的数据表明，在用(A)70％甲醇+4％甲醛(FA)+5％乙酸(AA)固定和透化后，保存在CD3-BB515阳性染色细胞的分辨率中，并用(B)4％FA+0.1％Tween20固定和透化后，CD3-BB515阳性染色细胞的损失增加，且相对荧光强度增加。整个方案中阳性染色群信号分辨率的降低也是由于在480-560nm范围内检测到的阴性群的自发荧光增加(Ch02)。
图7示出了根据本发明的合适实施例的使用细胞分析方法对代表性健康血液样品的细胞外观进行性改变的评估。在AMNIS ISX MKII上以40倍的放大倍率生成图像。(A)分离后立即新鲜的外周血单核细胞(PBMC)。(B)在4％甲醛(FA)+0.1％Tween20固定和透化后，细胞保持完整并保存得相对较好。(C)酸变性后，细胞的外观变得更单一。(D)在过夜探针杂交后，细胞继续看起来单一，作为在整个加工过程中细胞膜、细胞质和细胞核一致且明显变化的证据，并且看起来更大且更圆。
图8示出了SpectrumOrange和SpectrumGreen荧光FISH探针结合物的比较。来自该代表性CLL患者的数据表明，用Vysis CEP12-SpectrumOrange共轭探针(A)计数的FISH“斑点”数量与用Vysis CEP12-SpectrumGreen共轭探针(B)计数的数量相等。
图9示出了通过immuno-flowFISH进行的双重FISH探针分析。来自该代表性实验的数据表明，两种FISH探针可以同时与细胞杂交。细胞与带有Hoechst33342核染色剂的VysisCEP12-SG和CEP1-SO探针杂交，以确认核DNA的正确杂交。
图10示出了使用根据本发明合适的实施例的细胞分析方法对具有17p基因座缺失的代表性CLL血液样品的评估。(A)每个CD3+T细胞中“斑点数”或SureFISH 17p PMP FISH探针杂交斑点的数目。(B)每个CD19+B细胞中的“斑点数”或SureFISH 17p PMP FISH探针杂交斑点的数目。也可以在图库中查看门控群。(C)166和641细胞是CD19-BV480阳性、CD3-V500c阴性、CD5-AF647阳性、17p单体B细胞(del17p)。细胞724是CD19-BV480阳性、CD3-V500c阴性、CD5-AF647阳性、17p二体B细胞。细胞1610和2845是CD19-BV480阴性、CD3-V500c阳性、CD5-AF647阳性、17p二体T细胞。重叠图像是免疫表型、17p探针和核SYTOX AADvanced图像的合并。
图11示出了根据本发明合适的实施例的细胞分析方法的方案。A：根据免疫表型标记组合的表达对细胞群进行门控，并在图像库中查看。B：每个细胞中可见的“斑点数”或Vysis CEP1FISH探针杂交斑点的数目。C：通过还分析Vysis CEP1FISH探针信号与核标记Hoechst 33342的共定位，可以提高FISH探针斑点数的准确性。这不包括双峰(细胞229和820)和核外的探针信号(细胞13746)。适当地，排除这些细胞用于精确的非整倍性分析。
图12示出了基于探针斑点的平均荧光强度的斑点数调整。(A)2个斑点群的平均荧光强度(MFI)为22266荧光单位，其中3个斑点的MFI为61511。(B)1个斑点群的MFI为22343个荧光单位，几乎与2个斑点群相同。(C)来自B的1个斑点细胞的Hoechst和CEP12-SpectrumOrange覆盖图像库。(D)来自A的2个斑点单细胞图像库。(E)来自A的具有2个或更多斑点的细胞团图像库。
图13示出了当执行根据本发明的实施例的细胞分析方法时在处理期间荧光强度的降低。在用结合有(A)BB515、(B)BV480和(C)AF647的CD19克隆HIB19染色的外周血单核细胞(PBMC)上进行Immuno-flowFISH。在细胞表面抗体染色(染色后)，4％甲醛(FA)+0.1％Tween20固定和透化(固定/渗透后)，1M盐酸(HCl)酸变性(酸后)和荧光原位杂交(FISH；杂交后)后，取出等分试样以在AMNIS ISX MKII上进行分析。来自该代表性实验的数据表明(A)在整个immuno-flowFISH中最大程度地保留CD19-BB515阳性细胞的分辨率，(B)在阳性细胞中充分保留CD19-BV480荧光，以及(C)杂交后CD19-AF647阳性细胞的大量损失。酸性后，尤其是杂交后，CD19克隆HIB19抗体染色的所有阳性群体的MFI均下降，阳性群体的信号分辨率取决于荧光团。具有所有标志物的阳性种群的信号分辨率下降是由于杂交后，荧光强度降低和阴性种群的背景/自发荧光增加，与完整实验方案后的Ch02(480-560nm)和Ch11(670-745nm)范围相比，在Ch07(430-505nm)范围内可以显著检测到。
图14示出了当执行根据本发明的实施例的细胞分析方法时在处理期间APC荧光的损失。细胞分析的方法在外周血有核细胞上进行，该细胞被结合有BB515、APC和FITC的CD3克隆SK7染色。在细胞表面染色后(染色后)，4％甲醛(FA)+0.1％Tween20固定和透化(固定/渗透后)，1M盐酸变性(酸性后)和荧光原位杂交(FISH；杂交后)后，取出等分试样以在AMNISISX MKII上进行分析。来自该代表性实验的数据证明：(A)CD3-BB515阳性细胞分辨率的保存；(B)杂交后CD3-APC阳性细胞完全丧失；(C)酸性后，CD3-FITC阳性细胞群的大量损失，与荧光团无关。此外，阴性群体的自发荧光杂交后在480-560nm波长(Ch02)中增加了活性，这也降低了与BB515或FITC结合的阳性染色亚群的分辨率。缩写：APC-异花青素荧光基团、BB515-亮蓝515荧光基团、Ch-通道、FITC-异硫氰酸荧光素荧光基团、ISX MKII-ImageStreamXMarkII。
图15示出了在进行根据本发明实施例的细胞分析方法时，在用双(磺基琥珀酰亚胺基)硫酸氢盐(BS3)交联进行处理的过程中荧光强度的保留。细胞分析的方法是对用CD5克隆UCTHC2与AF647偶联的外周血有核细胞进行染色的，(A)不染色，(B)染色后BS3交联。在细胞表面染色和交联(染色后)，4％甲醛(FA)+0.1％Tween20固定和透化(固定/渗透后)，1M盐酸变性(酸性后)和荧光原位杂交(FISH；杂交后)后，取出等分试样以在AMNIS ISX MKII上进行分析。来自该代表性实验的数据表明，在immuno-flowFISH方案中，通过BS3交联可以保留CD3-AF647阳性染色细胞的数量和荧光强度。缩写：AF Alexa Fluor。
图16示出了当进行根据本发明的合适的实施例的细胞分析方法时用于评估CLL样品的两个免疫表型组的比较。具有免疫表型组1(A)、组2(B)对CD3、CD5和CD19群体以及CEP12斑点数的代表性CLL患者样品评估显示了同等的种群密度和FISH斑点数。可以在图像库中查看门控群。(C)在免疫表型组1中，细胞198是CD19-BV480阳性、CD3-V500c阴性、CD5-AF647阳性、CEP12二体B CLL细胞，而细胞392是CD19-BV480阴性、CD3-V500c阳性、CD5-AF647阳性、CEP12二体T淋巴细胞。(D)在组2中，细胞4是CD19-BV480阳性、CD3-AF647阴性、CD5-BB515阳性、CEP12二体B CLL细胞，而细胞6764是CD19-BV480阴性、CD3-AF647阳性、CD5-BB515阳性、CEP12二体T淋巴细胞。覆盖图像是免疫表型和CEP12探针图像的合并。
具体实施方式
为了方便起见，以下各节概述了本文使用的术语的各种含义。在该讨论之后，讨论了关于本发明的组成、药物的使用和方法的一般方面，随后是具体的实例，其证明了本发明的各种实施例的性质以及如何使用它们。
定义
未来的专利申请可以基于本申请或要求本申请的优先权而在澳大利亚或海外提交。应当理解，所附权利要求仅以示例的方式提供，并且无意于限制任何此类未来申请中可能要求保护的范围。可以在以后的权利要求中添加或从临时权利要求中删除特征，以便进一步定义或重新定义一个或多个发明。
下面提供在说明书、示例和所附的临时权利要求中使用的某些术语和短语的含义。如果术语的使用与此处提供的定义之间存在明显的差异，则以本说明书中提供的定义为准。
本领域技术人员将理解，本文描述的发明除了具体描述的那些之外还可以进行变化和修改。本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还单独或共同包括说明书中提及或指出的所有步骤、特征、制剂和化合物，以及任何或所有组合或任何两个或更多个步骤或特征。
本文中引用的每个文档、参考文献、专利申请或专利均通过引用全文明确地结合在本文中，这意味着读者应将其作为本文的一部分进行阅读和考虑。本文中所引用的文件、参考文献、专利申请或专利在本文中不再重复仅仅是出于简洁的原因。但是，所引用的材料或该材料中包含的信息均不应被理解为常识。
本文提及的任何产品或通过引用并入本文的任何文件中的制造商的说明、描述、产品规格和产品说明书，通过引用并入本文，并且可以在本发明的实践中采用。
本发明的范围不受本文描述的任何具体实施方案的限制。这些实施例仅出于示例的目的。功能上等效的产品、制剂和方法显然在本文所述的本发明的范围内。
除了在操作实施例中或在另外指出的地方，在本文中所有表达成分或反应条件的量的数字在任何情况下均应理解为由术语“约”或“大约”修饰。当与百分比结合使用时，术语“约”或“大约”可表示±1％。
本文所述的发明可以包括一个或多个值范围(例如大小、浓度等)。值的范围将被理解为包括该范围内的所有值，包括定义该范围的值以及与该范围相邻的值，其导致与紧邻该值(定义范围边界)的值相同或基本相同的结果。例如，本领域技术人员将理解，范围的上限或下限的10％变化可能是完全合适的，并且被本发明涵盖。更具体地，范围的上限或下限的变化将是5％或如本领域中公认的那样，以较大者为准。
