分析用试样的制备方法、分析方法和分析用试样的制备用试剂盒
阅读说明：本技术 分析用试样的制备方法、分析方法和分析用试样的制备用试剂盒 (Method for preparing sample for analysis, method for analysis, and kit for preparing sample for analysis ) 是由 西风隆司 于 2019-08-23 设计创作，主要内容包括：提供分析用试样的制备方法、分析方法和分析用试样的制备用试剂盒。本发明的课题在于将分析对象的含内酯结构的唾液酸与其他唾液酸相区别并进行分析。一种分析用试样的制备方法,其用于进行试样中含有的含内酯结构的糖链的分析,该制备方法具备：进行第1酰胺化反应的步骤,在试样中加入含有与含内酯结构的唾液酸反应的氨、胺或它们的盐作为第1亲核试剂的第1酰胺化反应溶液,对含内酯结构的唾液酸进行酰胺化；以及,进行第2反应的步骤,用除完全甲基化以外的方法对第1酰胺化反应中未被酰胺化的唾液酸的至少一部分进行修饰。(Provided are a method for preparing an analysis sample, an analysis method, and a kit for preparing an analysis sample. The present invention addresses the problem of analyzing lactone structure-containing sialic acid to be analyzed while distinguishing it from other sialic acids. A method for preparing a sample for analysis for analyzing a sugar chain containing a lactone structure contained in the sample, the method comprising: a step of performing an amidation reaction of 1 st, in which a1 st amidation reaction solution containing, as a1 st nucleophile, ammonia, amine or a salt thereof which reacts with the lactone structure-containing sialic acid is added to a sample to amidate the lactone structure-containing sialic acid; and a step of carrying out a2 nd reaction in which at least a part of sialic acid which is not amidated in the 1 st amidation reaction is modified by a method other than complete methylation.)
技术领域
本发明涉及分析用试样的制备方法、分析方法和分析用试样的制备用试剂盒。
背景技术
唾液酸是在生物体内大量存在的糖。唾液酸在生物体内也包含在与蛋白质结合的糖链中，多存在于糖链的非还原末端。因此，唾液酸由于在这种糖蛋白分子中配置在分子的外侧、可被其他分子直接识别，因此具有重要的作用。唾液酸与邻接的糖之间的连接方式(linkage type)有时会不同。例如已知人的N-连接型糖链(N型糖链)主要为α2,3-和α2,6-的连接方式，O-连接型糖链(O型糖链)、鞘糖脂在前述连接方式的基础上还有α2,8-和α2,9-的连接方式。根据这种连接方式的区别，唾液酸可以被不同的分子识别、具有不同的作用。
唾液酸可以进行乙酰基化等各种修饰，在其中会形成唾液酸内酯。迄今，已知在糖脂的神经节苷脂、乳寡糖链中存在内酯结构(参见非专利文献1)。在脑内经常被表达的聚唾液酸结构含有α2,8-、α2,9-的连接方式的唾液酸，但这些也被认为容易形成内酯结构。也报道有生物药物、特别是抗体药物的糖链中含内酯结构。非专利文献2中记载了某种生物仿制药含内酯结构这一点。
尚未确立将含内酯结构的唾液酸与不含内酯结构的唾液酸相区别并定量检测的方法。含内酯结构的唾液酸由于与不含内酯结构的唾液酸相比小了一个水分子(H2O)的大小，因此使用质谱分析即可区别。然而，内酯结构极不稳定，即使在水中也容易水解，在酸性或碱性条件下会更迅速地水解。因此，特别是在通过酶法或化学法将糖链切断以游离糖链的形式进行分析的情况、通过蛋白酶消化以糖肽的形式进行分析的情况等下，由于分解而不能确认成功地对内酯结构进行了定量分析。
在质谱分析等中，作为针对含有唾液酸的糖链的前处理，进行唾液酸的修饰。其通过利用酯化、酰胺化等对具有负电荷的唾液酸的羧基进行中性化来克服电离的抑制、唾液酸的脱离等缺点。将其进一步发展，还提出了连接方式特异性地对唾液酸进行定量的方法(参见专利文献1和非专利文献3)。然而，该方法无法将原本就以内酯结构存在的唾液酸和并非如此的通常的唾液酸加以区别。
非专利文献4通过进行氨解和完全甲基化后进行质谱分析来检测神经节苷脂的内酯。然而，完全甲基化存在会将糖链的羟基全部甲基化的限制。
现有技术文献
专利文献
[专利文献1]日本特许第6135710号公报
非专利文献
[非专利文献1]Riboni L,Sonnino S,Acquotti D,Malesci A,Ghidoni R,EggeH,Mingrino S,Tettamanti G."Natural occurrence of gangliosidelactones.Isolation and characterization of GD1b inner ester from adult humanbrain"Journal of Biochemical Chemistry,(美国),American Society forBiochemistry and Molecular Biology,1986年6月25日,Volume 261,Issue 18,pp.8514-8519
[非专利文献2]Liu S,Gao W,Wang Y,He Z,Feng X,Liu BF,Liu X."Comprehensive N-Glycan Profiling of Cetuximab Biosimilar Candidate by NP-HPLCand MALDI-MS"PLoS One,(美国),Public Library of Science,2017年1月10日,Volume12,Issue 1,e0170013
