阅读说明：本技术 基于非天然核酸纳米镊子的特异性检测技术在活细胞mRNA检测中的检测方法及其应用 (Detection method of specificity detection technology based on non-natural nucleic acid nano tweezers in living cell mRNA detection and application thereof ) 是由 李喆 彭劲 于涵洋 于 2019-10-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了基于非天然核酸纳米镊子的特异性检测技术在活细胞mRNA检测中的检测方法及其应用。首先非天然核酸单链通过碱基互补配对形成打开的纳米镊子结构,其中一条单链的5’与3’端分别标记荧光基团。然后利用非天然核酸稳定性高的特点,在细胞内使用纳米镊子检测mRNA分子；当存在目标mRNA分子时,纳米镊子的单链部分将与之进行互补配对,从而关闭纳米镊子,使荧光基团之间发生能量共振转移,通过光学信号的变化达到检测效果。最后加入燃料单链使纳米镊子恢复打开状态,使之可以进行下一轮检测。本发明高灵敏度的细胞无损检测。基于荧光共振能量转移的纳米镊子,具有极高的检测灵敏度,检测速度快,且具有良好的生物相容性,可直接进入细胞进行无损检测。(The invention discloses a detection method and application of a specificity detection technology based on non-natural nucleic acid nano tweezers in living cell mRNA detection. Firstly, an unnatural nucleic acid single strand forms an open nano-tweezers structure through base complementary pairing, wherein the 5 'end and the 3' end of one single strand are respectively marked with a fluorescent group. Then, the characteristic of high stability of the non-natural nucleic acid is utilized, and the mRNA molecules are detected in the cells by using nano tweezers; when the target mRNA molecule exists, the single-chain part of the nano-tweezers is subjected to complementary pairing with the target mRNA molecule, so that the nano-tweezers are closed, energy resonance transfer is generated between fluorescent groups, and the detection effect is achieved through the change of optical signals. Finally, adding a fuel single chain to restore the opening state of the nano-tweezers, so that the nano-tweezers can be subjected to the next round of detection. The invention relates to a cell nondestructive test with high sensitivity. The nanometer tweezers based on fluorescence resonance energy transfer have extremely high detection sensitivity, high detection speed and good biocompatibility, and can directly enter cells for nondestructive detection.)

基于非天然核酸纳米镊子的特异性检测技术在活细胞mRNA检 测中的检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及检测分析及生物学技术领域，具体涉及基于非天然核酸纳米镊子的特异性检测技术在活细胞mRNA检测中的检测方法及其应用。

背景技术

mRNA是生物体内的重要生物大分子之一，它在细胞内的表达水平、稳定性、时间空间分布与其功能紧密相关。对mRNA表达变化的实时检测，将极大的促进疾病诊断与监测水平的提高，因而引发越来越广泛的研究兴趣。

目前，科研人员主要通过提取、纯化细胞裂解液中的mRNA，再通过聚合酶链式反应等方法在细胞水平对mRNA的表达进行定量分析。这些方法由于需要对细胞进行破坏，因而无法全面获取活细胞生命活动的相关信息。近年来，分子信标被广泛应用于活细胞内mRNA的检测。它易于构建和表征，不需要破坏细胞或重组基因来检测细胞中的mRNA表达。然而分子信标很容易被体内的酶或其他成分降解，导致荧光染料与猝灭分子之间的距离增大，从而产生错误信号，且无法动态可逆的实时检测mRNA。

在DNA纳米技术领域，人工设计并合成的DNA单链被用来组装形成各种二维及三维结构。DNA纳米结构具有复杂精细的可编程图案，以及很好的位点可寻址性，在药物传递、分子计算、纳米光学器件等领域具有广泛的应用价值。在利用DNA纳米结构进行生物分子检测方面，研究者们主要：1、在体外利用AFM探针对DNA纳米结构与生物分子的结合实现直接可视；2、在细胞内利用荧光DNA探针进行荧光成像。相比分子信标，DNA纳米结构具备更强的抗酶切保护性能；然而由于其结构由天然核酸构建形成，所以仍然易被体内成分降解。

与天然核酸相比，非天然核酸具有类似的碱基互补配对能力，因而具备对目标核酸链的特异性识别功能；同时，非天然核酸具有更好的抗酶切、耐酸、耐热等特性，因而在细胞内具有更高的稳定性。将非天然核酸与纳米结构相结合，将可以解决天然核酸在细胞内易降解等问题，从而实现在活细胞内长期动态监测mRNA的目的。

目前，缺乏一种具有较高的灵敏度的基于非天然核酸纳米镊子的特异性检测技术在活细胞mRNA检测中的检测方法及其应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有较高的灵敏度的基于非天然核酸纳米镊子的特异性检测技术在活细胞mRNA检测中的检测方法及其应用。

