阅读说明：本技术 一种化合物及其制备方法和应用 (Compound and preparation method and application thereof ) 是由 肖伟 倪付勇 温建辉 谢雪 李明 吴云 王振中 于 2018-08-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种植物源化合物及其制备方法和应用。本发明对川芎进行研究,得到了一种能得到新的活性组分,其结构式如下,经实验表明,其对LPS刺激A7r5细胞产生NO有明显的抑制作用,该化合物具有良好的抗炎作用；该化合物对经典途径的补体激活有明显的抑制作用,具有良好的抗补体活性。<Image he="253" wi="700" file="DDA0001776799940000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention relates to a plant source compound and a preparation method and application thereof. The invention researches the ligusticum wallichii to obtain a new active component with the structural formula shown in the specification, and experiments show that the compound has an obvious inhibition effect on the stimulation of LPS to A7r5 cells to generate NO, and has a good anti-inflammatory effect; the compound has obvious inhibition effect on the activation of the complement in the classical pathway and has good anti-complement activity.)

一种化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种植物源化合物及其制备方法和应用。

背景技术

中药川芎(Ligusticum chuanxiong Hort)是伞形科植物川芎的干燥根茎,主要产于云南、贵州、四川等地，别名香果、马衔、贯芎、京芎等。

川芎药用功效始载于《神农本草经》，其性温，味辛，微苦具有活血行气、祛风止痛之功效。主要用于血瘀气滞所致的***，痛经经闭，头痛、风寒湿痹等。

川芎化学成分复杂，生物活性广泛，包括有挥发油类，生物碱类，多糖等。川芎挥发油主要包括苯肽类、萜烯类、有机酸及其酯类。川芎中的生物碱成分主要有川芎嗪(tetramethylrazine)、黑麦碱(perlolyrine)、三甲胺、腺嘌呤、腺苷、胆碱、尿嘧啶等，其中川芎嗪为其主要有效成分。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种化合物及其制备方法和应用，制备的化合物具有良好的抗炎活性或抗补体活性。

具体地，本发明涉及一种化合物，具有式I结构：

本发明还提出了一种上述化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(1)：将川芎药材加乙醇水溶液回流提取，提取液浓缩后得浸膏；乙醇水溶液优选60-80％乙醇水溶液，更优选为75％乙醇水溶液，

步骤(2)：将步骤(1)得到的浸膏加水混合，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取部位浓缩，得到乙酸乙酯萃取物；

步骤(3)：将步骤(2)得到的乙酸乙酯萃取物进行柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的二氯甲烷-甲醇体积比为(50～1):1，收集二氯甲烷-甲醇体积比为(10～6):1分离得到的组分；

步骤(4)：将步骤(3)得到的组分部位进行凝胶柱色谱纯化，用有机溶剂洗脱，收集分离；

步骤(5)：将步骤(4)分离得到的组分进行色谱分离纯化，以15％～45％的有机溶剂水溶液进行洗脱，将该洗脱液处理后即得到式(I)所示化合物。

进一步地，所述步骤(1)中，所述川芎与乙醇水溶液的重量比为1：(10～20)。

具体地，所述凝胶柱色谱中所用凝胶选自Sephadex LH-20、Sephadex G15或Sephadex G50。

进一步地，所述步骤(4)中，所用有机溶剂选自甲醇、乙醇、50％甲醇-水或50％乙醇-水。

具体地，所述步骤(5)中所述色谱分离纯化选自高效液相色谱、中低压制备色谱或常压柱色谱分离。步骤(5)所述溶剂可选自甲醇、乙醇、乙腈等。

本发明还提出了一种式I的化合物在制备抗炎药物中的应用。该炎症可以由烧伤、化学刺激、物理损伤以及毒素等引起。抗炎药物优选针对LPS(脂多糖)诱导或引发的炎症。

本发明还提出了一种式I的化合物在制备抗补体药物中的应用。该补体过度激活由外来侵入物、清除肌体内损伤或死亡的细胞和组织引起。抗补体药物优选能抑制敏化的2％绵羊红细胞引发溶血的补体。