[非专利文献3]Nishikaze T,Tsumoto H,Sekiya S,Iwamoto S,Miura Y,TanakaK."Differentiation of Sialyl Linkage Isomers by One-Pot Sialic AcidDerivatization for Mass Spectrometry-Based Glycan Profiling,"AnalyticalChemistry,(美国),ACS Publications,2017年2月21日,Volume 89,Issue 4,pp.2353-2360
[非专利文献4]Levery SB,Salyan MEK,Roberts CE,Bouchon B,Hakomori S."Strategies for characterization of ganglioside inner esters I-Fast atombombardment mass spectrometry"Biomedical&Environmental Mass Spectrometry,(英国),John Wiley&Sons,1990年5月,Volume 19,Issue 5,pp.303-310
发明内容
发明要解决的问题
需要将试样中原本含有的含内酯结构的唾液酸与不含内酯结构的唾液酸相区别并以高精度进行定量的方法。
用于解决问题的方案
基于本发明的优选的实施方式的分析用试样的制备方法用于进行试样中含有的含内酯结构的糖链的分析，该制备方法具备：进行第1酰胺化反应的步骤，在前述试样中加入含有与前述含内酯结构的唾液酸反应的氨、胺或它们的盐作为第1亲核试剂的第1酰胺化反应溶液，对前述含内酯结构的唾液酸进行酰胺化；以及，进行第2反应的步骤，用除完全甲基化以外的方法对前述第1酰胺化反应中未被酰胺化的唾液酸的至少一部分进行修饰。
进一步优选的实施方式中，为了进行前述第1酰胺化反应而使前述试样与前述第1酰胺化反应溶液接触的时间短于30分钟。
进一步优选的实施方式中，前述第1酰胺化反应溶液不含与唾液酸反应的脱水缩合剂。
进一步优选的实施方式中，前述胺为伯胺。
进一步优选的实施方式中，前述胺含有烷基。
进一步优选的实施方式中，前述烷基不具有支链。
进一步优选的实施方式中，前述第1酰胺化反应溶液的pH为8.0以上。
进一步优选的实施方式中，前述第1酰胺化反应溶液含有胺或其盐，前述胺或其盐的浓度为0.5M以上。
进一步优选的实施方式中，前述第2反应在前述试样结合或吸附于固相载体的状态下进行。
进一步优选的实施方式中，前述第2反应中使供于前述第1酰胺化反应后的前述试样与第2反应溶液接触，前述第2反应溶液还含有与前述第1酰胺化反应中未被酰胺化的唾液酸反应的氨、胺、醇或它们的盐作为第2亲核试剂，通过前述第2反应，对前述第1酰胺化反应前在前述试样中含有的不具有前述内酯结构的唾液酸的至少一部分进行酰胺化或酯化，前述第1亲核试剂与前述第2亲核试剂不同。
进一步优选的实施方式中，前述第2反应溶液含有脱水缩合剂。
进一步优选的实施方式中，前述第2反应中使供于前述第1酰胺化反应后的前述试样与第2反应溶液接触，前述第2反应溶液含有酯合成用烷化剂。
进一步优选的实施方式中，前述第2反应中根据唾液酸的连接方式对前述唾液酸的至少一部分进行修饰。
进一步优选的实施方式中，前述第2反应用不同的修饰体对α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸和α2,9-唾液酸中的至少一种以及α2,6-唾液酸进行修饰。
基于本发明的优选的实施方式的分析方法具备：通过上述分析用试样的制备方法制备分析用试样的步骤；以及，对所制备的前述分析用试样进行分析的步骤。
进一步优选的实施方式中，所制备的前述分析用试样通过质谱分析和色谱中的至少一种进行分析。
基于本发明的优选的实施方式的分析用试样的制备用试剂盒含有氨、胺及它们的盐中的至少一种，在上述分析用试样的制备方法中使用。
发明的效果
根据本发明，能够将试样中原本含有的含内酯结构的唾液酸与不含内酯结构的唾液酸相区别并以高精度进行定量。
附图说明
图1是示出一个实施方式的分析方法的流程的流程图。
图2是示出一个实施方式的分析方法的流程的流程图。
图3的(A)、图3的(B)和图3的(C)是示出实施例中使用的试样中含有的糖链的结构的示意图。
图4是对试样中含有的糖链进行唾液酸的连接方式特异性修饰后，对反应产物以负离子模式进行质谱分析而得到的质谱。
图5对试样中含有的糖链进行内酯的酰胺化和唾液酸的连接方式特异性修饰后，对反应产物以负离子模式进行质谱分析而得到的质谱。
图6是对试样中含有的糖链进行内酯的酰胺化、与酰肼珠的结合以及唾液酸的连接方式特异性修饰后，对反应产物以负离子模式进行质谱分析而得到的质谱。
图7是对试样中含有的糖链进行唾液酸的连接方式非特异性修饰后，对反应产物以负离子模式进行质谱分析而得到的质谱。
图8是对试样中含有的糖链进行内酯的酰胺化以及唾液酸的连接方式非特异性修饰后，对反应产物以负离子模式进行质谱分析而得到的质谱。
图9是对试样中含有的糖链进行内酯的酰胺化、与酰肼珠的结合以及唾液酸的连接方式非特异性修饰后，对反应产物以负离子模式进行质谱分析而得到的质谱。
图10是将自α2,3-唾液酸糖肽游离的糖链供于内酯化反应和氨解后，对反应产物以负离子模式进行质谱分析而得到的质谱，图10的(a)是氨解时的甲胺浓度为1％时的质谱，图10的(b)是氨解时的甲胺浓度为10％时的质谱。
图11是示出氨解时的甲胺水溶液的浓度与进行酰胺化的效率的关系的图表。
图12是示出氨解时的胺的种类与各反应产物的生成比的图表。
图13是示出氨解时的胺的种类和溶剂与各反应产物的生成比的图表。
图14是示出氨解时的pH与各反应产物的生成比的图表。
图15是将自糖蛋白胎球蛋白游离的糖链供于内酯化反应和氨解后，对反应产物进行质谱分析而得到的质谱。
图16是示出将自α2,3-唾液酸糖肽游离的糖链供于内酯化反应后，使其与HILIC载体结合、在洗脱前后供于氨解时的各反应产物的生成比的图表。
具体实施方式
以下，参照附图对本发明的具体实施方式进行说明。以下的实施方式示出用于对试样中原本含有的糖链中的内酯进行分析的分析用试样的制备方法。发明人等发现，在试样中加入含有与含内酯结构的唾液酸反应的氨、胺或它们的盐的反应溶液，对试样中含有的含内酯结构的唾液酸进行酰胺化并定量。
-第1实施方式-
图1是示出本实施方式的分析用试样的制备方法的分析方法的流程的流程图。该分析方法用于对试样中原本含有的糖链中的内酯进行分析。在步骤S1001中，准备含有糖链的试样。