本发明的技术方案如下：本发明的一种基于非天然核酸纳米镊子的特异性检测技术在活细胞mRNA检测中的检测方法，包括如下步骤：

(1)设计并合成非天然核酸纳米镊子；

(2)使用纳米镊子对活细胞内目标mRNA进行检测；

(3)进行荧光光谱分析。

进一步地，在步骤(1)中，所述的不同非天然核酸纳米镊子的构建，设计三条非天然核酸单链：中心链的两端采用两种可发生能量共振转移的荧光基团进行标记，另外两条单链分别延伸出几个碱基序列，用于与目标的mRNA进行碱基互补配对；可以针对不同的检测环境要求，改变非天然核酸的化学种类来实现。

进一步地，在步骤(1)中，Step1：将两条甲氧基修饰的非天然核酸单链,以及一条荧光基团修饰的单链分别以1：1：1的摩尔比混合，加入10L10×TAE-Mg²⁺缓冲液(Mg²⁺浓度12.5mol/L)，补超纯水至最终体积100L，震荡均匀；

Step2：将混合溶液置于PCR仪中，以0.1℃/10s的速率从95℃～20℃退火，组装成1M的甲氧基修饰的纳米镊子结构，4℃放置待用。

进一步地，在步骤(2)中，所述的对目标mRNA进行检测，当体系中存在目标mRNA时，纳米镊子由原来的打开状态变成关闭状态；当体系中不存在完全互补配对的mRNA分子时，纳米镊子结构将不会发生变化，从而保证检测的高特异性。

进一步地，在步骤(2)中，Step1：将在96孔板中培养的活细胞用PBS缓冲液清洗三次，然后加入20L组装形成的甲氧基修饰的纳米镊子以及180L的培养液(10％FBS+89％DMEN+1％P/S)，在37℃、5％CO₂的条件下共孵育3小时，使其进入细胞并与目标mRNA结合。

Step2：在此体系内以纳米镊子：燃料链为1：1的摩尔比加入燃料链，在37℃、5％CO₂的条件下共孵育3小时，使其进入细胞并与目标mRNA结合，将目标mRNA从纳米镊子上置换下来，使纳米镊子回到初始打开状态，用于下一轮检测。

进一步地，在步骤(3)中，所述的荧光光谱分析，当纳米镊子由原来的打开状态变成关闭状态，所携带的两种荧光基团相互靠近，荧光能量共振转移增加，通过这一光学信号的变化来达到检测的目的。

进一步地，在步骤(3)中，将甲氧基修饰的纳米镊子，纳米镊子与活细胞共孵育后的产物，以及加入燃料单链孵育后的产物，置于酶标仪下进行检测，设置激发波长为513nm，并用活细胞加培养液作为调零组，重复三次实验，取平均值；当细胞中存在目标mRNA时，该体系将可观察到荧光共振转移现象，加入燃料链后，荧光共振转移现象消失，证明纳米镊子可回复初始打开状态。

本发明所述的甲氧基修饰的非天然核酸纳米镊子在监测糖尿病中的应用。

本发明所述的基于非天然核酸纳米镊子的特异性检测技术及其在活细胞mRNA检测方面的应用。

进一步地，能够根据需要，实时动态监测不同的目标mRNA的变化；还能通过在组装的非天然核酸单链上进行化学修饰，使其具有特定的性能，适应细胞内检测；其检测步骤如下：

(1)将非天然核酸纳米镊子与待检测细胞共培养，前者将进入细胞内与目标mRNA结合；

(2)非天然纳米镊子与目标mRNA的结合将前者从打开状态变为关闭状态，引发荧光能量共振转移；

(3)在荧光检测平台观察细胞反应前后的荧光变化。

有益效果：本发明高灵敏度的细胞无损检测。基于荧光共振能量转移的纳米镊子，具有极高的检测灵敏度，检测速度快，且具有良好的生物相容性，可直接进入细胞进行无损检测。本发明基于非天然核酸纳米镊子的方法实现了对活细胞内目标mRNA的动态监控，这一技术具有如下优点：

(1)可检测多种目标mRNA序列。我们可以通过改变非天然核酸单链的碱基序列，从而构建各种不同序列的纳米镊子，来实现对多种目标mRNA的检测。其他的纳米镊子容易在体内被水解而产生错误信号，同时无法重复使用。

(2)高稳定性。由于非天然核酸在抗酶切、耐酸、耐热等方面具有优势，从而解决了核酸纳米镊子在细胞内易降解等问题。

(3)可重复检测。当一轮检测完成后，将燃料单链加入体系中，使之与目标mRNA发生置换反应，将其从纳米镊子上取代下来，从而使纳米镊子由关闭状态又回到打开状态，以待进行下一次检测。