在本申请中，单数的使用包括复数，除非另有明确说明。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用表示“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式(例如“包括”和“包括在”)的使用不是限制性的。另外，除非另外特别说明，否则诸如“元件”或“组件”的术语涵盖包括一个单元的元件和组件以及包括一个以上亚单元的元件和组件。同样，术语“部分”的使用可以包括部分的一部分或整个部分。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，词语“包括”或诸如“包括”或“包含”的变体将被理解为暗示包括陈述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
本文中使用的所选术语的其他定义可以在本发明的详细描述中找到并且贯穿全文使用。除非另有定义，否则本文使用的所有其他科学和技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
现在将参考以下非限制性描述和示例来讨论本发明的特征。
示例性实施例
根据第一形式，本发明提供了一种用于诊断或预测细胞群体中状况的方法，该方法包括以下步骤：
a.选择要分析的细胞群并通过使用流式细胞仪对细胞群进行免疫表型分析来分析细胞群的抗原谱，以检测是否存在一种或多种与待测或评估的疾病相关的生物学标记或参数；以及
b.使细胞群接受至少一个FISH探针，该探针可使细胞可视化并计数，从而可通过其精确表型鉴定特定细胞，从而可鉴定通过表型鉴定的细胞中的基因组畸变。
根据该方法的第一步骤，通过使用流式细胞术对细胞群进行免疫表型分析，可以同时评估多个荧光参数。此步骤还可以可视化群体的细胞形态(细胞特征)，可以对细胞进行免疫表型鉴定，并可以鉴定抗原在细胞膜、细胞质和细胞核上的位置。
优选地，在第二步骤中，FISH探针产生荧光“斑点”或另一信号，以在通过其精确表型鉴定的这些特定细胞中计数。
然后，两组数据(来自步骤1和2)可用于通过成像流式细胞术确定特定医学或治疗状况的存在与否。
根据本发明，本文所述的示例性方法已经被优化用于评估血液系统恶性肿瘤，并且在检测非整倍性以及表型鉴定的细胞中的缺失、易位或融合中具有潜力。优选地，本发明的方法可以用于：
a.恶性肿瘤的诊断、分类和分期；
b.评估治疗后残留疾病的监测。这将有助于以较低的疾病负担检测出疾病，从而可以尽早引入大剂量疗法，包括移植，并有望改善患者的预后；
c.预后判断；和/或
d.治疗决策。
在本发明的非限制性优选形式中，immuno-flowFISH方法用于检测赘生性细胞亚群中的遗传差异。例如，可以研究具有不同遗传异常以及基因组漂移或克隆进化(即获得新的染色体畸变)与疾病进展的肿瘤细胞在细胞动力学(即，倍性、凋亡和细胞周期)方面的差异。这些生物学特征可用于改变治疗的时机和选择(例如特定的靶向治疗)，具有改善临床结果的潜力。
除了与癌症相关的分析，immuno-flowFISH方案可用于调查非恶性疾病，包括通过检测母体血液或血液嵌合体中存在的胎儿细胞的染色体缺陷来进行产前诊断，这是遗传上不同的细胞的存在，这些细胞起源于另一个人的血液。这种现象已在许多临床环境中得到证实，包括胎儿-母体贩运、双胞胎研究、实体器官或同种异体造血移植和非白细胞输血。因此，immuno-flowFISH方法有许多非恶性应用。
优选地，本发明的方法用于研究示例方法的以下一种或多种可能的应用：
a.非恶性疾病的应用，例如：
i.产前应用
1.具有染色体缺陷或与母体血液不同的疾病的产前诊断：鉴定母体循环中的胎儿细胞(有核红细胞或滋养细胞)
a.胎儿来源的有核细胞：
i.免疫表型可鉴定具有HbF(细胞内)、CD71(转铁蛋白受体)抗体的有核红细胞，或具有HLA-G(CD45阴性)抗体的滋养细胞
ii.针对目标疾病的探针，
1.数值：例如CEP21唐氏综合症
2.结构：较少见
b.母血中男性来源的胎儿淋巴细胞：
i.免疫表型：通过CD45进行识别(不会将孕妇与胎儿区分开)
ii.探针：具有Y染色体的男性
ii.嵌合性：
1.移植后性别不匹配的移植
a.免疫表型：通过CD45识别淋巴细胞(不会区分受体和供体)
b.探针：X和Y染色体
b.恶性疾病
i.血液系统恶性肿瘤：通过表型鉴定肿瘤细胞中的染色体畸变。局限性是只有适当的抗体-荧光染料组合和探针。
1.分类：基于表型和染色体的WHO分类的疾病诊断和分类。
a.数值异常(“非整倍性”)：单体型、三体型、四体型、超二倍体、次二倍体
i.示例：急性白血病、慢性白血病、浆细胞骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、淋巴瘤
b.结构异常：缺失、融合
i.示例：急性白血病、慢性白血病、浆细胞骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、慢性嗜酸性粒细胞白血病、淋巴瘤
2.治疗决策：根据表型确定的特定疾病(例如慢性淋巴细胞性白血病和del(17p)；del(5q)的骨髓增生异常综合征)中染色体缺陷的存在，选择治疗方案
a.高灵敏度
b.可检测的克隆负担低
3.预后：以染色体异常分类的疾病，例如：
a.慢性淋巴细胞性白血病
b.浆细胞骨髓瘤
c.骨髓增生异常综合症
d.急性粒细胞白血病
e.急性淋巴细胞白血病
f.淋巴瘤
4.残留疾病：
a.基于染色体缺陷的最小残留疾病负担
b.基于染色体缺陷的新克隆的获得
c.自体移植收获前的疾病根除
d.敏感性问题：敏感性1：105
i.比形态更敏感
ii.比FISH敏感(1-5细胞/100)
iii.比flow MRD更敏感
iv.可能不如RT-PCR敏感(1：105)
ii.非造血细胞：诊断和分类
1.原发性肿瘤：鉴别诊断
a.组织：从组织中提取的细胞。
i.数值异常：非整倍性(例如，鉴别诊断黑色素瘤与非典型痣)
ii.结构异常：缺失、融合(例如，非霍奇金淋巴瘤)
b.治疗决策：根据表型确定的特定疾病中染色体缺陷的存在选择治疗
2.转移性疾病：通过肿瘤细胞的表面或细胞内非造血抗原来鉴定。
a.高灵敏度
b.可检测的克隆负担低
a.血液：循环肿瘤细胞(CTC)
b.例如：乳房；黑色素瘤
c.骨髓：转移细胞
c.其它应用，包括：
i.DNA：特定遗传区域的BAK探针
ii.RNA探针：转录的检测
iii.科学应用：
1.细胞倍性(例如巨核细胞)
d.非人类基因型评估：
i.细胞内病毒检测：检测整合到通过表型鉴定的人类细胞中的病毒基因组DNA序列。
1.Epstein-Barr病毒(EBV)：感染B细胞，是通过调节细胞复制和凋亡(例如劫持MYC和BCL2L11基因)而已知的癌病毒。
a.根据WHO的分类，非霍奇金淋巴瘤(即伯基特淋巴瘤)和霍奇金淋巴瘤等血液系统恶性肿瘤与EBV潜伏感染密切相关
2.可以使用用于检测EBV DNA或相关转录本的商业探针(例如肽核酸探针)，也可以合成与各种类型的荧光团偶联的特异性寡核苷酸探针以用于EBV基因组的特异性检测。
它也可以用于通过对转基因载体序列的探针来鉴定CAR-T细胞的持久性。特别地，它可以用于检测工程引入的核酸序列及其在细胞中的表达。
本发明技术特别使用的主要非恶性应用之一是胎儿(尤其是唐氏综合症)疾病的产前(或出生前)诊断。例如，唐氏综合症首先在1959年被描述，是新生儿中最常见的染色体疾病，在澳大利亚每千名婴儿中有1名，在美国800名婴儿中有1名。唐氏综合症患者通常具有独特的面部特征，某些智力障碍、心脏或消化道问题以及视力或听力障碍。唐氏综合症是由3号而不是2号染色体21的存在引起的(“21三体性”)。年龄较大的母亲更有可能在其卵内的染色体数目上出现错误，并且在35岁以上的母亲中，有唐氏综合症的活产婴儿的机会增加到259分之1(Morris JK,Mutton DE,Alberman E.Revised estimates of maternal agespecific live birth prevalence of Down syndrome.Journal of MedicalScreening.2002；9:2-6)。当前提供产前筛查测试，包括孕早期风险评估、孕妇血清分析物筛查和胎儿结构超声分析。这些只能预测风险；确诊诊断性检查是侵入性检查(羊膜穿刺术或绒毛膜绒毛取样)，有胎儿受伤或流产的重大风险。诊断需要检测21号染色体的拷贝数，并通过全染色体分析(核型分析)或FISH进行，以特异性“标记并识别”21号染色体。1969年，首次报道母体循环中存在少量有核胎儿红细胞(每10,000个母体血细胞中有1个)。这增加了将它们隔离并用于非侵入性产前检查的可能性。已经开发了许多分离、富集和评估方法，但由于它们的复杂性，低细胞产量和不一致的结果，尚未将其转化为临床实践。但是，immuno-flowFISH方法可以在母体循环中确定胎儿细胞中21号染色体的拷贝数，而无需进行分离或富集或侵入性测试。
本领域技术人员将认识到，本申请人的immuno-flowFISH方案可用于研究许多不同样品，需要对免疫表型样品进行高通量FISH分析，因此，它可能对国际/国家诊断病理学实验室和研究实验室很有用。
在第二方面，本发明提供了一种用于细胞分析的immuno-flowFISH方法，包括：
a.制备包含具有细胞表面、细胞质或核标志物(抗原)的有核细胞的单细胞悬浮液；
b.抗体染色细胞标志物以表型化细胞；
c.在同一步骤中固定和透化细胞；
d.对细胞进行细胞遗传学技术(如本文所述)以检测细胞染色体(正常或异常)；
e.染色细胞DNA；以及
f.对细胞进行成像流式细胞术。
在本发明的形式中，该方法还包括以下步骤：