含有糖链的试样没有特别限定，可以含有选自由游离糖链、糖肽和糖蛋白、以及糖脂组成的组中的至少一种的分子。本实施方式的分析用试样的制备方法由于用于修饰糖链中含有的含内酯结构的唾液酸，进而适宜用于分析唾液酸的连接方式，因此试样中的糖链优选含有N-连接型糖链、O-连接型糖链、糖脂型糖链等有可能在末端具有唾液酸的糖链。试样中的糖链更优选含有α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸和α2,9-唾液酸中的至少一种以及α2,6-唾液酸，但不限定于含有它们的糖链。
步骤S1001结束后，进入步骤S1003。
(第1酰胺化反应)
在步骤S1003中，进行第1酰胺化反应，具体是使试样与用于对含内酯结构的唾液酸进行酰胺化的反应溶液(以下称为第1酰胺化反应溶液)接触，对试样中原本含有的含内酯结构的唾液酸进行酰胺化。发明人等发现了与迄今为止所进行的通过水解使内酯开环之后再对羧基进行酰胺化的公知常识完全不同，可以迅速地将内酯直接酰胺化的方法。该反应由于在无水条件下也可以适宜地进行，因此是不同于水解的反应，可认为是基于氨基与内酯的相互作用的氨解。以下，将在无水条件下也可进行的、利用氨、胺或它们的盐的内酯的开环和酰胺化称为氨解。此外，将试样中原本含有的内酯或内酯结构适当称为分析对象的内酯或内酯结构等。该氨解反应由于实质上不需要脱水缩合剂，因此不会影响并非内酯结构的通常的唾液酸，可以仅选择性地对发生了内酯化的唾液酸进行酰胺化。
需要说明的是，关于唾液酸中的内酯结构，可以以形成在唾液酸和与该唾液酸邻接的单糖之间的内酯结构、还有形成在唾液酸的内部的内酯结构等作为分析对象。
进行用于从第1酰胺化反应后的试样中去除第1酰胺化反应溶液的操作。用于去除第1酰胺化反应溶液的操作有：通过离心等从与固相载体结合的糖链中分离第1酰胺化反应溶液并使用洗涤溶液进行洗涤，或者通过减压离心浓缩使试样干固等，只要使第1酰胺化反应所需的试剂的浓度足够低即可，没有特别限定。
第1酰胺化反应溶液含有氨、胺或它们的盐。为了避免试样中原本未被内酯化的唾液酸被意外内酯化，第1酰胺化反应溶液优选不含或实质上不含脱水缩合剂。或者，第1酰胺化反应溶液优选只含有不会发生这种不期望的内酯化的浓度足够低的脱水缩合剂。优选地，第1酰胺化反应仅通过使试样与第1酰胺化反应溶液接触来进行，以简便的操作使分析对象的内酯稳定化。
(第1酰胺化反应中的胺)
在第1酰胺化反应中使用胺的情况下，第1酰胺化反应溶液中含有的胺优选为伯胺，更优选为具有直链烃基的伯胺，进一步优选为具有直链烷基的伯胺。对于第1酰胺化反应溶液中含有的胺，作为具有直链烷基的伯胺，优选为碳数为10以下的伯胺，更优选为碳数为7以下的伯胺，进一步优选为甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺，最优选为甲胺。第1酰胺化反应溶液中含有的胺具备不具有支链(以下“支链”表示烃链的支链)的直链状的结构、或碳数较少时，可更高效地对分析对象的内酯进行酰胺化，因此优选。
第1酰胺化反应溶液中含有的胺为具有不饱和链式烃基的伯胺的情况下，优选该不饱和链式烃基含有双键，更优选该不饱和链式烃基含有烯丙基(Allyl)，最优选该胺为烯丙胺(Allylamine)。第1酰胺化反应溶液中含有的胺可以是含有羟基的伯胺，该情况下，优选为乙醇胺。第1酰胺化反应溶液中含有的胺可以含有除烷基以外的各种官能团。第1酰胺化反应的结果，以含有这种官能团的方式修饰糖链，由此使得不仅通过质谱分析、而且通过色谱等也更容易将接受该修饰的糖链分离。
需要说明的是，第1酰胺化反应溶液可以含有上述胺的盐。
(第1酰胺化反应溶液的浓度)
第1酰胺化反应溶液中的氨、胺及它们的盐的浓度优选为0.1M(M为mol/l)以上，更优选为0.3M以上，进一步优选为0.5M以上，进一步优选为1.0M以上，最优选为3.0M以上。作为适宜的例子，第1酰胺化反应溶液含有氨或伯胺、特别是甲胺，该氨、或甲胺等伯胺的浓度优选为0.1M以上，更优选为0.3M以上，进一步优选为0.5M以上，进一步优选为1.0M以上，最优选为3.0M以上。第1酰胺化反应溶液的胺等的浓度越高，越能够更可靠地进行分析对象的内酯的酰胺化。
(第1酰胺化反应溶液的溶剂)
第1酰胺化反应溶液的溶剂可以是水系溶剂也可以是有机溶剂。该溶剂从防止分析对象的内酯的水解并可靠地引发迅速酰胺化的角度来看，可适当调节水含量，也可以使用实施了抑制水含量的脱水操作的脱水溶剂、无水溶剂。第1酰胺化反应溶液的溶剂优选含有甲醇和乙腈(ACN)中的至少一种。
需要说明的是，第1酰胺化反应溶液可以含有相当量的水(H2O)，第1酰胺化反应溶液的溶剂可以是水。
(第1酰胺化反应溶液的pH)
第1酰胺化反应溶液的pH优选为7.7以上，更优选为8.0以上，进一步优选为8.8以上，最优选为10.3以上。如果第1酰胺化反应溶液的pH升高，则可更可靠地对分析对象的内酯进行酰胺化，因此优选。
(用于引发第1酰胺化反应的时间)
第1酰胺化反应在数秒～数分钟以内完成。因此，为了通过第1酰胺化反应对内酯进行酰胺化，使试样与第1酰胺化反应溶液接触的时间(以下称为反应时间)优选小于1小时，更优选小于30分钟，进一步优选小于15分钟，进一步优选小于5分钟，最优选小于1分钟。优选地，可以用第1酰胺化反应溶液洗涤试样，或者只以短时间对保持于载体等的试样进行液体流通。此外，可以将试样与第1酰胺化反应溶液混合，直接干固而不设定反应时间。如此，第1酰胺化反应以短时间完成，因此能够防止不稳定的内酯发生分解而损害糖链的分析的定量性。此外，通过将第1酰胺化反应的反应时间设定得较短，可以更高效地进行试样的分析。
(进行第1酰胺化反应的相)
只要能够使试样与第1酰胺化反应溶液接触，则对引发第1酰胺化反应时的试样的状态没有特别限定，以固相进行的情况下，会因固相化反应时的唾液酸的内酯化而降低对分析对象的内酯进行定量的精度，因此第1酰胺化反应优选以液相进行。
需要说明的是，试样含有糖蛋白、糖肽或糖脂的情况下，第1酰胺化反应之后，可以使糖链自糖蛋白、糖肽或糖脂游离。作为该游离的方法，可以采用使用N-糖苷酶、O-糖苷酶、鞘糖脂内切糖苷酶(Endoglycoceramidase)等的酶处理、肼分解、基于碱处理的β脱离等方法。使N-连接型糖链自糖肽和糖蛋白的肽链游离的情况下，可适宜使用基于肽-N-糖苷酶F(PNGase F)、肽-N-糖苷酶A(PNGase A)、内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Endo M)等的酶处理。此外，可以适当进行糖链的还原末端的吡啶氨基化(PA化)等修饰。