本发明还提出了一种抗炎药物或抗补体药物，其包括式I所述的化合物。

具体地，所述抗炎药物或抗补体药物可选自口服给药剂型、注射给药剂型、或外用给药制剂。

本发明对川芎进行研究，得到了一种能得到新的活性组分，其对LPS刺激A7r5细胞产生NO有明显的一致作用，具有良好的抗炎作用。此外，通过对该化合物体外经典抗补体活性的测定，发现该化合物对补体激活有明显的抑制作用，作用强于阳性药肝素，具有良好的抗补体活性。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的化合物的ESI-MS图；

图2为本发明实施例1制备的化合物的¹H NMR图；

图3为本发明实施例1制备的化合物的¹³C NMR图；

图4为本发明实施例1制备的化合物的HSQC图；

图5为本发明实施例1制备的化合物的HMBC图；

图6为本发明实施例1制备的化合物的¹H-¹H COSY图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

特别需要指出的是，针对本发明所做出的类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

其次，需要注意的是，本发明所涉及的未注明的浓度均为体积百分含量(v/v)。其它除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例或份数按重量计。另，本发明如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明。本发明以川芎药材为原料，所述川芎药材可以为本领域技术人员公知的川芎药材，本发明对此并无特殊限制。

式(I)所示化合物的制备

1、药材与试剂

除液相色谱用甲醇和乙腈为色谱纯外，其余试剂均为分析纯。川芎药材购于安徽亳州。

2、实施例1

川芎药材10kg，粉碎后加入10倍量的75％乙醇回流提取2次，每次2h，滤过，滤液回收乙醇并浓缩得到浸膏。此浸膏加水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取部位减压回收乙酸乙酯并浓缩，得到乙酸乙酯浸膏，乙酸乙酯浸膏利用硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇(50:1、20:1、10:1、8:1、6:1、3:1、1:1)梯度洗脱，每500ml接收一个流份，收集二氯甲烷-甲醇(10:1)的组分，经减压浓缩后，再进行Sephadex LH-20凝胶柱纯化，甲醇洗脱，每5ml收集一个流份，减压浓缩后，经高效液相色谱分离，以20％的乙腈水溶液进行洗脱，得到式(I)所示化合物7mg。

3、实施例2

川芎药材15kg，粉碎后加入15倍量的75％乙醇回流提取3次，每次1.5h，滤过，滤液回收乙醇并浓缩得到浸膏。此浸膏加水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取部位减压回收乙酸乙酯并浓缩，得到乙酸乙酯浸膏，乙酸乙酯浸膏利用硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇(50:1、20:1、10:1、8:1、6:1、3:1、1:1)梯度洗脱，每500ml接收一个流份，收集二氯甲烷-甲醇(8:1)的组分，经减压浓缩后，再进行Sephadex G15凝胶柱纯化，乙醇洗脱，每8ml收集一个流份，减压浓缩后，经高效液相色谱分离，以20％的乙腈水溶液进行洗脱，得到式(I)所示化合物6mg。

4、实施例3

川芎药材5kg，粉碎后加入20倍量的75％乙醇回流提取2次，每次2h，滤过，滤液回收乙醇并浓缩得到浸膏。此浸膏加水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取部位减压回收乙酸乙酯并浓缩，得到乙酸乙酯浸膏，乙酸乙酯浸膏利用硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇(50:1、20:1、10:1、8:1、6:1、3:1、1:1)梯度洗脱，每500ml接收一个流份，收集二氯甲烷-甲醇(6:1)的组分，经减压浓缩后，再进行Sephadex LH-20凝胶柱纯化，50％甲醇-水洗脱，每5ml收集一个流份，减压浓缩后，经常压柱色谱分离，以30％的甲醇水溶液进行洗脱，得到式I所示化合物8mg。

化合物的结构鉴定

实施例1-3所得化合物均为白色粉末，采用ESI-MS、¹HNMR、¹³C NMR、HSQC、HMBC和¹H-¹H COSY谱对实施例1-3所得成品进行结构鉴定。

图1为实施例1制得的化合物的ESI-MS谱图，图2为实施例1制得的化合物的¹H NMR谱图，图3为实施例1制得的化合物的¹³C NMR谱图，图4为实施例1制得的化合物的HSQC谱图，图5为实施例1制得的化合物的HMBC谱图，图6为实施例1制得的化合物的¹H-¹H COSY谱图。

HR-ESI-MS(negative)给出m/z为389.1238[M-H]^-(理论计算值为390.1315)，进而确定化合物分子式为C₂₀H₂₂O₈，不饱和度为10。

