阅读说明：本技术 中性钠离子盐在制备柑橘酸腐病菌抑菌剂中的应用 (Application of neutral sodium ion salt in preparation of bacteriostatic agent for citrus acid rot fungi ) 是由 龙超安 赵娟 张德遥 杨凡 田中欢 于 2020-03-16 设计创作，主要内容包括：本发明属于水果采后贮藏保鲜剂领域,公开了中性钠离子盐在制备柑橘酸腐病菌抑菌剂中的应用。本发明通过离体实验和果实活体实验证实了中性钠离子盐能有效地抑制柑橘酸腐病菌,并阐明了其在柑橘采后处理中的应用前景。同时,中性钠离子盐如氯化钠是一种无毒的化学试剂,价格便宜,用量少,因此,可确定其安全性。这是国内外首次将中性钠离子盐作为一种防腐保鲜剂应用于柑橘果实采后处理中。(The invention belongs to the field of fruit postharvest storage preservatives, and discloses application of a neutral sodium ion salt in preparation of a citrus acid rot pathogen bacteriostatic agent. The in vitro experiment and the fruit in vivo experiment prove that the neutral sodium ion salt can effectively inhibit citrus acidovorax and clarify the application prospect of the neutral sodium ion salt in the postharvest treatment of citrus. Meanwhile, neutral sodium ion salts such as sodium chloride are nontoxic chemical reagents, are low in price and low in dosage, and therefore, the safety of the neutral sodium ion salts can be determined. The method is to apply the neutral sodium ion salt as an antiseptic preservative to the postharvest treatment of the citrus fruits for the first time at home and abroad.)

中性钠离子盐在制备柑橘酸腐病菌抑菌剂中的应用

技术领域

本发明属于水果采后贮藏保鲜剂领域，具体涉及中性钠离子盐在制备柑橘酸腐病菌抑菌剂中的应用。

背景技术

柑橘在我国栽培历史悠久，因为其本身具有较高的加工与商业应用价值，2007年，我国已成为全球柑橘第一生产大国(张玉婷等2009)；我国种植柑橘的面积约259万公顷，年产量约达3817万吨(沈兆敏2019)。我国柑橘产业中以鲜销为主的柑橘果实在总产量中的比例达到95％，但我国柑橘产业采后贮藏加工技术环节相对薄弱从而导致贮藏保鲜期间的腐烂现象较为普遍(熊魏2015)，其中，青霉病、绿霉病、酸腐病和蒂腐病是最主要柑橘釆后真菌病害。抑霉唑、嘧霉胺、咪鲜胺和咯菌腈等化学杀菌剂是抑制柑橘采后病害的主要手段，但是目前在已注册的化学药剂中，双胍盐是唯一对酸腐病有较好抑制作用的化学药剂。

柑橘酸腐病一般发生于贮藏期的果实，病原菌主要通过贮藏过程中的机械伤口侵入，并分泌多种水解酶破坏果实表皮完整性。受到侵害的果实，霉菌通常呈圆形以病斑为中心逐渐向外扩散生长，随着发病时间延长，发病部位表面会形成一层白霜状霉层，以致全果腐烂，出水，并伴有酸臭味(窦诗雯2018)。据统计，近年来柑橘酸腐病发病率在美国加州已有上升的趋势(Changlin Xiao 2018)，又因化学试剂对人类健康、生态环境的不利影响，寻找目标特异性和环境友好型的防治措施迫在眉睫。有文献报道薄荷精油对柑橘酸腐菌体外熏蒸有一定的抑制作用(江国山2017)，拮抗菌枯草芽孢杆菌也能抑制柑橘酸腐菌的生长(李登勇2019)，一些化学物质如盐酸聚六亚甲基胍，碳酸氢钠和水杨酸钠可以抑制沙糖桔中酸腐菌发病(吴日章2015)。在离子研究中，中性钠离子盐对柑橘酸腐菌的抑制效果未见相关报道。

发明内容

本发明目的是在于提供了中性钠离子盐在制备柑橘酸腐病菌抑制剂中的应用。

本发明的另一个目的在于提供了中性钠离子盐在制备防治柑橘采后酸腐病药剂中的应用。

本发明的最后一个目的在于提供了中性钠离子盐在制备抑制酸腐病病菌和水果保鲜的药剂中的应用，利用含有钠离子的中性盐处理柑橘，可实现采后果实贮藏中抑制酸腐菌，并具备保鲜作用，该药剂用量少，安全，效果明显。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

中性钠离子盐在制备柑橘酸腐病菌抑制剂中的应用，以中性钠离子盐为主效成分或是主效成分之一制备成柑橘酸腐病菌抑制剂，都属于本发明的保护范围。

中性钠离子盐在制备防治柑橘采后酸腐病药剂中的应用，利用含有钠离子的中性盐处理柑橘，可实现采后果实贮藏中抑制酸腐菌，并具备保鲜作用。

以上所述的应用中，优选的，在处理柑橘时，钠离子的浓度≧0.1M，更优选的为钠离子的浓度≧0.1M且≦1M。

中性钠离子盐在制备抑制酸腐病病菌和水果保鲜的药剂中的应用；

以上所述的应用中，优选的，以中性钠离子盐水溶液直接浸果，然后按照常规贮藏保鲜方式实施；所述的中性钠离子盐中的钠离子浓度≧0.1M且≦1M。

以上所述的中性钠离子盐的种类包括但不限于：氯化钠，硝酸钠和硫酸钠。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