试样含有糖肽或糖蛋白的情况下，第1酰胺化反应后，如在后述的“关于糖肽和糖蛋白的副反应的抑制”的部分所述，可以适当进行用于抑制肽部分的副反应的处理。此外，肽链的氨基酸的残基数多的糖肽或糖蛋白优选通过酶的切断等来将肽链切断而使用。例如制备质谱分析用的试样的情况下，肽链的氨基酸残基数优选为30以下，更优选为20以下，进一步优选为15以下。另一方面，在要求明确糖链所结合的肽的来源的情况下，肽链的氨基酸残基数优选为2以上，更优选为3以上。
作为将糖肽或糖蛋白的肽链切断时的消化酶，可使用胰蛋白酶、Lys-C、精氨酸内肽酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、蛋白酶K、链霉蛋白酶E等。可以将这些消化酶中的2种以上组合使用。切断肽链时的条件没有特别限定，可采用与所使用的消化酶相应的适当的规程。在该切断前，可以进行试样中的蛋白质和肽的改性处理、烷基化处理。改性处理、烷基化处理的条件没有特别限定。此外，可以不是通过酶的切断，而是通过化学切断等来将肽链切断。只要能够以所期望的精度对分析对象的内酯进行定量，则上述糖链的游离、副反应的抑制、或肽的切断的处理可以在第1酰胺化反应前进行。
步骤S1003结束后，进入步骤S1005。
步骤S1003中，分析对象的内酯被酰胺化而稳定化。本实施方式的分析用试样的制备方法和分析方法对步骤S1003中未被酰胺化的唾液酸进行连接方式特异性修饰，与含有分析对象的内酯的唾液酸相区别并进行分析。
(内酯化反应)
在步骤S1005中，进行使试样与用于内酯化的反应溶液(以下称为内酯化反应溶液)接触、对糖链中含有的唾液酸的至少一部分进行内酯化的内酯化反应(以下在记载为内酯化反应时，在没有特别提及的情况下，是指步骤S1005的内酯化反应)。内酯化反应对未被内酯化的唾液酸的一部分进行不同于内酯化的修饰。内酯化反应适宜地对α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸和α2,9-唾液酸进行内酯化。
内酯化反应溶液含有脱水缩合剂以及含有醇、胺或它们的盐的亲核试剂。调整脱水缩合剂和亲核试剂的种类、浓度，以便根据唾液酸的连接方式选择性地引发脱水反应或亲核反应。
由α2,3-唾液酸的羧基的分子内脱水产生的内酯为六元环，有可能由α2,6-唾液酸的羧基的分子内脱水产生的内酯为七元环。因此，产生比七元环稳定的六元环的α2,3-唾液酸与α2,6-唾液酸相比更容易内酯化。此外，α2,3-唾液酸的羧基与α2,6-唾液酸的羧基相比位于位阻较大的位置，因此与α2,6-唾液酸相比的话，大的分子较不容易与α2,3-唾液酸反应。根据这种由唾液酸的连接方式带来的分子结构的区别，调整脱水缩合剂和亲核试剂的种类、浓度，以便根据唾液酸的连接方式进行不同的修饰。
内酯化反应溶液中含有的亲核试剂(以下称为第2亲核试剂)与第1酰胺化反应溶液中含有的亲核试剂(以下称为第1亲核试剂)不同。用质谱分析对通过本实施方式的分析用试样的制备方法所得到的分析用试样进行分析的情况下，选择第1亲核试剂与第2亲核试剂以使质量不同。用色谱对通过本实施方式的分析用试样的制备方法所得到的分析用试样进行分析的情况下，第1亲核试剂与第2亲核试剂具有不同的取代基时容易在色谱中相互分离，因此优选。
(内酯化反应中的脱水缩合剂)
脱水缩合剂优选含有碳二亚胺。这是由于，如果使用碳二亚胺，则与使用鏻系脱水缩合剂(所谓的BOP试剂)、脲鎓系脱水缩合剂作为脱水缩合剂的情况相比，存在于位阻大的部位的羧基不易被酰胺化。作为碳二亚胺的例子，可列举出：N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺(EDC)、N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-叔丁基-3-乙基碳二亚胺(BEC)、N,N’-二叔丁基碳二亚胺、1,3-二对甲苯酰基碳二亚胺、双(2,6-二异丙基苯基)碳二亚胺、双(三甲基甲硅烷基)碳二亚胺、1,3-双(2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基甲基)碳二亚胺(BDDC)、它们的盐。
(内酯化反应中的添加剂)
为了促进利用脱水缩合剂的脱水缩合且抑制副反应，优选在碳二亚胺的基础上还使用亲核性高的添加剂。作为亲核性高的添加剂，优选使用1-羟基苯并***(HOBt)、1-羟基-7-氮杂-苯并***(HOAt)、4-(二甲氨基)吡啶(DMAP)、2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma)、N-羟基-琥珀酰亚胺(HOSu)、6-氯-1-羟基-苯并***(Cl-HoBt)、N-羟基-3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(HOOBt)等。
(内酯化反应中的亲核试剂(第2亲核试剂))
作为第2亲核试剂使用的胺优选含有含2个以上碳原子的伯烷基胺或仲烷基胺。伯烷基胺优选为乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、仲丁胺、叔丁胺等。仲烷基胺优选为二甲胺、乙基甲胺、二乙胺、丙基甲胺、异丙基甲胺等。从使如α2,3-唾液酸的羧基这样存在于位阻大的部位的羧基不易被酰胺化的角度来看，优选使用异丙胺这种具有支链烷基的胺。在内酯化反应溶液的亲核试剂使用胺的情况下，根据唾液酸的连接方式，对α2,6-唾液酸等一部分唾液酸的羧基进行酰胺化。
作为第2亲核试剂使用的醇没有特别限定，例如可以使用甲醇和乙醇等。在内酯化反应溶液的亲核试剂使用醇的情况下，根据唾液酸的连接方式，对α2,6-唾液酸等一部分唾液酸的羧基进行酯化。
需要说明的是，第2亲核试剂可以含有上述亲核试剂的盐。
(关于脱水缩合剂和胺的浓度)
内酯化反应溶液的脱水缩合剂的浓度例如优选为1mM～5M，更优选为10mM～3M。将碳二亚胺与HOAt、HOBt等亲核性高的添加剂并用的情况下，优选各自的浓度为上述范围。内酯化反应溶液的胺的浓度优选为0.01～20M，更优选为0.1M～10M。内酯化反应时的反应温度优选为-20℃～100℃左右，更优选为-10℃～50℃。
(进行内酯化反应的相)
内酯化反应可以以液相或固相进行。只要能够使试样与内酯化反应溶液接触，则对引发内酯化反应时的试样的状态没有特别限定，优选使供于第1酰胺化反应后的试样中含有的糖链以结合或吸附于固相载体的状态与内酯化反应溶液接触。
以固相进行反应的情况下，作为固相载体，只要可以将糖链、糖肽、糖蛋白等固定，则可以没有特别限制地使用。例如为了将糖肽、糖蛋白固定，可以使用具有环氧基、甲苯磺酰基、羧基、氨基等作为配体的固相载体。此外，为了将糖链固定，可以使用具有酰肼基、氨氧基等作为配体的固相载体。此外，也优选使糖链吸附于亲水相互作用色谱(以下称为HILIC)用的载体、即固定相，进一步优选该HILIC用的载体含有酰胺基。