a.分析从成像流式细胞仪获得的数据，以基于数据分析来检测是否存在医学或治疗状况。
优选地，在执行本发明时，在整个方案中保护样品免受光的影响。
在制备细胞样品中，从怀疑患有疾病或病症的受试者中收集样品。样品可以包括外周血或骨髓或组织样品。如果样本是从例如包含有核细胞的外周血中获取的，则样本中的有核细胞可能包含恶性细胞(例如CLL细胞)和淋巴细胞，它们可以用作分析正常染色体的健康对照(例如T淋巴细胞))。
优选地，该方法中使用的样品将具有1x 106个有核细胞和5x 106个有核细胞或这些细胞数目之间的任何数目。
首先，如果样品是血液或骨髓，则优选通过裂解红细胞来制备单细胞悬浮液。这可以通过以下方法实现：优选在低渗缓冲液(如氯化铵)或市售裂解液(如氯化铵钾)的存在下孵育样品，或用0.1％Triton X-100、NP-40或Brij-58处理。单细胞悬浮液也可以通过密度梯度离心、磁性细胞分离或酶消化来制备。离心条件是足以分离细胞而不损坏细胞的条件。这样的条件将被本领域普通技术人员所认识。
如果样品是组织活检，则通过将样品与含酶的缓冲液孵育以裂解组织基质和细胞间粘附(“消化”)，如胶原酶、蛋白酶和DNaseI，来制备有核细胞的单细胞悬浮液。
如果将样品冷冻保存(例如，生物库)，则可以通过在包含氯化镁和DNaseI酶的罗斯威尔公园纪念学院(RPMI)培养基中融化并洗涤样品来制备有核细胞的细胞悬浮液。
细胞样品制备步骤还可包括离心步骤(其涉及例如以200xg离心5分钟或任何类似的分离速度)，然后去除上清液，以将裂解或消化的细胞材料与有核细胞分离。
优选地，该步骤还包括洗涤步骤，该洗涤步骤包括例如用5ml PBS以200xg离心5分钟。离心的条件将包括足以分离细胞而不损害细胞的条件，并且将被本领域普通技术人员所认识。
根据本发明，细胞标志物的抗体染色优选包括用免疫表型抗体混合物对有核细胞染色，所述抗体的抗体混合物是从诸如BD Bioscience或BioLegend的公司购买的适合目标人群的免疫表型的抗体(例如：用于慢性淋巴细胞白血病[CLL]分析的抗人CD19、CD5和CD3)。此类免疫表型抗体可商购获得，包括以下抗体：FITC-CD3、FITC-CD4、BB515-CD3、BB515-CD4、BB515-CD5、BB515-CD19、BB700-CD4、PE-CD3、PE-CD4、PECy5-CD4、PECF594-CD4、PECy7-CD4、PECy7-CD19、PerCPCy5.5-CD4,BV421-CD4、BV480-CD3、BV480-CD4、BV480-CD5、BV480-CD19、BV510-CD4、V500c-CD3、BV605-CD4、BV650-CD4、BV650-CD19、BV711-CD3、APC-CD3、APC-CD4、APC-CD19、AF647-CD3、AF647-CD5、AF647-CD19、APCCy7-CD4、APCH7-CD3、APCH7-CD19、AF700-CD3、AF700-CD4、APCR700-CD4、APCeFlour780-CD3、APCeFlour780-CD19or APCFire750-CD3。
抗体染色可进一步包括孵育细胞以允许抗体有足够的时间结合其细胞抗原或配体。例如，可以将细胞在大约四摄氏度下孵育大约三十分钟。抗体染色的条件将是足以促进抗体抗原相互作用而又不损害细胞的条件。这样的条件将被本领域普通技术人员所认识。
抗体染色还可包括洗涤步骤以去除过量的未结合抗体。可以用800uL 2％FCS/PBS进行此步骤，并将细胞以950xg离心3分钟。虽然，在这种情况下的洗涤条件将是足以去除未结合的抗体，同时注意去除结合的抗体的条件，并且将被本领域普通技术人员所认可。
根据本发明，细胞固定步骤优选包括将甲醛添加到样品中。最佳方案是将约4％甲醛与细胞悬浮液一起孵育。备用的细胞固定包括：0.5-3％甲醛；Carnoy的固定剂(甲醇3：1乙酸)；甲醇50-100％；70％甲醇+4％甲醛+5％乙酸；50％甲醇+4％甲醛+5％乙酸；70％甲醇+4％甲醛；70％甲醇+5-25％乙酸；甲醛4％+0.1％Tween20和70％丙酮。此外，该4％甲醛固定步骤可包括在大约1％的非离子型去污剂处添加非离子型去污剂。细胞渗透需要非离子型去污剂，以使探针能够进入目标DNA进行FISH。甲醛和非离子型去污剂的结合使细胞能够在一个步骤中被固定和渗透，这更加经济，减少了操作时间并减少了操作流程。例如，非离子型去污剂可以是Tween20，它通常用于流式细胞术的细胞透化，或用于分别检测细胞内抗原或靶DNA的FISH应用。理想的是，样品也要进行孵育、洗涤或离心，以便用甲醛和tween20固定和透化。
然后将样品重悬于具有小牛/牛血清的磷酸盐缓冲盐水中，以在固定后在例如4℃下储存3-5天，在这段时间内，它们可以在杂交和分析之前与其他样品一起运输或“分批”。
进行细胞遗传学技术需要将细胞与探针，优选与FISH探针杂交。在这方面，细胞遗传学技术步骤还可以包括使DNA变性、阻断非特异性探针DNA结合以及与被检查细胞中的核材料进行FISH探针杂交的步骤。
酸可用于使DNA变性。当使用酸进行变性时，酸最好是浓度约为0.5M-1M的盐酸。测试的其他DNA变性条件包括：0.5-4M盐酸；5-25％乙酸；5-15％二甲基亚砜(DMSO)；70％丙酮和0.1ug/ml蛋白酶K。
在细胞遗传学技术步骤的优选形式中，将细胞在3ml冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中淬灭。然后将淬灭的细胞以600xg离心10分钟，并除去上清液。
优选地，在阻断步骤中，阻断非特异性探针DNA与FISH探针杂交的结合。这可以通过将样品暴露于PBS/BSA然后洗涤细胞来实现。(例如，用1mlPBS/BSA以950xg离心3分钟)。然后可以除去所得的上清液，并将细胞重悬于杂交缓冲液中，例如2x标准柠檬酸钠中的50％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸盐、0.1％Tween20，以进行FISH探针分析。然后以本发明的这种形式将细胞加热至73-74℃以使DNA变性和/或促进探针退火。该步骤优选在自动热循环仪中进行。然后可以将细胞在严格溶液中，例如在0.4-2x标准柠檬酸钠缓冲液中的0.1-0.3％Igepal CA-630中洗涤至少一次，然后重悬。Igepal CA-630是一种非离子型去污剂，可溶解膜成分，并具有非特异性的探针结合，以及标准柠檬酸钠是一种盐，它还能以浓度依赖的方式(即较低的盐等于较高的严格性)破坏非特异性探针结合，同时保持细胞处于悬浮状态。然后对细胞进行核DNA染色，可以在室温下进行20分钟的Hoechst(1：1000或1ug/ml)或SYTOXAADvanced(1：5000或0.2uM)。
根据本发明，对细胞进行成像细胞计数的步骤包括使用激发激光并捕获明场图像，荧光发射和515-810nm波长范围内的图像。激发激光器可以包括100mW 405nm、和/或50mW 488nm、和/或150mW 561nm、和/或150mW 592nm、和/或120mW 642nm激光器。进行成像细胞计数优选地涉及以至少40x的物镜捕获图像。可以在30倍至70倍的物镜范围内捕获图像。理想地，以大约60倍的物镜捕获图像。
进行成像细胞计数还可包括在散点图中识别细胞。适当地，在样品中至少记录10,000个细胞，优选总共记录100,000-1,000,000个细胞。此外，可以在没有明场和785nm“散射”激光的情况下分析单个染色的细胞，并可以计算补偿矩阵。
根据本发明，在成像流式细胞术步骤中，使用诸如IDEAS(美国西雅图AMNISMerck)、CellProfiler(美国马萨诸塞州布罗德研究所)和FCS Express v6图像细胞仪(美国加利福尼亚州De Novo Software)等图像分析软件进行immuno-flowFISH数据分析。数据分析可以包括通过测量图像的清晰度或质量(例如，梯度均方根或GRMS)来选择聚焦图像，这将增加用于FISH分析的探针斑点数的准确性。优选地，以纵横比对明场面积的散点图来准备数据，以鉴定单个细胞并去除可能提供假阳性FISH结果(例如超倍性)的双峰或细胞团块。
分析还可以包括通过排除具有高荧光强度的细胞来鉴定荧光强度直方图中的有核非分裂细胞。这样的数据分析将理想地包括基于标志物如正常淋巴细胞(即T淋巴细胞、B淋巴细胞)和恶性细胞((例如CLL、急性粒细胞白血病、浆细胞骨髓瘤))的荧光强度的目标门控细胞群，这取决于应用和所使用的细胞标志物。
优选地，数据分析包括使用对两个图像在被遮盖的区域内线性相关的程度的量度来确定FISH探针信号与核染色剂的共定位。数据分析可包括使用峰、斑点或强度掩模对每个细胞的FISH探针斑点数进行计数。这可能涉及根据每个像素是连接到特定点还是背景来检查每个像素的连通性。优选地，通过比较单个斑点数群体中的每个斑点数的FISH信号的测量荧光强度的单参数直方图来验证斑点数。
在第三方面，本发明提供了一种用于细胞分析的诊断方法，包括以下步骤：
a.制备有核单细胞悬浮液；
b.(a)中产生的悬浮液对细胞表面、细胞质或核标志物的抗体染色，并检测染色的抗体；
c.在同一步骤中在悬浮液中将细胞固定和透化；
d.变性DNA、阻断非特异性探针DNA结合以及将FISH探针与受检细胞中的核材料杂交；
e.对细胞进行成像流式细胞术；以及
f.根据步骤(b)和(e)的结果分析步骤(e)的数据，以诊断是否存在医疗状况。
在本发明的第三方面的特定形式中，该方法包括以下步骤：
a.分离有核细胞并制备细胞悬浮液；
b.使用免疫表型抗体形成抗原-抗体复合物来染色细胞表面、细胞质或细胞核抗原，该抗体识别特定于所检查疾病的细胞标志物；
c.进行包括稳定在内的全抗原抗体反应，并在80分钟内淬灭；