本发明通过离体实验和果实活体实验证实了中性钠离子盐能有效地抑制柑橘酸腐病菌，并阐明了其在柑橘采后处理中的应用前景。同时，中性钠离子盐(如：氯化钠等)是一种无毒的化学试剂，价格便宜，用量少，因此，可确定其安全性。这是国内外首次将中性钠离子盐作为一种防腐保鲜剂应用于柑橘果实采后处理中。

中性钠离子盐能有效地提高柑橘贮藏保鲜能力，增加果实的硬度，诱导果实表皮中的相关活性酶含量升高，增强果实自身的防御能力。因此，我们可以通过中性钠离子盐(如：氯化钠等)处理采后柑橘果实从而达到抑制柑橘酸腐病菌，控制失水起保鲜作用以及保持果实品质不变的效果。

附图说明

图1为含有氯化钠，氯化钾，硝酸钠和硫酸钠的PDA培养基上柑橘酸腐菌生长情况；

A:纯PDA培养基培养上柑橘酸腐菌生长情况；

B:含0.6mol/L氯化钠PDA培养基培养上柑橘酸腐菌生长情况；

C:含0.6mol/L氯化钾PDA培养基培养上柑橘酸腐菌生长情况；

D:含0.6mol/L硝酸钠PDA培养基培养上柑橘酸腐菌生长情况；

E：含0.6mol/L钠离子的硫酸钠PDA培养基培养上柑橘酸腐菌生长情况。

图2为1mol/L氯化钠溶液处理温州蜜柑“国庆一号”和“纽赫尔”脐橙活体接种实验；

其中，A：1mol/L氯化钠溶液不同方式处理温州蜜柑“国庆一号”后活体接种实验；

B：1mol/L氯化钠溶液不同方式处理“纽赫尔”脐橙后活体接种实验；

a:蒸馏水清洗后接种柑橘酸腐菌；

b:1mol/L氯化钠溶液浸泡2min后接种柑橘酸腐菌；

c:接种柑橘酸腐菌后置于1mol/L氯化钠溶液中熏蒸；

d:活体接种1×10⁶CFU/ml柑橘酸腐菌和1mol/L氯化钠混合溶液。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方式；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明实施例中所得试验数据应用SAS软件ANOVA程序作差异显著性测验(P<0.05)。本发明以氯化钠，硝酸钠和硫酸钠为例说明，中性钠离子盐可以对柑橘酸腐病菌和柑橘保鲜起作用，其他中性钠离子盐也能发挥相同作用。

实施例1：

不同浓度和种类的中性盐对柑橘酸腐菌的抑制实验：

本实施例在平板实验中测定不同试剂对柑橘酸腐菌的菌丝生长抑制

1、分别配制含有不同浓度氯化钠，氯化钾，硝酸钠和硫酸钠的PDA培养基，待其冷至50℃以下时，在每个培养基中间放置相同大小的酸腐病菌菌苔(直径是10mm)，每种试剂每个浓度实验重复三次，具体的物质浓度及其抑制酸腐病菌效果见表1，所述的硫酸钠的浓度以其所含的钠离子浓度计。

2、将培养皿放置于28℃培养，每天记录柑橘酸腐病菌菌苔生长直径的大小。

表1 柑橘酸腐病菌在不同浓度中性盐生长情况

结果表明：含钠离子的培养基都对柑橘酸腐病菌的生长有抑制作用。在纯PDA培养基上柑橘酸腐病菌生长5天就能将90mm培养皿全部覆盖，但是在混合0.6mol/L氯化钠的PDA培养基中，柑橘酸腐病菌几乎不生长，而在混有同样浓度氯化钾的PDA培养基中，柑橘酸腐病菌可以生长，说明钠离子比钾离子对柑橘酸腐病菌的抑制作用更有效；随后我们用含钠离子的硝酸钠和硫酸钠混合PDA培养基，同样观察到含有钠离子的强酸强碱盐都对柑橘酸腐病菌有很好的抑制作用，同时0.6mol/l硝酸钠也几乎完全抑制柑橘酸腐病菌的生长，根据实验结果，我们可以发现中性钠离子盐在低浓度下能完全抑制柑橘酸腐病菌的生长。