通过在将试样固定于固相载体的状态下进行反应，使得反应溶液的去除、脱盐纯化更为容易，能够将试样的制备简化。此外，使用固相载体的情况下，以糖蛋白、糖肽的状态固定试样，在内酯化反应后，进行利用PNGase F等糖苷酶等的切断的话，也可以以游离糖链的形式将内酯化反应后的试样回收。
内酯化反应后的试样可以根据需要而通过公知的方法等进行纯化、脱盐、增溶、浓缩、干燥等处理。在后述的第2酰胺化反应的前后也同样。
对于试样自固相载体的游离，可以采用关于后述的第2酰胺化反应所述的条件。通过在将试样固定于固相载体的状态下进行反应，使得内酯化反应后的内酯化反应溶液的去除等更为容易，可以高效进行唾液酸的修饰。
步骤S1005结束后，进入步骤S1007。
(第2酰胺化反应)
在步骤S1007中，进行使试样与反应溶液(以下称为第2酰胺化反应溶液)接触、对步骤S1005中被内酯化的唾液酸进行酰胺化的第2酰胺化反应，取得分析用试样。
第2酰胺化反应溶液的组成、pH和反应时间选自与第1酰胺化反应同样的条件。
需要说明的是，第2酰胺化反应并不需要脱水缩合剂，但第2酰胺化反应溶液中可以含有脱水缩合剂。例如通过加入氨、胺或它们的盐而不去除在步骤S1005加入到试样中的内酯化反应溶液，从而可以制备第2酰胺化反应溶液。如此，第2酰胺化反应可以以简便的操作使所生成的内酯稳定化。
第2酰胺化反应溶液中含有的亲核试剂(称为第3亲核试剂)与上述第1亲核试剂和第2亲核试剂这两者不同。用质谱分析对通过本实施方式的分析用试样的制备方法所得到的分析用试样进行分析的情况下，选择第1亲核试剂、第2亲核试剂和第3亲核试剂以使它们全部具有不同的质量。根据质谱分析的质量分辨率选择第1亲核试剂、第2亲核试剂和第3亲核试剂，以对所得修饰体以高精度进行质量分离。第1亲核试剂、第2亲核试剂和第3亲核试剂可以是不同的物质，也可以是利用稳定同位素来使质量不同的相同物质。此外，也可以是以iTRAQ为代表的这种等量异位(isobaric)的标签。该情况下，该标签以使通过在第1级的质谱分析与第2级的质谱分析之间进行的断裂而得到的产物离子的m/z不同的方式进行设计，因此唾液酸的连接方式、内酯体的识别可以通过串联质谱分析(MS/MS)进行。如此，在对分别通过第1亲核试剂、第2亲核试剂和第3亲核试剂进行修饰的修饰体进行2级以上的质谱分析时，能够在任一级通过不同的m/z将这些修饰体分离即可。用色谱对通过本实施方式的分析用试样的制备方法所得到的分析用试样进行分析的情况下，为了易于用色谱相互分离而优选第1亲核试剂、第2亲核试剂和第3亲核试剂具有不同的取代基。
(进行第2酰胺化反应的相)
第2酰胺化反应可以以液相或固相实施。在将试样固定于固相的状态下进行第2酰胺化反应的情况下，可以将供于内酯化反应的试样维持在固定于固相的状态进行第2酰胺化反应。此外，可以将试样供于内酯化反应后，固定于固相来进行第2酰胺化反应。
以固相进行第2酰胺化反应的情况下，作为固相载体，可以使用与关于内酯化反应所述的同样的载体。对于试样在固相载体上的固定，可以使用关于内酯化反应所述的条件。以固相进行第2酰胺化反应的情况下，使第2酰胺化反应溶液作用于固定于固相载体的试样进行酰胺化后，通过化学方法、酶反应等使试样自载体游离并进行回收即可。例如可以通过PNGase F等糖苷酶、胰蛋白酶等消化酶以酶的方式将固定于载体的糖蛋白、糖肽切断并回收，也可以通过弱酸性溶液使结合于具有酰肼基的固相载体的糖链游离并进行回收。HILIC可以通过以乙腈等作为溶剂的第2酰胺化反应溶液进行第2酰胺化反应，通过水等水系溶液使试样洗脱。
通过上述制备方法，使得试样中原本含有的具有内酯结构的唾液酸在第1酰胺化反应中被第1亲核试剂修饰。α2,6-唾液酸等不易被内酯化的连接方式的唾液酸在内酯化反应中被第2亲核试剂修饰。α2,3-、α2,8-和α2,9-唾液酸等容易被内酯化的连接方式的、且在试样中原本不具有内酯结构的唾液酸在内酯化反应中内酯化，在第2酰胺化反应中被第3亲核试剂修饰。
步骤S1007结束后，进入步骤S1009。
在步骤S1009中，通过质谱分析和色谱中的至少一种来分析试样。通过上述第1酰胺化反应、内酯化反应和第2酰胺化反应，各反应中接受了内酯化以外的修饰的糖链各自的质量不同。因此，可以通过质谱分析根据分析对象的内酯结构的有无和唾液酸的连接方式将这些糖链分离。
质谱分析中的电离的方法没有特别限定，可以使用基质辅助激光解吸电离(MALDI)法、电喷雾(ESI)法、纳米电喷雾电离(nano-LSI)法等。电离的方法特别优选MALDI法。质谱分析中的电离可以使用正离子模式和负离子模式中的任一种。质谱分析可以以多级进行，由此可以适宜地分析除唾液酸的连接方式以外的糖链的结构、肽链的结构。
用色谱进行分析的情况下，优选液相色谱。液相色谱中使用的色谱柱没有特别限定，可以适当使用C30、C18、C8、C4等疏水反相柱、碳柱、HILIC用的正相柱等。对于通过多次分离来精密进行试样中的成分的分析而言优选在进行液相色谱后通过质谱分析进行测定。该情况下，更优选以在线控制在质谱仪中直接通过ESI等对来自液相色谱仪的洗脱液进行电离。
对由质谱分析或色谱得到的数据进行分析，进行试样中原本含有的含内酯结构的唾液酸的定量等。可以算出具有分析对象的含内酯结构的唾液酸的糖链的强度、含有唾液酸的糖链中具有分析对象的含内酯结构的唾液酸的糖链的比例、或者含有α2,3-唾液酸的糖链中具有分析对象的含内酯结构的α2,3-唾液酸的糖链的比例等。对于α2,8-唾液酸、α2,9-唾液酸也同样。由质谱分析或色谱得到数据的分析方法没有特别限定。
步骤S1009结束后，结束处理。
(关于糖肽和糖蛋白的副反应的抑制)
在糖肽或糖蛋白中加入第1酰胺化反应溶液、内酯化反应溶液和第2酰胺化反应溶液，如上所述对唾液酸进行了修饰的情况下，有时会在与位于糖肽或糖蛋白中含有的氨基酸的侧链、主链的末端的氨基、羧基之间发生分子内脱水缩合等副反应。该情况下，存在与分析对象的糖链对应的质谱的峰会分开、分析变难的问题。
发明人等弄清肽部分的副反应主要来源于氨基的存在，并弄清通过在修饰唾液酸前先以化学修饰等对氨基进行封闭，可以在修饰唾液酸时抑制肽部分的副反应。具体可参见以下文献：Takashi Nishikaze,Sadanori Sekiya,Shinichi Iwamoto,Koichi Tanaka.“A Universal Approach to linkage-Specific Derivatization for Sialic Acids onGlycopeptides,”Journal of The American Society for Mass Spectrometry,2017年6月,Volume 28,Issue 1Supplement,海报编号MP091。本实施方式的基于内酯化反应等的修饰也可以与此同样地用于糖肽和糖蛋白。例如对于糖肽或糖蛋白，进行二甲酰胺化、胍基化等对氨基进行封闭的反应，进行内酯化反应和第2酰胺化反应。此时，如果使用根据唾液酸的连接方式来形成内酯的方法，则也可以识别唾液酸的连接方式。