d.然后在同一步骤中将细胞固定并透化；
e.然后将细胞中的DNA变性，并用低浓度的盐酸淬灭；
f.然后优选用BSA阻断非特异性探针DNA的结合；
g.然后至少加入一个FISH探针并与DNA退火并杂交；
h.然后在严格条件下洗涤样品，以去除过量的FISH探针；
i.然后对DNA染色以观察细胞核，并使用流式细胞仪检查样品；以及
j.然后使用ImageStreamX分析来自步骤(b)和(i)的数据，以确定是否存在医学状况，例如CLL中的12号染色体三体(染色体数增加)或17p缺失(染色体部分丢失)。
值得注意的是，该实验方案在某些重要方面与先前的现有技术实验方案不同(参见表1)。例如，最初在血液和骨髓样品中，红细胞被裂解。这可以通过将样品与低渗溶液(如氯化铵)或商用溶液(如BD PharmLyse(澳大利亚悉尼的BD Bioscience))一起孵育来完成。接下来，细胞固定和透化在同一步骤中进行，这导致更有效的通透性。第三，在抗体抗原交联淬灭后去除洗涤步骤减少了细胞损伤并在方案结束时导致更好的产率。接下来，降低酸浓度可显着提高方案结束时的细胞产量(immuno-S-FISH方案中的局限性)。接下来，在DNA和FISH探针杂交步骤中，该方法包括用于非特异性探针DNA结合的BSA阻断步骤。接下来，与探针制造商(例如，Abbott Molecular的VysisCEP探针)的建议相比，严格性洗涤的顺序相反，从而可以更好地去除未结合的和非特异性的FISH探针结合。
在第四方面，本发明提供了一种诊断试剂盒，其包含本发明方法的一个或多个组件，以及关于如何在该方法中使用该试剂盒的说明。
特别地，本发明扩展到试剂盒，其包含(a)至少一种适合标准流式细胞术的标志物检测系统，(b)一种或多种本发明的FISH探针，(a)和(b)的每一个都放在一个或多个容器中，并与说明手册或信息手册一起，该手册提供关于在本发明的方法中使用(a)和(b)的指令和/或信息。
此外，试剂盒还可在一个或多个容器中包含：一种或多种适用于本发明方法的缓冲液。
优选地，试剂盒中存在的标志物检测系统是适合于对细胞样品进行免疫表型鉴定的抗体。
表1：手动FISH和手动FICTION分析与通过流式细胞仪和immuno-flowFISH进行自动免疫表型分析的比较。
方法的说明性例证
现在将参考以下本发明的特定而非限制性实例来描述本发明。
在本发明的高度优选的实例中，immuno-flowFISH方案包括但不限于以下步骤，这些步骤虽然被分开列出，但是可以在共同的阶段中被分组在一起：
a.收集细胞样品并准备单细胞悬浮液，例如，溶解血液/骨髓中的红细胞(RBC)，与酶一起孵育以去除组织活检或冻存的冷藏样品中的组织基质；
b.按照制造商的说明，将细胞与荧光偶联抗体一起孵育，以在4℃下检测细胞抗原30分钟；
c.用PBS/2％FCS洗涤细胞；
d.在1mM BS3中于4℃孵育30分钟(不要洗涤细胞)；
e.与100mM Tris-HCL pH7.4/150mM NaCl一起孵育，并在4℃淬灭20分钟(最好不要抽吸)；
f.加入4％甲醛和0.1％Tween20，轻轻抽吸以混合并在室温下孵育10分钟；
g.用PBS/2％FCS洗涤细胞；
h.在室温下于0.5M盐酸(酸)中孵育20分钟；
i.加入冰冷的PBS，以600xg离心10分钟，然后除去上清液；
j.用PBS/1％BSA阻断样品；
k.洗涤并除去上清液；
l.重悬于2xSSC中的0.1％NP-40中将细胞转移至0.2ml微量离心管中；
m.以950xg离心3分钟，然后除去所有多余的缓冲液；
n.用FISH探针重悬于CEP杂交缓冲液中；
o.在73-74℃下变性5分钟；
p.在37℃杂交16-20小时；
q.用0.1％NP-40的2xSSC溶液洗涤并除去上清液；
r.重悬于0.4xSSC中的0.3％NP-40中(预热至42℃)，并在42℃下孵育5分钟；
s.用PBS/2％FCS洗涤细胞；
t.重悬于DNA染色液(例如SYTOX AADvanced在PBS中以1：5进样)并在室温下孵育20分钟；以及
u.使用60倍放大率和EDF在AMNIS ImageStreamX上进行分析。
在该方法中，使用以下缩写
a.BSA牛血清白蛋白
b.CEP-染色体计数探针
c.DAPI-DAPI(4'，6-二mid基-2-苯基吲哚)
d.EDF景深扩展
e.FBS/FCS-胎牛血清又名FCS或胎牛血清
f.PBS磷酸盐缓冲盐水
g.SSC-盐柠檬酸钠
优选地，如上所述，在整个方案中保护样品免受光照。
优选地，在immuno-flowFISH方案中分析的细胞是有核细胞，尤其是该方案能够分析染色体，例如1、12和17号染色体，和/或染色体、基因座或基因的一部分，例如17号染色体短臂上的基因。
可以分析此类细胞和遗传物质以鉴定由基因或染色体的获得或损失引起的细胞遗传学异常或先天性疾病。
在一个特定方面，immuno-flowFISH方案可用于检查诸如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的医学病症的染色体改变，诸如12号染色体三体性或17p(del17p)的缺失。为了通过示例的方式促进对本发明的描述，在检查慢性淋巴细胞白血病(CLL)的12号染色体拷贝数和17p(del 17p)缺失的情况下，在正常血液B和T淋巴细胞群分析的背景下描述了immuno-flowFISH方案。因此，这些示例说明了该方法在正常健康B细胞和T细胞群中通过1号染色体和12号染色体二体分析进行数字染色体分析的应用，和CLL中的12号染色体三体分析(图2)，以及结构突变，例如17p号染色体上基因座的缺失。
生存力染色
死细胞是“粘性的”，并且可以通过非特异性结合用于免疫表型的抗体而产生假阳性结果。在常规流式细胞仪免疫表型分析中，这是确定活细胞和死细胞相对比例的常规做法。通常通过生存力染色来实现该结果，即用不渗透细胞的染料(例如碘化丙啶、7AAD或DRAQ7)对活的(未固定的)细胞进行染色，这些染料仅对具有受损/通透膜的细胞中的核酸进行染色。当荧光染料和DNA之间存在平衡时，就会发生DNA染色，因此在随后的处理过程中，染料会与DNA分离，最终使样品中的所有细胞染色。
根据本方案，优选使用可固定的生存力标志物，例如BioLegend Zombie染料、eBioscience可固定生存力染料(FVD)eFluor780或Thermo Fisher的LIVE/DEAD可固定生存力染料，它们是胺反应性染料，对活细胞显示弱的正荧光(仅表面胺染色)，而对死细胞则显示强阳性染色(表面和细胞内胺染色)。可固定活性染料的最佳用量可能需要通过初步滴定实验来确定。
有核单细胞悬浮液的制备
优选地，immuno-flowFISH方案的第一步涉及从患者中分离样品，所述样品包含约5×106个细胞。这样的样品将允许通过成像流式细胞术分析至少200,000个事件。
优选地在实验方案的构造中，还将有一个已知染色体异常的阳性对照(例如已知具有12号染色体三体性的CLL患者或细胞培养物)和阴性对照(例如没有12号染色体三体性的CLL患者或健康献血者)。
在示例方案中，从血液制备有核单细胞悬浮液的步骤可以包括：
a.通过肘前静脉穿刺将健康志愿者和CLL患者的血液收集到VACUETTEEDTA真空管中(德国弗里肯豪森Greiner Bio-One Preanalytics)；
b.通过将1:40体积的全血与BD PharmLyse(澳大利亚悉尼BD Bioscience)一起孵育(例如250μL血液和10mL PharmLyse)来制备外周血有核细胞，缓冲液中pH7.1-7.4的氯化铵基裂解剂溶解10分钟以溶解红细胞，可以将冻存的样品快速融化，并用含有5mM氯化镁和10U/mL DNaseI酶的RPMI培养基洗涤；以及
c.以200g离心5分钟，然后除去上清液。
另外，该方法中的该步骤可以包括用磷酸盐缓冲盐水(不含胎牛血清[FBS]或EDTA的PBS)洗涤细胞(优选2次)，并在200g离心5分钟。任选地，洗涤缓冲液具有(贯穿整个方案)PBS/2-6％FBS、PBS/0.5-1％BSA、PBS/2％FBS/1-5mM EDTA、PBS/1mM EDTA。最佳洗涤缓冲液是新鲜收集的样品为PBS/2％FBS，冷冻保存的样品为PBS/1mM EDTA。
表面标志物的抗体染色(免疫分型)
方案中的下一步是对细胞抗原染色。在本发明的一个说明中，这涉及细胞标志物的基于抗体的染色。该方案还可以包括“同型对照”，以区分抗体与细胞的特异性抗体-抗原结合和非特异性结合。这可以通过用同型对照抗体染色来实现。
另外，当进行多参数分析时，该方案还可以包括“荧光减一(FMO)”对照，其允许精确鉴定显示出高于背景水平的荧光的细胞。优选地，还包括未染色的样品以确定数据分析期间细胞的背景水平或自发荧光。同型和FMO对照每个样品可能只需要1x106个细胞，因为它们无法通过完整方案进行。表2显示了在CLL情况下评估12号染色体拷贝数的样本和对照设置。
表2. 12号染色体拷贝数的CLL评估示例：诊断评估和对照样本。
AF647 Alexa Fluor 647荧光团、BB515亮蓝515荧光团、CLL慢性淋巴细胞性白血病、PBMC外周血单核细胞、CEP染色体计数探针、FMO荧光减一
在本发明的说明性形式中，细胞标志物的抗体染色步骤(免疫表型)包括以下步骤：
a.用免疫表型抗体混合物将有核细胞染色，该混合物包含：
i.用于CLL评估的AF647偶联的小鼠抗人CD3(克隆SK7，Australian Biosearch)，BD Horizon BB515偶联CD5(克隆UCHTC2，BD Biosciences)和BD Horizon BV480偶联的小鼠抗人类CD19(克隆SJ25C1，BD Biosciences)(图2，表3a)；或者