(4)这一方法为疾病的动态监控提供了一种有效的途径，本发明的方法不针对于某种特定的目标mRNA，可以根据需求设计出多种非天然核酸纳米结构来检测不同的目标mRNA，未来的发展目标是同时对同一细胞中的多种mRNA进行动态监测。

(5)首先非天然核酸单链通过碱基互补配对形成打开的纳米镊子结构，其中一条单链的5’与3’端分别标记荧光基团。然后利用非天然核酸稳定性高的特点，在细胞内使用纳米镊子检测mRNA分子；当存在目标mRNA分子时，纳米镊子的单链部分将与之进行互补配对，从而关闭纳米镊子，使荧光基团之间发生能量共振转移，通过光学信号的变化达到检测效果。最后加入燃料单链使纳米镊子恢复打开状态，使之可以进行下一轮检测。实施本方法可以有效地检测多种目标mRNA，可以在细胞水平实时监测基因的表达水平。非天然核酸的高稳定性，成功解决了天然核酸在细胞内易降解的问题。此方法可用于糖尿病、癌症等疾病监测相关研究领域。

附图说明

下面将结合附图进一步说明，附图中：

图1为本发明的非天然核酸纳米镊子结构设计图；

图2为本发明的非天然核酸纳米镊子用于检测目标mRNA的可逆反应示意图；

图3为本发明的甲氧基修饰的纳米镊子检测细胞中葡萄糖转运蛋白GLUT-4示意图(存在/不存在目标mRNA分别对应的光谱图)。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。

本发明的一种基于非天然核酸纳米镊子的特异性检测技术在活细胞mRNA检测中的检测方法，包括如下步骤：

(1)设计并合成非天然核酸纳米镊子；

(2)使用纳米镊子对活细胞内目标mRNA进行检测；

(3)进行荧光光谱分析。

在步骤(1)中，所述的不同非天然核酸纳米镊子的构建，设计三条非天然核酸单链：中心链的两端采用两种可发生能量共振转移的荧光基团进行标记，另外两条单链分别延伸出几个碱基序列，用于与目标的mRNA进行碱基互补配对；可以针对不同的检测环境要求，改变非天然核酸的化学种类来实现。

Step1：将两条甲氧基修饰的非天然核酸单链,以及一条荧光基团修饰的单链分别以1：1：1的摩尔比混合，加入10L 10×TAE-Mg²⁺缓冲液(Mg²⁺浓度12.5mol/L)，补超纯水至最终体积100L，震荡均匀；

Step2：将混合溶液置于PCR仪中，以0.1℃/10s的速率从95℃～20℃退火，组装成1M的甲氧基修饰的纳米镊子结构，4℃放置待用。

在步骤(2)中，所述的对目标mRNA进行检测，当体系中存在目标mRNA时，纳米镊子由原来的打开状态变成关闭状态；当体系中不存在完全互补配对的mRNA分子时，纳米镊子结构将不会发生变化，从而保证检测的高特异性。

Step1：将在96孔板中培养的活细胞用PBS缓冲液清洗三次，然后加入20L组装形成的甲氧基修饰的纳米镊子以及180L的培养液(10％FBS+89％DMEN+1％P/S)，在37℃、5％CO₂的条件下共孵育3小时，使其进入细胞并与目标mRNA结合。

Step2：在此体系内以纳米镊子：燃料链为1：1的摩尔比加入燃料链，在37℃、5％CO₂的条件下共孵育3小时，使其进入细胞并与目标mRNA结合，将目标mRNA从纳米镊子上置换下来，使纳米镊子回到初始打开状态，用于下一轮检测。

在步骤(3)中，所述的荧光光谱分析，当纳米镊子由原来的打开状态变成关闭状态，所携带的两种荧光基团相互靠近，荧光能量共振转移增加，通过这一光学信号的变化来达到检测的目的。

将甲氧基修饰的纳米镊子，纳米镊子与活细胞共孵育后的产物，以及加入燃料单链孵育后的产物，置于酶标仪下进行检测，设置激发波长为513nm，并用活细胞加培养液作为调零组，重复三次实验，取平均值；当细胞中存在目标mRNA时，该体系将可观察到荧光共振转移现象，加入燃料链后，荧光共振转移现象消失，证明纳米镊子可回复初始打开状态。

实施例1

关于本发明中设计并合成非天然核酸纳米镊子，其具体操作为：

(1)如图1所示，将两条甲氧基修饰的非天然核酸单链,以及一条荧光基团修饰的单链分别以1：1：1的摩尔比混合，加入10L 10×TAE-Mg²⁺缓冲液(Mg²⁺浓度12.5mol/L)，补超纯水至最终体积100L，震荡均匀。