需要说明的是，糖肽中有在由氨基酸序列带来的特性方面不易发生副反应的糖肽。例如通过利用胰蛋白酶等消化酶来消化IgG的Fc区域而生成的糖肽不具有赖氨酸，N末端的氨基也在脱水缩合剂的存在下迅速环化脱水而进行焦谷氨酸化(pyroglu化)。结果，氨基不再存在，因此不需要二甲酰胺化、胍基化等事先的氨基的封闭。关于这种糖肽，通过在不进行氨基的封闭的情况下进行第1酰胺化反应、内酯化反应和第2酰胺化反应，可以得到满足分析的质谱。
(关于分析用试样的制备用试剂盒)
提供适宜在本实施方式的分析用试样的制备方法中使用的分析用试样的制备用试剂盒(以下称为制备用试剂盒)。制备用试剂盒只要包含第1酰胺化反应中的含有第1亲核试剂的溶液，则其内容没有特别限定，可以含有试剂、除试剂以外的质谱分析中使用的任意的消耗品。通过使用制备用试剂盒制备分析用试样，可以更高效地制备分析用试样。
-第2实施方式-
第2实施方式的分析用试样的制备方法以与第1实施方式的分析用试样的制备方法同样的流程进行，但与第1实施方式的不同之处在于：对于供于第1酰胺化反应后的试样，不区分唾液酸的连接方式地，换言之，对唾液酸的连接方式非特异性地，进行修饰唾液酸的反应(以下称为非特异性修饰反应)。
图2是示出本实施方式的分析用试样的制备方法的分析方法的流程的流程图。步骤S2001和S2003与上述实施方式中的步骤S1001和S1003同样，因此省略说明。步骤S2003结束后，进入步骤S2005。
在步骤S2005中，进行非特异性修饰反应，具体是使供于第1酰胺化反应后的试样与用于进行非特异性修饰反应的反应溶液(以下称为非特异性修饰反应溶液)接触，对在第1酰胺化反应前含有在试样中的不具有内酯结构的唾液酸进行修饰。非特异性修饰反应对试样中含有的各唾液酸进行修饰而与唾液酸的连接方式无关，得到分析用试样。
非特异性修饰反应溶液包含脱水缩合剂和含有醇、氨、胺或它们的盐的亲核试剂。
非特异性修饰反应溶液中含有的亲核试剂(以下称为第4亲核试剂)与第1酰胺化反应溶液中含有的第1亲核试剂不同。用质谱分析对通过本实施方式的分析用试样的制备方法所得到的分析用试样进行分析的情况下，选择第1亲核试剂和第4亲核试剂以使它们的质量不同。根据质谱分析的质量分辨率选择第1亲核试剂和第4亲核试剂，以对所得修饰体以高精度进行质量分离。如上所述，第1亲核试剂和第4亲核试剂可以是不同的物质，也可以是利用稳定同位素、等量异位标签等来使质量不同的相同物质。用色谱对通过本实施方式的分析用试样的制备方法所得到的分析用试样进行分析的情况下，由于易于用色谱相互分离而优选第1亲核试剂与第4亲核试剂具有不同的取代基。
(非特异性修饰反应中的脱水缩合剂)
作为脱水缩合剂，优选即使对存在于位阻大的部位的羧基也显示出高的反应效率的物质，优选鏻系脱水缩合剂、脲鎓系脱水缩合剂。
作为鏻系脱水缩合剂，可列举出：(苯并***-1-基氧)三-(二甲氨基)鏻(BOP)、苯并***-1-基氧三(吡咯烷基)鏻六氟磷酸盐(PyBOP)、溴三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐(BroP)、溴三(吡咯烷基)鏻六氟磷酸盐(PyBroP)、(7-氮杂苯并***-1-基氧)三(吡咯烷基)鏻六氟磷酸盐(PyAOP)、氯-三-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyCloP)等。这些被统称为“BOP试剂”的物质即使对存在于位阻大的部位的羧基也发挥高的反应效率。因此，对于如α2,3-唾液酸的羧基这样位阻大的部位也可以以高的反应效率进行酰胺化。
作为脲鎓系脱水缩合剂，可列举出：(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代乙叉基氨氧基)二甲氨基-吗啉基-碳鎓六氟磷酸盐(COMU)、2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3六氟磷酸盐(HBTU)、2-(7-氮杂苯并***-1-基)-1,1,3,3六氟磷酸盐(HATU)、2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)、2-(5-降冰片烯-2,3-二羧基酰亚胺)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TNTU)、O-(N-琥珀酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TSTU)等。这些脲鎓盐当中，特别优选COMU。
在上述当中，从提高内酯的酰胺化效率的角度来看，优选使用鏻系脱水缩合剂。此外，为了加快反应，理想的是以相对于整个反应体系为0.01～80重量％左右的浓度的方式加入N-甲基吗啉等碱。通过在反应体系中加入上述浓度范围的碱，使得反应效率提高，并且可以抑制副反应、其他试剂的析出等。在反应体系中含有N-甲基吗啉作为碱的情况下，优选其浓度为1～50重量％。酰胺化的条件(反应温度、反应时间等)没有特别限定，可以直接应用公知的唾液酸的酰胺化的条件等。
(内酯化反应中的亲核试剂(第4亲核试剂))
由于α2,3-唾液酸的羧基存在于位阻大的部位，因此为了提高亲核反应效率，优选使用分子体积小的胺作为用作亲核试剂的胺。作为非特异性修饰反应中使用的优选的胺的例子，可列举出：甲胺、乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、仲丁胺、叔丁胺等伯烷基胺；二甲胺、乙基甲胺、二乙胺、丙基甲胺、异丙基甲胺等仲烷基胺。烷基胺的碳数优选为5以下，更优选为3以下。上述胺当中，优选伯烷基胺，更优选伯直链烷基胺，特别优选甲胺或乙胺。
作为非特异性修饰反应中使用的亲核试剂，由于反应性高和副反应少而特别优选甲胺盐酸盐或乙胺盐酸盐。当中，进一步优选将甲胺盐酸盐或乙胺盐酸盐与PyAOP和N-甲基吗啉一起使用。
使用醇作为亲核试剂的情况下，没有特别限定，例如可以使用甲醇和乙醇等。非特异性修饰反应溶液的亲核试剂使用醇的情况下，唾液酸的羧基被酯化。