ii.用于CLL评估的BD Horizon V500c偶联的小鼠抗人CD3(克隆SK7，AustralianBiosearch)，AF647偶联的CD5(克隆UCHTC2，Australia Biosearch)和BD Horizon BV480偶联的小鼠抗人CD19(克隆SJ25C1，BD Biosciences)(表3a)；或者
iii.用于急性淋巴细胞白血病评估的BD Horizon BB700偶联的小鼠抗人CD22(克隆HIB22，BD Biosciences)，BV421偶联的小鼠抗人CD34(克隆BD Biosciences)，V500c偶联的小鼠抗人CD45(克隆2D1，BD Biosciences)，BV605偶联的小鼠抗人CD10(克隆HI10A，BDBiosciences)，AF647偶联的CD19(克隆HIB19，Australian Biosearch)和可固定生存力染料eFluor780(ThermoFisher Scientific)(图3，表3b)；或者
iv.用于多发性骨髓瘤评估的BD Horizon BV480偶联的小鼠抗人CD38(克隆HIT2，BD Biosciences)，V500c偶联的小鼠抗人CD138(克隆MI15，BD Biosciences)，BV605偶联的小鼠抗人类CD45(克隆HI30，BD Biosciences)，AF647偶联的CD19(克隆HIB19，AustralianBiosearch)和可固定生存力染料eFluor780(ThermoFisher Scientific)(图4，表3b)；
或者
v.按照制造商的建议进行适当的同型对照(表3)；
b.在4℃下孵育5x106个细胞30分钟；
c.用PBS/2％FBS洗涤细胞；以及
d.以950g离心细胞3分钟。
表3a.用于在AMNIS ImageStreamX mark II上进行CLL检测的immuno-flowFISH免疫表型-基因型(染色体)检测板的示例。
*仅列出与测试的荧光团有关的通道。**CD3克隆SK7、CD5克隆UCTHC2、CD19克隆SJ25C1。缩写：AF647 Alexa Fluor 647荧光团、BF明场、BB515艳蓝515荧光团、BV480艳紫480荧光团、CEP-染色体计数探针、Ch通道、Del缺失、SG SpectrumGreen、SOSpectrumOrange或-OrangeRed
表3b.用于在AMNIS ImageStreamX mark II上进行ALL和浆细胞骨髓瘤(Myeloma)检测的immuno-flowFISH免疫表型-基因型(染色体)检测板的示例。
*仅列出了与所测试的荧光团有关的通道。缩写：AF647 Alexa Fluor 647荧光团、ALL急性淋巴细胞白血病、BF明场、BB515亮蓝515荧光团、BB700亮蓝700荧光团、BV421艳紫421荧光团、BV480艳紫480荧光团、Ch通道、G绿色荧光团、R红色荧光团、SG SpectrumGreen、SO SpectrumOrange
为了提高在酸性变性过程中结合荧光团的抗体与细胞抗原结合的稳定性，根据制造商的建议，将细胞在4℃的胺对胺交联剂(澳大利亚悉尼Thermo Scientific)MilliQ水中的1mM双(磺基琥珀酰亚胺基)硫酸盐(BS3)中孵育30分钟，然后在4℃下在5体积的100mMTris-HCL pH7.4/150mM NaCl中淬灭20分钟。
固定和透化
在本发明的说明性形式中，固定步骤包括：
a.向细胞溶液中加入新鲜的4％甲醛和0.1％Tween20，并轻轻抽吸混合；以及
b.在室温下孵育细胞溶液10分钟以固定细胞蛋白并透化细胞膜。
在本发明的替代形式中，步骤(a)可以包括1-4.2％的甲醛固定和0.05-2.5％的Tween20，其中甲醛的最佳量为4％，Tween20为0.05至0.1％。
甲醛是流式细胞术中常用的固定剂，其使细胞蛋白交联并将可溶性蛋白锚定在细胞骨架上以保持细胞结构。甲醛固定可保持细胞形态，并能产生稳定的FISH信号。在另一种形式中，醇可用于通过蛋白质沉淀/变性来固定细胞，并可与乙酸(例如Carnoy固定剂)结合使用，以更好地保持形态和DNA完整性。虽然Carnoy的固定剂通常用于玻片FISH相关实验方案，但不能在该实验方案中使用，因为它会破坏大多数商业荧光团，从而导致在固定步骤中荧光和免疫表型丧失。发明人已经发现，尽管基于甲醇的固定提供了足够的细胞固定，但是在immuno-flowFISH方案中甲醛固定是优选的，而无甲醇的甲醛提供了最佳的结果。
该步骤还促进完整细胞的充分透化(允许探针进入细胞核)。也就是说，当甲醛与质膜增溶剂如非离子型去污剂(例如Tween20)结合使用时，可以实现细胞透化。但是，有多种透化试剂盒和实验方案可用于流式细胞术。应用的方法通常取决于所研究和随后分析的细胞类型，例如细胞因子或核膜蛋白的细胞内染色。例如，皂苷选择性地去除膜胆固醇，从而在细胞膜中形成孔，但是许多细胞类型都对皂苷活性具有抗性。TritonX-100是广泛用于细胞透化方案的非离子表面活性剂的另一个示例，然而，这是一种快速作用的“强力”去污剂，可迅速破坏细胞膜，并已被证实可在短短10分钟的孵育后减少随后的核酸荧光分析(Amidzadeh Z,Behbahani AB,Erfani N,et al.Assessment of differentpermeabilization methods of minimizing damage to the adherent cells fordetection of intracellular RNA by flow cytometry.Avicenna J MedBiotechnol.2014；6(1):38-46)。Tween20(在本实验方案中首选)是一种亲水性更高的非离子型去污剂，因此是一种较弱的离解剂，可更缓慢，更温和地渗透细胞膜。使用像Tween20这样的弱表面活性剂的优点是，与速效剂(如TritonX-100)相比，化学纯度的小幅变化不太可能影响其作用。如果在实验过程中或在诊断实验室之间使用不同批次的洗涤剂，则可得到更可重复的结果。另外，已经发现在多种细胞类型(例如外周血细胞、脾细胞和许多组织培养细胞系)中，它们具有相似的细胞膜效应，降低了在immuno-flowFISH分析过程中细胞内试剂诱导的变化的可能性。
在示例性方案中，发明人使用0.1％Tween20。如在其他杂交研究中所见，这会在细胞膜上形成足够大的孔以供FISH探针进入细胞，而不会损害细胞膜的完整性。Tween20的0.1％溶液也远低于导致细胞膜破裂以及随后在酸变性和杂交过程中高细胞损失的浓度。
在上述步骤之后，将细胞用PBS/2％FBS洗涤。在酸变性之前，它们也可以在950g离心3分钟(下一步)。
可选：样品可以在小牛/牛血清与磷酸盐缓冲盐水中重悬，以在固定后在4℃下储存3-5天，在这段时间内，它们可以在杂交和分析之前与其他样品一起运输或“分批”。
DNA变性和FISH探针杂交条件
在本发明的说明性形式中，使DNA变性和FISH探针杂交的步骤包括：
a.用0.5M-1M(最好是0.5M HCl)盐酸(37％AnalaR，SG1.18，Normapur，VWRSydney，Australia)在室温下变性DNA 20分钟；
b.在冰冷的PBS中淬灭；
c.在PBS/1％BSA中离心和重悬细胞以阻断非特异性探针结合；
d.再次离心细胞；
e.在2％标准柠檬酸钠(SSC)缓冲液中的0.1％Igepal CA-630(Sigma-Aldrich，悉尼，澳大利亚)中重悬细胞(从pH值为7的MilliQ水中的3M氯化钠和0.3M柠檬酸钠的20xSSC储备液在MilliQ水中以1:20稀释)；
f.将细胞转移至最大回收量为0.2ml的PCR管中(Axygen，California，USA)；
g.在950g下离心；
h.用移液器小心地除去所有上清液；以及
i.将细胞重悬于含有MilliQ水(2μL)和1μL FISH探针的杂交缓冲液(7μL)中，以进行单FISH探针分析，或进行双重FISH探针分析，重悬细胞杂交缓冲液(7μL)与MilliQ水(1uL)和1μL的每个FISH探针(总探针为2μL)。
分析的探针可以包括Vysis CEP12-SpectrumOrange、Vysis CEP12-SpectrumGreen、Vysis CEP1-SpectrumOrange探针和Vysis CEP4-SpectrumGreen(AbbottMolecular，Sydney，Australia)或Vysis ETV6-RUNX1易位探针(Abbott Molecular)(图5)或SureFISH 17p12PMP22-OrangeRed 458kb基因座探针(Agilent Technologies)。
合适的CEP探针与Vysis CEP(VCEP)杂交缓冲液一起孵育，除非另有说明，否则该缓冲液在1xSSC中为55％的甲酰胺和10％的葡聚糖硫酸盐，或在2xSSC中的50％甲酰胺、10％的葡聚糖硫酸盐、0.1％的Tween20内部FISH杂交缓冲液。
有时需要预杂交处理，以使细胞核/染色质不稳定地变性，特别是在整个完整细胞中。由于染色质结构的差异(例如，粒细胞比淋巴细胞需要更高的温度)，最佳变性和杂交条件会因细胞类型而异。化学(例如盐酸)或酶处理(例如胃蛋白酶或蛋白酶K)可用于透化和去除组蛋白，其可稳定细胞核中的染色质。酸和碱还会破坏氢键，类似于加热或溶剂变性，氢键会参与双链DNA的碱基配对。蛋白酶K是高活性的内肽酶，其激活内源核酸酶，并且由于固定后核酸酶活性降低，因此在示例方法中未发现改善杂交。
在该方案的开发中，发明人发现用0.5-1M HCl酸处理外周血有核细胞对于随后的FISH是最佳的，因为大多数组蛋白可溶于0.1N盐酸中。未对使用高离子强度缓冲液(例如2MNaCl)去除组蛋白进行分析，因为这种类型的组蛋白提取会导致广泛的核聚集和不良的FISH分析。