(2)将步骤(1)中的混合溶液置于PCR仪中，以0.1℃/10s的速率从95℃～20℃退火，组装成1M的甲氧基修饰的纳米镊子结构，4℃放置待用。

实施例2

关于使用纳米镊子对目标mRNA进行检测，其具体操作为：

(1)如图2所示，将在96孔板中培养的活细胞用PBS缓冲液清洗三次，然后加入20L组装形成的甲氧基修饰的纳米镊子以及180L的培养液(10％FBS+89％DMEN+1％P/S)，在37℃、5％CO2的条件下共孵育3小时，使其进入细胞并与目标mRNA结合。

(2)在此体系内以纳米镊子：燃料链＝1：1的摩尔比加入燃料链，在37℃、5％CO₂的条件下共孵育3小时，使其进入细胞并与目标mRNA结合，将目标mRNA从纳米镊子上置换下来，使纳米镊子回到初始打开状态，用于下一轮检测。

实施例3

关于荧光光谱分析，其具体操作为：

将甲氧基修饰的纳米镊子，纳米镊子与活细胞共孵育后的产物，以及加入燃料单链孵育后的产物，置于酶标仪下进行检测，设置激发波长为513nm，并用活细胞加培养液作为调零组。重复三次实验，取平均值。如图3所示，当细胞中存在目标mRNA时，该体系将可观察到荧光共振转移现象。加入燃料链后，荧光共振转移现象消失，证明纳米镊子可回复初始打开状态。

实施例4

关于本发明中的甲氧基修饰的非天然核酸纳米镊子在监测糖尿病实际样本中的应用，其具体操作为：

(1)设计并合成非天然核酸纳米镊子：葡萄糖转运蛋白GLUT-4是胰岛素敏感的葡萄糖转运载体，它的表达失常是引起胰岛素抵抗的重要因素。因而我们可以通过检测细胞内GLUT-4mRNA来实时监测糖尿病。根据需要检测的葡萄糖转运蛋白GLUT-4mRNA序列，采用Timat软件设计相对应的纳米镊子结构并输出对应单链的碱基序列；通过化学合成的方法合成相应的非天然核酸单链，然后再将对应单链以1：1：1的摩尔比混合，加入10L 10×TAE-Mg2+缓冲液(Mg2+浓度12.5mol/L)，补超纯水至最终体积100L，震荡均匀。然后将其置于PCR仪中，以0.1℃/10s的速率从95℃～20℃退火，组装成1M的甲氧基修饰的纳米镊子结构，4℃放置待用。

(2)使用纳米镊子对葡萄糖转运蛋白GLUT-4mRNA进行检测；将步骤(1)得到的非天然核酸纳米镊子加入细胞中，在37℃、5％CO2中共孵育3小时，使其进入细胞并与GLUT-4mRNA结合。然后在此体系内加入燃料链，同样条件下孵育3小时，将GLUT-4mRNA从纳米镊子上置换下来，使纳米镊子回到初始打开状态，用于下一轮检测。

(3)合成产物以及其可逆反应的荧光光谱表征：将步骤(2)与细胞共孵育后得到的产物，以及加入燃料单链孵育后的产物，置于酶标仪下进行检测，观察是否发生荧光能量共振转移现象。

首先非天然核酸单链通过碱基互补配对形成打开的纳米镊子结构，其中一条单链的5’与3’端分别标记荧光基团。然后利用非天然核酸稳定性高的特点，在细胞内使用纳米镊子检测mRNA分子；当存在目标mRNA分子时，纳米镊子的单链部分将与之进行互补配对，从而关闭纳米镊子，使荧光基团之间发生能量共振转移，通过光学信号的变化达到检测效果。最后加入燃料单链使纳米镊子恢复打开状态，使之可以进行下一轮检测。实施本方法可以有效地检测多种目标mRNA，可以在细胞水平实时监测基因的表达水平。非天然核酸的高稳定性，成功解决了天然核酸在细胞内易降解的问题。此方法可用于糖尿病、癌症等疾病监测相关研究领域。

本发明所提供的手段，可根据需求，通过改变组装的非天然核酸的单链的碱基序列来构建不同序列的纳米镊子，用于对不同的目标mRNA的检测，实现对于多种疾病的实时监控。除了采用甲氧基修饰非天然核酸单链以此来提高纳米镊子的抗血清、抗DNase I酶切以及耐热性以外，还可根据不同需求采用不同的基团对组装的非天然核酸单链进行修饰。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。