需要说明的是，第4亲核试剂可以含有上述亲核试剂的盐。此外，可以不使用脱水缩合剂地进行非特异性修饰反应。例如通过在以DMSO作为溶剂的溶液中使作为酯合成用烷化剂的碘甲烷反应，可以使唾液酸的羧基进行甲基酯化。具体可参照Powell等人的论文(Powell,A.K.；Harvey,D.J.RapidCommun.Mass Spectrom.1996,10(9),1027-1032)。作为其他例子，可以利用使用作为酯合成用烷化剂的MTT试剂的甲基酯化。具体可参照三浦等人的文献(Miura,Y.；Shinohara,Y.；Furukawa,J.；Nagahori,N.；Nishimura,S.-I.Chem.Eur.J.2007,13(17),4797-4804)。使用这些酯合成用烷化剂的非特异性修饰反应可以以固相和液相中的任一种相进行。
(关于脱水缩合剂和胺的浓度)
非特异性修饰反应溶液的脱水缩合剂的浓度例如优选为1mM～5M，更优选为10mM～3M。非特异性修饰反应溶液的胺的浓度优选为0.01～20M，更优选为0.1M～10M。
(进行非特异性修饰反应的相)
非特异性修饰反应与上述内酯化反应同样，可以以液相或固相实施。
以固相进行非特异性修饰反应的情况下，作为固相载体，可以使用与关于内酯化反应所述的同样的物质。对于试样在固相载体上的固定，可以使用关于内酯化反应所述的条件。对于试样自固相载体的游离，可以采用关于第2酰胺化反应所述的条件。通过在将试样固定于固相载体的状态下进行反应，使得非特异性修饰反应后的非特异性修饰反应溶液的去除、脱盐纯化等变容易，可以高效进行唾液酸的修饰。
通过上述制备方法，使得试样中原本含有的具有内酯结构的唾液酸在第1酰胺化反应中被第1亲核试剂修饰。试样中原本含有的不具有内酯结构的唾液酸在非特异性修饰反应中被第4亲核试剂修饰。
步骤S2005结束后，进入步骤S2007。步骤S2007与上述实施方式中的步骤S1007同样，因此省略说明。
上述第1和第2实施方式对试样中原本含有的含内酯结构的唾液酸进行酰胺化后，通过酰胺化或酯化对其他唾液酸进行修饰，只要用完全甲基化以外的方法对唾液酸进行修饰，则其方法没有特别限定。完全甲基化会使糖链的全部羟基甲基化，而本发明没有这种限制，可以适宜地进行适合于所进行的分析的修饰。
本发明并不限定于上述实施方式的内容。可在本发明的技术构思的范围内想到的其他方式也落在本发明的范围内。
实施例
以下给出本实施方式的实施例，但本发明并不限定于下述的实施例。需要说明的是，在下文中，％的记载在没有特别提及的情况下表示重量％。
<评价用糖链试样的制作>
为了评价上述实施方式的分析用试样的制备方法，制得含有浓度已知的唾液酸内酯的糖链试样。所制作的糖链试样分别以等摩尔含有以下的LacA2、33A2和66A2。
LacA2：含有2个被内酯化的α2,3-唾液酸的A2型糖链(A2glycan)
33A2：含有2个未被内酯化的α2,3-唾液酸的A2glycan
66A2：含有2个α2,6-唾液酸的A2glycan
各糖链试样的结构
图3的(A)是示意性示出LacA2的糖链的结构的示意图。LacA2具备由N-乙酰基-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和甘露糖(Man)形成的基本型的结构以及2个侧链。在2个侧链分别结合有GlcNAc、半乳糖(Gal)和唾液酸(NeuNAc)。在位于非还原末端的α2,3-唾液酸与结合于该唾液酸的半乳糖的结合部分形成有内酯结构，以双线B1表示该点。唾液酸的连接方式为α2,3-这一点，通过相对于该唾液酸所结合的半乳糖在左下图示唾液酸来表示。
图3的(B)是示意性示出33A2的糖链的结构的示意图。33A2具备与LacA2同样的结构，但在未形成内酯结构这一点上不同于LacA2。
图3的(C)是示意性示出66A2的糖链的结构的示意图。66A2具备与33A2同样的结构，但在于非还原末端存在α2,6-唾液酸而非α2,3-唾液酸这一点上不同于33A2。唾液酸的连接方式为α2,6-这一点，通过在该唾液酸所结合的半乳糖的左上图示唾液酸来表示。
各糖链(A2 glycan)的制作
使用PNGase F(SIGMA)使A2型糖链自α2,3-唾液酸糖肽(SGP)和α2,6-SGP(伏见制药所)游离。对含有α2,3-SGP和α2,6-SGP 1nmol/μL 20μL的管，加入PNFase F 0.25U/μL 10μL，进行敲击(tapping)和离心，在37℃下培养过夜。
用Stage Tip Carbon对游离的糖链进行脱盐处理。Stage Tip Carbon是将EmporeDisk-Carbon(3M制造)切成直径约1mm并装入200μL的吸头而得的碳柱。在Stage TipCarbon中加入100μL的ACN后，通过离心排出。然后，依次使用80％乙腈(ACN)0.1％三氟乙酸(TFA)溶液和水进行同样的操作，进行柱载体的洗涤和平衡化。然后，将酶反应溶液加入色谱柱，通过离心排出溶液。进一步将加入0.1％TFA溶液150μL后通过离心排出的操作重复3次，进行洗涤。最后，将加入20μL的60％ACN 0.1％TFA溶液并通过离心排出的操作重复2次，使糖链洗脱。将2次的洗脱液合并，通过SpeedVac(Thermo Fisher Scientific)将溶剂除去并干固。干固后，在各试样中加入200μL的H2O进行再溶解，制成100pmol/μL。对一部分进行10倍稀释，制成10pmol/μL。
LacA2、33A2和66A2的等摩尔混合物的制作
将33A2 20pmol置于管内并干固，加入含有用于进行连接方式特异性修饰的异丙胺(iPA)的内酯化反应溶液(2M iPA-HCl、500mM EDC-HCl、500mMHOBt、溶剂：DMSO)20μL，边以2000rpm搅拌边在常温下反应一小时。在该条件下，33A2完全内酯化。在反应溶液中加入ACN 120μL进行稀释，使其总共为140μL并供于酰胺纯化。
如下进行酰胺纯化。在酰胺吸头(GL Sciences Inc.)中加入100μL的H2O后，通过离心排出。然后，使用90％ACN按顺序进行同样的操作。然后，将经ACN稀释的上述反应溶液加入酰胺吸头，通过离心排出溶液。进一步将加入90％ACN 150μL后通过离心排出的操作重复2次，进行洗涤。最后，将加入20μL的H2O并通过离心排出的操作重复2次，使糖链洗脱。将2次的洗脱液合并，通过SpeedVac将溶剂除去并干固。
将酰胺纯化后的试样全部移至分别装有20pmol的33A2和66A2的管。由此，得到分别含有大致等摩尔的LacA2、33A2和66A2的评价用糖链试样，用SpeedVac使其干固。
(比较例1)
<唾液酸的修饰>
比较例1进行唾液酸的连接方式特异性酰胺化而不进行第1酰胺化。在分别含有等摩尔的LacA2、33A2和66A2的评价用糖链试样中加入上述内酯化反应溶液20μL，边以2000rpm搅拌边在常温下反应1小时反应。然后，加入作为第2酰胺化反应溶液的35％乙胺水溶液20μL，通过旋涡混合器搅拌。然后，在所得反应溶液中加入含有TFA的ACN溶液160μL，使其总共为200μL后供于酰胺纯化。