制造商建议FISH探针结合靶DNA至少需要6-8小时，有些探针需要过夜(16小时)孵育。该方案测试了37℃下8-30小时的杂交时间，以确定在诊断环境中方便的最佳孵育时间范围。随着背景非特异性探针结合的增加和免疫表型染色荧光的减少，优选避免更长的杂交时间。将非离子非变性去污剂(例如Igepal CA-630或化学等效物Nonidet P-40)包括在严格洗涤中会增加随后的探针斑点数。但是，Igepal最好以低浓度(≤0.3％)使用少于10分钟，因为高浓度、长时间的孵育可能会破坏膜蛋白，例如用于免疫表型的细胞表面标志物(Amidzadeh Z,Behbahani AB,Erfani N,et al.Assessment of differentpermeabilization methods of minimizing damage to the adherent cells fordetection of intracellular RNA by flow cytometry.Avicenna J MedBiotechnol.2014；6(1):38-46).NP-40(Tergitol-type NP-40)，因此最好不要使用，因为这种洗涤剂具有很高的亲水亲脂平衡(HLB)，并且会破坏细胞质膜和核膜。除了严格洗涤缓冲液外，杂交条件(例如反应体积、杂交缓冲液中甲酰胺和硫酸右旋糖酐的浓度)以及蛋白质低结合反应管的使用也至关重要。因此，优选按照方案中所述使用管和体积。
商业化的FISH探针是用一系列荧光偶联物或“颜色”生产的，以提供样品中的多种探针分析能力。可以使用多种探针来确定恶性肿瘤亚型的细胞遗传状态，Vysis CLL FISH探针试剂盒(Abbott Molecular)可结合多达三种与SpectrumOrange、SpectrumGreen和SpectrumAqua荧光团偶联的探针，以确定13q、+12或正常基因型CLL组与11q或17p不良预后组的比较。或者，可以将缺失探针(del17p)与染色体计数探针(CEP17)结合使用，以确认染色体上特定位点的缺失，而不是假阳性的“损失”，整个染色体由于加工错误而丢失或探测不足的地方。该方案已被证明可以准确计数SpectrumOrange和SpectrumGreen共轭探针以及双探针样品。
来自商业公司的专有FISH荧光团的可变化学性质是该方案的强项和局限性。传统上，FISH探针具有450-550nm的较短波长高能发射范围，例如Abbott Molecular VysisSpectrumGreen，Agilent OrangeRed和Kreatech SpectrumBright495荧光团。这为示例方法提供了好处，因为在该波长范围内的探针斑点分析应会产生特别清晰的限定斑点，非常适合计数。但是，这也是大多数PBMC内源性和治疗诱导的自发荧光发生的范围。对于具有较高结合荧光团数的大型探针(例如CEP探针)，斑点荧光仍然比背景亮，但是长度小于200kb的探针，例如位点特异性缺失探针具有较低的荧光，可能低于分析软件的检测极限。AMNISISXmkII利用时间延迟来收集荧光测量值，该测量值实质上是收集并累积细胞通过检测摄像头之前发出的所有荧光时发出的所有荧光，从而增强暗淡的信号(Ortyn WE,Hall BE,George TC,Frost K,Basiji DA,Perry DJ,Zimmerman CA,Coder D,MorrisseyPJ.Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.CytometryPart A 2006；69(8):852-62)。但是，仍然存在信号分辨率阈值，低于该阈值可能会导致一些小的基因座特异性探针下降，从而导致斑点检测和计数较差。可以预期，当前正在开发的下一代仪器中硬件的改进将减少此限制的影响。同时，如果较小的探针对于所需的应用是必不可少的，那么可以探索释放探针报告基因扩增试剂盒(例如Affymetrix的QuantiGene或PrimeFlow)以增强DNA探针的兼容性，以增强用小型RNA探针看到的荧光探针信号。
在本发明的说明性实施例中，除非另有说明，否则将SureFISH 17p12PMP22探针与SureFISH杂交缓冲液(SFHB)孵育，该缓冲液是由AgilentTechnologies提供的5-10％氯化钠溶液中的50-75％甲酰胺。根据该示例，探针杂交包括：
a.将细胞加热到73℃至76℃(最好是73℃至74℃)5分钟以使DNA变性并确保特定的探针退火；
b.在自动热循环仪中于37℃杂交16至30小时(最好是16至20小时)；
c.在含0.1％Igepal的2xSSC溶液中洗涤细胞；
d.将细胞转移到Clearview lo-bind微量离心管中(Sigma，Sydney，Australia)；
e.在42℃下，在由0.3％Igepal 2-0.4xSSC(最好是0.3％Igepal 0.4xSSC)组成的严格溶液中洗涤细胞5分钟；
f.用PBS/2％FBS洗涤细胞；以及
g.在室温下，用AADvanced的核DNA染色剂(PBS中0.2μM，Thermo FisherScientific)重悬和染色细胞30分钟。
这些步骤优选地包括已知影响荧光团性能的酸变性以及用于DNA杂交的高温孵育。最初的免疫表型检测板设计包括基于大蛋白的分子别藻蓝蛋白(APC)(目前在大多数免疫荧光实验中使用的最亮的探针之一)及其类似物AF647，该化合物经过化学修饰以增强光稳定性。令人惊讶的是，杂交过程中APC荧光丢失，而AF647荧光显著降低，但仍可将未染色细胞群与阳性细胞区分开，这可能是由于该分子经历了化学修饰所致。发现较新的聚合物染料Brilliant Violet(BV)和Brilliant Blue(BB)在整个研究方案中最稳定，荧光损失很小，但仍比APC和AF647保持明亮的荧光。这一发现与端粒flowFISH分析中BV和BB荧光团在严格条件下的耐热性和维持荧光能力的公开数据保持一致。BV和BB分子，称为p-共轭聚合物(在OLED和光伏中发现)，具有p-轨道的可合成调谐网络，可实现电子离域、大吸收波长范围和有效的荧光。但是，与有机染料分子(例如藻红蛋白或PE)不同，共轭聚合物的主链结构允许在聚合物链中的许多重复单元上发生离域化，导致高分子消光系数、高量子效率并可能导致在FISH期间看到稳定的荧光。这些荧光团还发现在诊断实验室的抗体“鸡尾酒”混合物中稳定存在，可在4℃下长时间保存以及共同培养测定，其中偶联抗体与细胞一起培养3-24小时，然后暴露于潜在的酶促裂解作用。在示例方法中表现良好的另一个荧光团是香豆素染料V500和V500c共轭，在示例方法分析过程中显示出减少但仍保持了荧光强度。这与先前发表的有关V500稳定性的研究保持一致，该研究发现荧光强度随酸度的增加而降低，但在细胞刺激、固定和透化过程中得以维持。尽管V500的量子效率显着低于PE或Brilliant聚合物染料，但它们的较小尺寸导致与免疫表型抗体偶联的分子比PE多50倍，这可以抵消加工过程中某些荧光的损失。细胞表面蛋白质的交联通常用于稳定蛋白质：蛋白质复合物。使用类似的原理，我们分析了BS3，一种不透膜的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯，该酯交联通常在蛋白质朝外表面上发现的伯胺而不会使蛋白质变性。在实验方案开始时进行免疫表型鉴定非常关键，因为已证明在酸变性或杂交后染色会导致高水平的非特异性抗体结合。
成像流式细胞术
在DNA和FISH探针杂交之后，使用成像流式细胞术分析样品。优选地，这涉及：
a.使用Amnis ImageStreamX markII ISXmkII和INSPIRE v4.1采集软件(Amnis，Seattle，USA)，对细胞悬浮液进行成像流式细胞术。
适用于分析的激发激光器可以包括100mW 405nm、50mW 488nm、150mW561nm、150mW592nm和120mW 642nm。
a.使用1.5mW 785nm激光器提供散射信号并测量SpeedBeads以进行内部校准；
b.405nm激光器激发BD Horizon BV480，并捕获430-505nm(Ch02)波长范围内的发射(Ch07)；
c.488nm激光器激发BD Horizon BB515和SpectrumGreen，并捕获480-560nm(Ch02)范围内的发射；
d.488nm激光器激发SYTOX AADvanced DNA染色，并捕获660-740nm(Ch05)范围内的发射光；
e.642nm激光器激发Biolegend AF647，并捕获640-745nm(Ch11)波长范围内的发射；以及
f.561nm或592nm激光器激发Vysis SpectrumOrange共轭12号染色体计数探针和SureFISH del17p PMP-OrangeRed探针，并捕获560-595nm(Ch03)范围内的发射。
使用扩展景深(EDF)成像以60倍物镜捕获所有图像，EDF成像使用专门的光学器件和图像处理技术将对焦范围扩展到4-16微米。
在本发明的说明性形式中，使用成像流式细胞术获取数据，其还包括以下步骤：
a.在长宽比与明场面积(Ch01)的散点图中识别细胞，并记录每个样品大约10,000-20,000个细胞；以及
b.在没有明场和785nm激光照明的情况下，使用相同的激光设置分析单一染色的补偿标准对照(例如，Simply Cellular抗小鼠补偿标准对照，美国印第安纳州Bangs实验室)和SYTOX AADvanced染色的细胞，并使用INSPIREv4.1软件(Amnis)计算补偿矩阵。
理想地，每个对照样品至少记录1,000个补偿颗粒或SYTOX AADvaned染色的细胞。