实施例2：

中性钠离子盐在制备防治采后柑橘酸腐病中的应用，其应用方法是：

1、分别选择果型大小一致，无机械损伤的温州蜜柑“国庆一号”和“纽赫尔”脐橙成熟果实40个，2％次氯酸钠溶液浸泡2min，清水冲洗两次，室温风干；

2、配制1mol/l氯化钠溶液；

3、将40个果实分为4组，每组10个果实，第二组果实完全浸入1mol/l氯化钠溶液中处理2min，另外3组果实不做任何处理；

4、分别用无菌水和1mol/l氯化钠溶液配置1×10⁶CFU/ml的柑橘酸腐病菌溶液；

5、使用打孔针在柑橘果实赤道线上等距离刺三个伤口(勿刺穿柑橘油胞层)；

6、第一组，第二组和第三组所有果实每个伤口接种20μl无菌水配制的柑橘酸腐病菌溶液，然后将第一组和第二组果实放置在底部盛有适量无菌水的塑料盒中；第三组果实放置在底部盛有适量1mol/l氯化钠溶液的塑料盒中；第四组果实每个伤口接种20μl 1mol/l氯化钠溶液配制的柑橘酸腐病菌溶液，之后放置在底部盛有适量无菌水的塑料盒中；

7、将所有果实置于室温条件下，一周后观察不同处理组伤口发病情况并统计腐烂率，该实验重复三次。

腐烂率的计算方法是：果实孔数腐烂率＝酸腐菌发病孔数/果实总孔数*100％

最终显示的结果是三次重复实验果实孔数腐烂率的平均数，结果如下：

表2 温州蜜柑“国庆一号”和“纽赫尔”脐橙果实孔数腐烂率

贮藏一周后，温州蜜柑“国庆一号”和“纽赫尔”脐橙果实腐烂率有显著性差异，无论是1mol/l氯化钠溶液浸泡，熏蒸果实，还是混合1mol/l氯化钠溶液的酸腐病菌接种柑橘果实，其发病率都显著低于第一组对照果实(表2)。

以上数据说明中性钠离子盐在柑橘果实活体中也能抑制酸腐菌的生长，减少果实酸腐病发病率。

在活体接种实验中，1mol/l氯化钠溶液不论以何种方式处理柑橘果实，都能显著降低了果实腐烂率，同时果皮新鲜程度也更高，硬度也更大(图2)。

实施例3：

中性钠离子盐在柑橘采后贮藏中对柑橘果实品质及酸腐菌腐烂率的影响：

1、选择纽荷尔脐橙成熟果实2400个，平均分为两组，即对照组和实验组。每组1200个脐橙，平均分为3次重复；

2、配制0.1M氯化钠溶液，称取117g氯化钠固体粉末，加入20L水中；

3、将对照组果实完全浸入清水中中处理30s；而实验组果实则侵入0.1M氯化钠溶液中处理30s；

4、自然晾干，两组果实都放于常规通风库中贮藏，分别在贮藏0d、30d、60d和90d后统计果实品质以及柑橘酸腐菌腐烂率等差异。表3中的可食率，出汁率，可溶性固体，可滴定酸的计算方法可参考相关生理品质测定试剂盒使用说明。

腐烂率＝酸腐菌腐烂果实个数/果实总个数*100％；

最终显示的结果是三次重复实验果实腐烂率的平均数。

结果如下：

表3 对照组和0.1M氯化钠处理贮藏0d、30d、60d和90d后生理品质差异

在常规通风库贮藏下，贮藏30d后，对照组的果实果重、可食率、可固和可滴定酸以及腐烂率等品质指标都与实验组果实相差不大(表3)。

贮藏60d和90d后，实验组的果实可食率和可固等品质指标均显著高于对照组，出汁率和可滴定酸依旧与对照组果实差异不明显。值得关注的是，无论是贮藏60d还是贮藏90d的实验组果实，其酸腐腐烂率都明显低于对照组果实(表3)。

以上数据说明该处理在柑橘长期贮藏过程中对柑橘生理品质没有很大影响，但是能降低柑橘酸腐菌腐烂率。

实施例4：

中性钠离子盐在柑橘采后贮藏中对柑橘果实失重率的影响：：

1、选择纽荷尔脐橙成熟果实3600个，平均分为三组，每组1200个脐橙，平均分为3次重复；2、配制0.1M氯化钠溶液，称取117g氯化钠固体粉末，加入20L水中；配制0.5M氯化钠溶液，称取585g氯化钠固体粉末，加入20L水中；

3、将对照组果实完全浸入清水中中处理30s；而两组实验组果实则分别侵入0.1M和0.5M氯化钠溶液中处理30s；

4、自然晾干，两组果实都放于常规通风库中贮藏，分别在贮藏0d、15d、30d、45d、60d、75d和90d后统计果实失重率差异。

失重率的计算方式是：失重率＝(W1-W2)/W1*100％。W1为不同贮藏时间测量的果实重量，单位为g；W2为贮藏0d时测定的果实重量。每个处理随机挑选15个果实。

结果如下：

表4 对照组和不同浓度氯化钠处理贮藏0d、15d、30d、45d、60d、75d和90d后失重率差异

在常规通风库贮藏下，无论是实验组还是对照组果实，随着贮藏时间的增加，果实失重率都在逐渐增大。与对照组果实相比，0.1M氯化钠处理果实失重率明显高于对照组，而0.5M氯化钠处理组果实失重率与对照组差异不明显(表4)。

以上数据说明在柑橘长期贮藏过程中0.1M氯化钠处理会加重柑橘失重率，但0.5M氯化钠处理对柑橘失重率几乎没有影响，随着贮藏时间的增加，甚至会降低柑橘贮藏的失重率。