根据¹HNMR(400MHz，CD₃OD)谱图，低场区显示一组反式烯氢信号δ7.58(1H,d,J＝15.9Hz)，6.33(1H,d,J＝15.9Hz)和两组1,3,4-三取代苯环质子信号δ7.07(1H,dd,J＝8.0,1.8Hz)，6.81(1H,d,J＝8.0Hz)，7.18(1H,d,J＝1.8Hz)，6.83(1H,dd,J＝8.0,2.0Hz)，6.77(1H,d,J＝8.0Hz)，6.99(1H,d,J＝2.0Hz)，其中苯环上部分质子信号重叠，并通过HSQC和HMBC谱得以证实。高场区δ3.89(3H，s)和3.84(3H，s)处显示两个甲氧基信号。另外，在3.9～4.8之间有4组质子信号：δ4.58(1H,d,J＝6.2Hz)，4.12(1H,m)，3.97(1H,m)，3.93(1H,m)都为连氧碳上的氢。¹³C NMR(100MHz，CD₃OD)谱显示有20个碳，其中一个酯羰基δ167.7，两个连氧的次甲基碳δ74.6，73.6，一个连氧的亚甲基碳δ65.4，两个甲氧基碳δ55.1，55.0。HMBC谱中，反式烯氢δ7.58(1H,d,J＝15.9Hz,H-7)与δ167.7(C-9)、122.7(C-6)及110.4(C-2)相关，6.33(1H,d,J＝15.9Hz,H-8)与δ167.7(C-9)、126.3(C-1)相关，δ3.89(3H，s)与δ148.0(C-3)相关，表明分子中含有一个阿魏酰基的结构单元。¹H-¹H COSY谱中，δ4.58(1H,d,J＝6.2Hz,H-7′)、3.93(1H,m,H-8′)、3.97(1H,m，H_a-9′)和4.12(1H,m，H_b-9′)组成一个偶合系统，结合HSQC谱可知其为-OCH₂CHOH-CHOH片段。

在HMBC谱中，δ3.97(1H,m,H_a-9′)、δ4.12(1H,m,H_b-9′)都与δ167.7(C-9)相关，表明-OCH₂CHOH-CHOH与阿魏酰基以酯键相连；而次甲基质子δ4.58(1H,d,J＝6.2Hz,H-7′)与δ132.9(C-1′)、110.2(C-2′)、119.3(C-6′)、65.4(C-9′)相关，表明-OCH₂CHOH-CHOH-的另一端通过δ74.6(C-7′)与苯环上δ132.9(C-1′)相连；6.99(1H,d,J＝2.0Hz,H-2′)与δ145.9(C-4′)、119.3(C-6′)相关，δ3.84(3H，s)与δ147.5(C-3′)相关。综合以上数据分析，该化合物鉴定为(E)-阿魏酸-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)甘油醇酯，英文名为(E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)glyceryl ferulate。

表1本发明提供的式(I)所示化合物的核磁数据

注：测试条件为氘代甲醇，¹HNMR400MHz，¹³CNMR 100MHz。

实施例2-3的ESI-MS、¹HNMR、¹³C NMR、HSQC、HMBC和¹H-¹H COSY谱图与实施例1相同，说明其结构式均如式I所示。

体外抗炎试验

1、试验材料

1.1细胞：A7r5大鼠胸主动脉平滑肌细胞购自于上海中科院细胞库，传至第三代进行试验。

1.2试剂：DMEM培养基(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，胰蛋白酶(Gibco)，LPS(Sigma)，DMSO(sigma)，一氧化氮(NO)检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；化合物1(结构式如式(I)所示)。

1.3仪器与设备：超净工作台(苏净安泰)，二氧化碳培养箱(Thermo scientific3100)，倒置显微镜(OLYPUS)，96孔细胞培养板(美国Costar)，25cm²细胞培养瓶(美国Costar)，酶标仪(MD)，移液枪(Eppendorf)，BXM-30R立式压力蒸气灭菌锅(上海***实业有限公司医疗设备厂)，LD4-2A离心机(北京众益中和生物技术有限公司)，细胞自动计数仪(Invitrogen，Cl028)。

2、试验方法

2.1供试品配制：称取式(I)所示化合物溶于DMSO中配制成浓度为50mM的储存液，检测时用无血清DMEM培养液稀释1/1000作为供试品药液。

2.2细胞培养与炎症因子的检测：细胞以8×10⁴个/mL的浓度接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养24小时。