IDEAS分析
优选地，分析数据的示例步骤包括使用IDEAS v6.0图像分析软件(Amnis)使用补偿后的数据执行Immuno-flowFISH数据分析。分析数据包括：
a.使用梯度RMS特征选择聚焦图像，该特征通过检测图像中像素值的大变化来测量图像的清晰度，使用针对强度水平变化而归一化的像素的平均梯度来计算梯度RMS特征，其中具有更好焦点的细胞具有更高的梯度RMS值；
b.在长宽比与明场面积的散点图中识别单个细胞，长宽比是对象或细胞的短轴除以长轴，并描述对象的圆形或长圆形，其中单个有核细胞的长宽比高且面积值低；
c.通过排除具有高荧光强度的细胞(分裂细胞)，识别SYTOX AADvanced荧光强度直方图中的有核非分裂细胞；
d.基于CD19-BV480(正常和肿瘤性B淋巴细胞)、CD5-BB515(肿瘤性B和正常T淋巴细胞)和CD3-AF647(正常T淋巴细胞)的荧光强度，确定目标门控人群；
e.使用相似特征确定CEP12FISH探针信号(SpectrumOrange荧光)与核染色剂(SYTOX AADvanced荧光)的共定位，此特征可衡量两个图像在被遮盖区域内线性相关的程度，其中细胞核内的FISH探针信号具有较高的相似性评分，而与粘附于细胞膜的破坏细胞DNA杂交的非特异性探针具有较低的相似性评分；
f.使用斑点数特征，使用峰、斑点或强度掩模(表4)对每个细胞的CEP12FISH探针(Ch03)斑点数，其中，斑点数特征算法根据是连接到特定斑点还是背景来检查每个像素的连通性，明亮的峰掩模选项可从图像获得明亮的区域，而不管一个斑点到另一个斑点的强度差异如何，并且斑点对细胞的背景比率是斑点像素值除以明亮细节图像中的平均背景值；
g.进一步定量验证软件通过单参数直方图生成的斑点数，比较每个斑点数群(即1个斑点、2个斑点和3个斑点)的FISH信号的荧光强度，其中测得的荧光强度的变化对应于杂交探针的数量，可以校正二维图像投影中固有的重叠信号(即显示为1个斑点的2个斑点)，从而确定特定FISH斑点的真实数量，并可靠区分单体和二体亚群(Minderman H,HumphreyK,Arcadi JK,et al.Image Cytometry-Based Detection of Aneuploidy byFluorescence In Situ Hybridization in Suspension.Cytometry Part A 2012；81A:776–784)；
h.根据每个细胞的平均斑点数进一步计算斑点数比率，其中将斑点总数标准化为表型亚群大小。斑点数比＝肿瘤细胞平均斑点数/正常细胞平均斑点数。例如，CD19+CD5+CLL/CD3+C5+T细胞：del(17p)<2，12号染色体三体性>2。
表4.验证与斑点数特征一起使用的掩模，以对代表性健康血液样本中的17号染色体(CEP17)FISH探针(Ch02)斑点进行计数。
在其他合适的示例方法中：
a.在上述实验方案中，可用0.1％Tween20固定剂和4％甲醛代替甲醇固定缓冲液(70％甲醇/4％甲醛/5％乙酸)。
b.杂交变化可包括用0.1ug/ml蛋白酶K和备用DMSO、基于甲酰胺或碳酸亚乙酯的杂交缓冲液进行预处理：15％DMSO、35％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖、0.1％Tween20、2xSSC；5％DMSO、45％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖、0.1％Tween20、2xSSC；5％DMSO、10％硫酸葡聚糖、0.1％Tween20、2xSSC；10％DMSO、10％硫酸葡聚糖、0.1％Tween20、2xSSC；15％DMSO、10％硫酸葡聚糖、0.1％Tween20、2xSSC；15％甲酰胺、10％葡聚糖、0.1％Tween20、2xSSC；15％甲酰胺、20％葡聚糖、0.1％Tween20、4xSSC；50％甲酰胺、10％葡聚糖、0.1％Tween20、2xSSC；或15％碳酸亚乙酯、20％葡聚糖、0.1％Tw20、2xSSC。
c.可以使用0.1xSSC中0.3％Igepal的备用杂交后第二严格洗涤缓冲液。
d.为了确定阳性变化是否是由于表位或荧光团的稳定性，一个人可以分析与BDHorizon BB515(BD Biosciences)或AF647(Australian Biosearch)偶联的抗CD3抗体克隆SK7，与BD Horizon BB515(BD Biosciences)或AF647(Australian Biosearch)偶联的抗CD5抗体克隆UCTHC2，和与BD Horizon BV480(BD Biosciences)、BD Horizon BB515(BDBiosciences)或AF647(BD Biosciences)偶联的抗CD19抗体克隆HIB19。
e.备选的DNA标志物可以包括Hoechst 33342(BD Biosciences)和DRAQ7(BioLegend)。
以下结果讨论了示例实验方案的开发测试和性能。特别是，该实验方案是使用1号染色体计数探针(CEP1)执行的，该探针与位于健康供体外周血有核细胞上的着丝粒附近高度重复的人类卫星DNA序列杂交。
结果用于进一步说明本发明，而不应理解为限制性的。
示例性结果
在实验方案中测试的第一种固定剂是70％甲醇/4％甲醛/5％乙酸的甲醇基缓冲剂，这是用于传统FISH和FISH-IS的Carnoy固定剂(例如，在Minderman H,Humphrey K,Arcadi JK,et al.Image Cytometry-Based Detection of Aneuploidy by FluorescenceIn Situ Hybridization in Suspension.Cytometry Part A 2012；81A:776–784中描述的)与用于immuno-S-FISH方案的4％甲醛固定剂(例如，在K.Fuller,S.Bennett,H.Hui,A.Chakera and W.Erber.Development of a robust immuno-S-FISH protocol usingimaging flow cytometry.Cytometry Part
A.2016；89A:720-730中描述的)的组合。
用CD3-BB515免疫表型(图6)和1或12号染色体计数探针(CEP1或CEP12)进行实验，在健康的供体有核细胞上，它与位于染色体着丝点附近的高度重复的人类卫星DNA序列杂交。预计FISH会导致每个细胞1-2个探针斑点。
按照制造商(Abbott Molecular)的推荐，用80℃或73℃的DNA变性温度测试甲醇固定缓冲液，导致分别在53％和59％的细胞中观察到1-2个CEP1FISH探针斑点数(表5)。在80℃时观察到更高水平的DNA降解，这是由具有3个或更多探针斑点的细胞数量增加以及细胞形态的目视检查所确定的(明场通道，数据未显示)。与immuno-S-FISH方案类似，将变性温度降低至66℃，仅在50％的细胞中产生了核Hoechst染色，在2％的细胞中产生了FISH探针斑点。
表5.开发和优化基于Carnoy的FISH方案，用于着丝粒FISH探针immuno-flowFISH分析。
缩写：AA-乙酸、CEP染色体计数探针、DS-葡聚糖硫酸盐、DMSO二甲基亚砜、EC碳酸亚乙酯、FA甲醛、FM甲酰胺、HCl盐酸、MeOH甲醇、PK蛋白酶K、SSC柠檬酸、SOSpectrumOrange、VCEP Vysis染色体计数探针杂交缓冲液
*4℃下10分钟**室温下20分钟***37℃下10分钟****在37℃下进行5分钟的热变性和16-24小时的杂交MFI计算未验证的1或2个斑点数
AA乙酸、CEP染色体计数探针、DMSO二甲基亚砜、FA甲醛、HCl盐酸、M摩尔、MeOH甲醇、SO SpectrumOrange、SSC标准柠檬酸钠缓冲液、Tw20 Tween20、VCEP Abbott Molecular提供的带有CEP探针的Vysis CEP杂交缓冲液
提供了Vysis CEP1和CEP12探针，并预先用Vysis CEP(VCEP)杂交缓冲液进行了分析。为了提高杂交效率(具有1-2个探针斑点的细胞)并减少具有零斑点的细胞数(DNA变性不足)，测试了多种杂交缓冲液的变化。首先将15％DMSO添加到杂交缓冲液中，并将甲酰胺浓度降至35％，从而当DNA在73℃变性时，在58％的细胞中的每个细胞具有1-2个斑点的CEP1探针计数，而当DNA在66℃变性时，48％的细胞中的每个细胞具有1-2个斑点的CEP1探针计数(表5)。与VCEP缓冲液相比，在两个温度下杂交均得到改善，DNA降解更少。将DNA变性温度降低到73℃，将DMSO浓度降低到5％，将甲酰胺增加到45％，在60％的细胞中产生1-2个探针斑点，但是DNA降解也增加到29％的细胞。还使用杂交缓冲液(X％DMSO、10％葡聚糖、0.1％Tw20、2xSSC)中仅DMSO(无甲酰胺)在73℃和66℃的DNA变性温度下测试了杂交效率。含有5％DMSO的杂交缓冲液在73℃下在24％的细胞中产生1-2个CEP1斑点，在66℃下在28％的细胞中产生1-2个CEP1斑点，含有10％DMSO的杂交缓冲液在66℃下在26％的细胞中产生1-2个CEP1斑点，或者含有15％DMSO的杂交缓冲液在73℃下在26％的细胞中产生1-2个CEP1斑点，以及在15％DMSO的杂交缓冲液在66℃下在20.3％的细胞中产生1-2个CEP1斑点。仅将DMSO加到缓冲液中不能充分改善杂交。FISH探针斑点数在变性温度为73℃时始终较高，因此该DNA温度可用于随后的染色体计数探针(CEP)实验。对右旋糖酐浓度对杂交的影响进行分析后发现，标准浓度为10％的右旋糖酐硫酸盐浓度降低的甲酰胺(15％)不能使DNA充分变性，从而仅在2％的细胞中产生探针斑点。将硫酸右旋糖酐的浓度增加到20％和4xSSC，仅在24％的细胞中产生1-2个CEP1探针斑点。在与内部50％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸盐、0.1％Tween20的2xSSC杂交缓冲液杂交之前，在室温下加入1M盐酸(HCl)孵育5分钟将带有1-2个CEP1探针斑点的细胞数量增加到94％。在1M HCl变性并与内部50％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸盐、0.1％Tween20在2xSSC杂交缓冲液中杂交之前，在37℃下进行5分钟的蛋白酶K(0.1μg/ml)预消化步骤将1-2个CEP1探针斑点轻微减少至83％的细胞(表5)，然而，样品中有大量的细胞损失(数据未显示)。杂交缓冲液的最终调整是加入碳酸亚乙酯，以前发现它可以显著减少玻片上FISH的杂交时间。样品用1M HCl变性，然后与CEP1FISH探针在碳酸亚乙酯基缓冲液中于73℃共变性5分钟，然后在37℃下杂交3或24小时。3小时后，在47％的细胞中可见1-2个探针斑点，在24小时时增加到54％的细胞。与2xSSC杂交缓冲液中的内部50％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸盐、0.1％Tween20相比，基于碳酸亚乙酯的缓冲液未改善杂交效果，因此未在进一步的实验中使用。
基于在immuno-S-FISH方案中使用的单独的固定和透化缓冲液，用0.1％Tween20缓冲液中的4％甲醛测试了方案(K.Fuller,S.Bennett,H.Hui,A.Chakera andW.Erber.Development of a robust immuno-S-FISH protocol using imaging flowcytometry.Cytometry Part A.2016；89A:720-730)。4％甲醛/0.1％Tween20缓冲液使细胞通透性良好，细胞核bright DRAQ7染色证明了这一点(数据未显示)，而没有损害细胞膜，不会导致后续加工过程中的细胞损失(图7)。需要用4％甲醛/0.1％Tween20缓冲液与1M盐酸一起孵育20分钟，以使DNA充分变性以进行FISH，从而在82％的细胞中产生1-2个CEP1探针斑点，并减少DNA降解(表6)。根据制造商的建议，将变性温度降低到约73℃到66℃(类似于immuno-S-FISH方案)，导致探针杂交丢失，表明仅用1M HCl处理不足以使DNA充分变性以进行FISH分析。将甲醛固定和Tween20透化作为单独的步骤和组合的步骤进行测试，以确定对杂交效率的影响。将样品与4％甲醛孵育5分钟，然后与0.1％Tween20孵育10分钟，结果表明87％的细胞中有1-2个CEP1探针斑点，将4％甲醛与0.1％Tween20溶液混合并孵育10分钟，结果表明90％的细胞中有1-2个探针斑点(表6)。没有Tween20透化的4％甲醛固定将含有1-2个探针斑点的细胞减少到82％。混合的4％甲醛和0.1％Tween20缓冲液被认为是“第一步”固定/透化的最佳选择，可用于后续实验。
表6.immuno-flowFISH方案开发过程中甲醛固定和Tween 20通透性的变化。
*1斑点数未通过MFI调整为1或2个斑点
CEP染色体计数探针、FA甲醛、HCl盐酸、M摩尔、SG SpectrumGreen、SOSpectrumOrange、Tw20 Tween20、VCEP Abbott Molecular提供的带有CEP探针的Vysis CEP杂交缓冲液
由于1M HCl孵育的添加增加了DNA变性，并且随后在方案中还测试了不同浓度的HCl的FISH斑点数。将浓度增加到2M或4M会导致带有1-2个CEP1探针斑点的细胞分别减少到67％和3％。此外，样品中的细胞总数减少了(数据未显示)，有0-1或3+个斑点的细胞数增加了，表明样品中裂解/损坏的细胞的DNA降解程度和无细胞DNA含量更高(表6)。与1M溶液(82％)相比，将HCL酸浓度降低到0.5M确实会显著影响1-2个探针斑点数(79％)，但是样品中的总体细胞损失减少了(数据未显示)。0.5M HCl酸变性被认为最适合固定，可用于后续实验。
商业FISH探针是用一系列荧光偶联物产生的。将供体和CLL患者细胞分成两等份，并与偶联了SpectrumOrange(SO)或SpectrumGreen(SG)的Vysis CEP12探针杂交，以确认每个配对样品集中的斑点数相当(图8，表6)。此外，用CEP1-SO和CEP12-SG探针对细胞进行双探针检测，以确认该实验方案可用于多探针分析(图9)。
除了计数外，FISH探针通常被设计用于检测重要基因的丢失，例如在17号染色体的短臂上发现的肿瘤抑制基因p53。这些基因座特异性探针通常比着丝粒探针小，因为存在较少的荧光偶联物，导致“较暗淡”信号。用SureFISH(SF)del17p PMP基因座特异性(458kb)探针分析CLL样品，以确认使用较小的FISH探针进行准确计数(表7)。在健康对照样品中，用针对CEP探针优化的方案制备的SF del17p探针在73℃下变性，有59％的细胞显示具有1-2个探针斑点，但是24％的细胞没有探针斑点，这可能是由于杂交效率低下(变性温度不正确)或探针信号暗淡所致。将变性温度提高到74℃、76℃或78℃可以将没有探针斑点的细胞数量减少到不足2％，但将具有3个或更多斑点的细胞数量增加到63-66％。74℃的变性温度用于随后的实验。在0.1xSSC缓冲液中将第二次杂交后洗涤的严格度提高到0.3％Igepal，将具有3个或更多斑点的细胞数量降低到40％(表7)。带有1-2个探针斑点的细胞数量仍然仅为49％，因此杂交时间增加到30小时，这会稍微增加具有1-2个探针斑点的细胞数至56％，并将具有零斑点的细胞数减少至12％，将具有3个或更多斑点的细胞数减少至32％(图10)。尽管不如CEP探针有效，但使用SF del17p探针确诊17p缺失的患者进行计数分析能够确定B CLL细胞与正常T细胞群之间的差异(图10，表6)。对杂交和严格性缓冲液的进一步调整可能会减少带有3个或更多探针斑点的细胞数量，然而，对具有零个或单个探针斑点的细胞进行的目视分析发现，由于探针信号暗淡，计数软件不够强大，不足以准确地解析这些探针(数据未显示)。
表7.用于SureFISH缺失17p PMP FISH探针分析的immuno-flowFISH方案中杂交温度和严格性缓冲液的变化。
*1斑点数未通过MFI调整为1或2个斑点
FA甲醛、HCl盐酸、Igepal Igepal CA-630、M摩尔、Tw20Tween20、SFHB AgilentTechnologies提供的带有17p缺失探针的SureFISH杂交缓冲液、SSC标准柠檬酸钠缓冲液
不管杂交后的严格性和SYTOX AADvanced的共定位，斑点计数特征仍然报告“斑点”计数为1的细胞比例(15-20％)(图11)。根据Minderman等人的方法对1斑点群的荧光强度进行分析，发现对于CEP1和CEP12探针，一斑点数的MFI与两斑点群相同，表示这两个斑点是重叠的，因为真正的单斑点的MFI将是双斑点的MFI的一半(图12)。根据SYTOX AADvanced的共定位标准(图11)和1点荧光强度分析排除具有3个以上斑点的细胞，以确定具有重叠探针斑点的细胞数导致健康供体细胞中>95％的细胞中调整了2斑点数。
为了确定酸变性和高温(73℃)对免疫表型荧光团的影响，按照优化方案处理健康供体和CLL患者的有核细胞样品，并在细胞抗体染色、固定和透化、酸变性和杂交后，取出等分试样用于AMNIS ISXmkII分析。这些包括与一系列荧光团偶联的CD3(克隆：SK7)、CD4(克隆SK3)、CD5(克隆：UCHTC2)和CD19(克隆：HIB19)(表8)。
表8.immuno-flowFISH方案中的荧光团性能分析。荧光团与抗人CD3、CD4、CD5或CD19抗体偶联，并用有核血细胞分析。取出并分析等分试样以确定在以下条件后BS3交联保留的荧光(是)或荧光损失(否)：用4％甲醛固定并用0.1％Tween20透化；用0.5M HCl进行酸性DNA变性；FISH(杂交)包括在73℃进行探针/细胞DNA热变性，然后在37℃杂交16-24小时。
*荧光强度降低，但是仍可以从未染色的细胞群中区分出阳性细胞。^CD3克隆SK7、CD4克隆SK3、CD5克隆UCTHC2、CD19克隆HIB19和SJ25C。缩写：AF Alexa Fluor、APC藻蓝蛋白、BB艳蓝、BV艳紫、FITC异硫氰酸荧光素、PE藻红蛋白荧光团。
对于BB515、BB700、BV421、BV480、BV510、V500c、AF647和AF700，抗体结合得以保留，但是，在37℃过夜杂交后，荧光团的荧光强度降低(图13)。与PE、APC或它们的串联偶联物偶联的抗体在加工过程中丢失了荧光(图14)。荧光团的荧光强度，由“亮度”和阳性染色与阴性染色群的分辨率决定，通过与双(磺基琥珀酰亚胺基)硫酸氢盐(BS3)交联来保持，该双酚是不可裂解的，不可透过膜的水溶性胺交联剂(图15)。对两个免疫表型检测板进行了分析，以为其他血液系统恶性肿瘤的检测板设计和随后的探针选择提供灵活性。用两个检测板分析了正常血细胞和CLL细胞，发现CD3、CD5和CD19群体的染色情况具有可比性(图16)。
示例2：与早期的现有技术相比，Immuno-flowFISH
表9所示的以下示例将Immuno-flow-FISH技术与Immuno-S-FISH技术进行了比较。表10提供了分析外周血单核细胞(PBMC)制剂的广泛工作范围，以及该方法的高度优选的最佳条件。