吸弃上清，按照实验需要分成空白组、模型组、给药组，空白组给予无血清培养基100μL，模型组给予用无血清培养基配制的终浓度为3μg/mL的LPS 100μL，给药组药物用浓度为3μg/mL的LPS配制，使其终浓度为50μM，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养24小时。每组设三个复孔。

吸取50μL细胞上清液加入空白96孔板，加入室温50μL Griess ReagentⅠ，加入室温50μL Griess ReagentⅡ，于540nm测定吸光度，用于NO的检测。

3、统计方法

-

使用SPSS 16.0统计软件进行分析，实验数据均以x±s表示，p<0.05为差异有统计学意义。

4、结果

在LPS刺激A7r5细胞的炎症反应中，与空白组相比，给药组在50μM的浓度下对A7r5细胞生长无明显影响。与空白组相比，模型组LPS刺激24h后A7r5细胞上清液中NO含量显著升高，而经过式(I)所示化合物预处理24h后，细胞上清液中NO的释放受到明显抑制，结果见表2。

表2药物对LPS刺激A7r5细胞产生NO的影响

与空白组比较，##p≤0.01；与模型组比较，**p≤0.01，*p≤0.05

综上可知，本发明提供的式(I)所示化合物对LPS刺激A7r5细胞产生NO有明显的抑制作用，具有良好的抗炎作用。

抗补体活性实验

1、试剂与仪器

MULTISKAN MK3型酶标仪(Thermo Scientific,美国)；Agilent 1290-6538液质联用仪(美国Agilent公司)；2051型紫外-可见光分光光度仪；TDL-4型低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；JouanMR22i型低温高速离心机(JOUAN公司，法国)；WMZK 8002型恒温振荡器(上海医用仪器厂)；水(三蒸水，自制)；巴比妥(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20170826)；巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：H20160425)；MgCl₂·6H₂O(湖北兴星和化工股份有限公司，批号：150378)；肝素(上海爱紫特生物科技有限公司，批号：090608)；溶血素1:4000sigma公司(美国)；2％绵羊红细胞(SRBC)(上海康润生物科技有限公司)；豚鼠血清来自康缘药业股份有限公司试验动物中心。

2、动物

豚鼠(250～300g)，雌雄不限，康缘药业股份有限公司实验动物中心提供。

3、实验方法

3.1溶液配制巴比妥缓冲液(BBS)，包含0.5mol·L^-1镁(Mg²⁺)和0.15mol·L^-1钙(Ca²⁺)。

1:1000溶血素：取溶血素适量，加入BBS，配制成为1:1000溶血素溶液。

供试品溶液配制：称取式(I)样品3mg，加入20μL DMSO和780μL的BBS超声溶解作为1:1溶液，加BBS对倍稀释配成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128。共得8个浓度的供试品溶液。

3.2补体的效价评定：取一定量豚鼠血清(补体)配成1:10溶液，并对倍稀释成1:20,1:40，1:80，1:160。取溶血素、各浓度补体及2％SRBC各0.1mL溶于0.3mL BBS中，混匀，37℃水浴温育30min，离心后取上清液在405nm处测定吸光度。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，选择达到相似吸光度的最低补体溶度作为正常溶血所需要的临界补体浓度。

3.3药物经典途径抗补体活性测定：取临界浓度的补体与上述各供试品混匀，加入适量的BBS、溶血素和2％SRBC。37℃水浴温育30min，离心后取上清液在405nm处测定吸光度。实验同时设置化合物对照组(将等量的供试品加入BBS缓冲液中，用于测定化合物本底A值)、补体组(取临界质量浓度的补体加入BBS缓冲液、溶血素和2％SRBC，用于测定临界质量浓度补体所造成红细胞溶血的A值)和全溶血组(将2％SRBC加入水中使之全溶血，用于观察补体组是否达到或接近全溶血水平)。计算溶血抑制率。

溶血抑制率＝1-(A_化合物组-A_{化合物对照组})/A_补体组

3.4实验结果

通过对该化合物体外经典抗补体活性的测定，结果发现该化合物对经典途径的补体激活有明显的抑制作用，作用强于阳性药肝素(CH₅₀＝0.050±0.016)，具有良好的抗补体活性。

表3化合物的抗补体活性测定结果(n＝3)

显然，上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。