如下进行酰胺纯化。在酰胺吸头(GL Sciences Inc.)中加入100μL的H2O后，通过离心排出。然后，使用90％ACN 0.1％TFA溶液进行同样的操作。然后，将经含有TFA的ACN溶液稀释的上述反应溶液加入酰胺吸头，通过离心排出溶液。进一步将加入90％ACN 150μL后通过离心排出的操作重复2次，进行洗涤。最后，将加入20μL的H2O并通过离心排出的操作重复2次，使糖链洗脱。将2次的洗脱液合并，通过SpeedVac将溶剂除去并干固。
接着，将供于酰胺纯化后的试样供于碳纯化。在自制的Stage Tip Carbon中加入50μL的ACN后，通过离心排出。然后，使用80％ACN 0.1％TFA溶液和H2O，按顺序进行同样的操作，进行柱载体的洗涤和平衡化。然后，将再溶解于0.1％TFA20μL的试样加入色谱柱，通过离心排出溶液。进一步将加入0.1％TFA50μL后通过离心排出的操作重复3次，进行洗涤。最后，将加入10μL的60％ACN 0.1％TFA溶液并通过离心排出的操作重复2次，使糖链洗脱。将2次的洗脱液合并，通过SpeedVac将溶剂除去并干固。
<质谱分析>
使干固的糖链充分再溶解于10μL的H2O。将通过再溶解得到的溶液0.5μL滴加到μ聚焦板(Focus Plate)(Hudson Surface Technology)上(以下简称为板)。加入0.5μL作为基质的溶解于50％ACN的100mM 3-氨基喹啉/对香豆酸(3AQ/CA)、2mM磷酸二氢铵(ADP)，使整个板在加热块上在75℃下反应1.5小时，进行基于3AQ的糖链的还原末端的标签化。反应结束后，将板恢复至室温，使用MALDI-QIT-TOF-MS(AXIMA-Resonance(Shimadzu/Kratos))以负离子模式进行飞行时间型质谱分析。
将所得质谱示于图4。m/z 2527.9的峰相当于经异丙基酰胺化的唾液酸，是对应于66A2的峰。m/z 2499.9相当于经乙基酰胺化的唾液酸，可以解释为LacA2和33A2这两方都被乙基酰胺化，作为具有相同的m/z的物质被一起检出。因此，本比较例的方法未能将试样中原本含有的含内酯结构的糖链与不含内酯结构的糖链相区别。
(实施例1-1)
<唾液酸的修饰>
实施例1-1将试样供于第1酰胺化反应后，进行连接方式特异性酰胺化(内酯化反应和第2酰胺化反应)。在分别含有等摩尔的LacA2、33A2和66A2的评价用糖链试样中加入20μL作为第1酰胺化反应溶液的10％甲胺水溶液，充分搅拌使其再溶解。用SpeedVac使通过再溶解得到的溶液干固并去除溶剂。在干固的试样中加入20μL上述内酯化反应溶液，边以2000rpm搅拌边在常温下反应1小时。在所得反应溶液中加入20μL作为第2酰胺化反应溶液的35％乙胺水溶液，通过旋涡混合器搅拌。在反应溶液中加入含有TFA的ACN溶液160μL，使其总共为200μL并供于酰胺纯化、碳纯化和质谱分析。酰胺纯化、碳纯化和质谱分析与比较例1同样进行。
将所得质谱示于图5。m/z 2527.9的峰相当于经异丙基酰胺化的唾液酸，是对应于66A2的峰。m/z 2499.9的峰相当于经乙基酰胺化的唾液酸，是对应于33A2的峰。m/z 2471.9的峰相当于经甲基酰胺化的唾液酸，是对应于LacA2的峰。如此，通过预先对内酯进行酰胺化后再进行唾液酸连接方式特异性修饰，可以针对试样中原本就被内酯化的α2,3-唾液酸、原本未被内酯化的α2,3-唾液酸和α2,6-唾液酸分别形成质量不同的修饰体，可以用质谱分析识别各自的峰。
(实施例1-2)
<唾液酸的修饰>
实施例1-2将试样供于第1酰胺化反应后，使试样结合于固相载体，在固相载体上进行连接方式特异性酰胺化(内酯化反应和第2酰胺化反应)。在分别含有等摩尔的LacA2、33A2和66A2的评价用糖链试样中加入20μL作为第1酰胺化反应溶液的10％甲胺水溶液，充分搅拌使其再溶解。用SpeedVac使通过再溶解得到的溶液干固并去除溶剂。将所得试样再溶解于20μL的H2O，使其与具有酰肼基作为配体的固相载体(糖链纯化试剂盒BlotGlyco(SUMITOMO BAKELITE Co.,Ltd.)中包括的载体、下同)结合。糖链的结合按照BlotGlyco的标准规程进行。将结合糖链后的载体用200μL的DMSO洗涤3次。然后，在载体中加入100μL的上述内酯化反应溶液，边以700rpm搅拌边反应1小时。通过离心去除液体后用200μL的甲醇进行3次洗涤。在洗涤后的载体中加入100μL作为第2酰胺化反应溶液的18％乙胺水溶液，轻轻搅拌后通过离心去除溶剂，用200μL的H2O洗涤3次。按照BlotGlyco的标准规程使糖链试样自载体游离，用SpeedVac使其干固。将干固的试样供于碳纯化和质谱分析。碳纯化和质谱分析与比较例1同样进行。
将所得质谱示于图6。可知，与实施例1-1相同地，LacA2、33A2和66A2全部作为对应于不同的m/z的峰的物质被观测到，成功进行了区别。如此，在结合于固相载体的状态下进行上述第1实施方式中的一部分反应，也成功得到了良好的结果。
(比较例2)
<唾液酸的修饰>
比较例2进行唾液酸的连接方式非特异性酰胺化(非特异性修饰反应)而不进行第1酰胺化。在分别含有等摩尔的LacA2、33A2和66A2的评价用糖链试样中加入非特异性修饰反应溶液(500mM乙胺盐酸盐、50mM PyAOP、3％N-甲基吗啉、溶剂：DMSO)20μL，边以2000rpm搅拌边在常温下反应1小时。在反应溶液中加入ACN和TFA，使其总共为200μL并供于酰胺纯化、碳纯化和质谱分析。酰胺纯化、碳纯化和质谱分析与比较例1同样进行。
将所得质谱示于图7。m/z 2499.9的峰相当于经乙基酰胺化的唾液酸，LacA2、33A2和66A2全部以经乙基酰胺化的状态在该峰中重复观测到。在此，由于采用了唾液酸连接方式非特异性修饰，因此不仅无法辨别α2,3-唾液酸与α2,6-唾液酸，而且会对试样中原本含有的内酯也进行同样的修饰。因此，LacA2、33A2和66A2全部形成具有相同m/z的物质，无法将它们辨别。
(实施例2-1)
<唾液酸的修饰>
实施例2-1将试样供于第1酰胺化反应后，进行连接方式非特异性酰胺化(非特异性修饰反应)。在分别含有等摩尔的LacA2、33A2和66A2的评价用糖链试样中加入20μL作为第1酰胺化反应溶液的10％甲胺水溶液，充分搅拌使其再溶解。用SpeedVac使通过再溶解得到的溶液干固并去除溶剂。在干固的试样中加入20μL上述非特异性修饰反应溶液，边以2000rpm搅拌边在常温下反应1小时。在反应溶液中加入ACN和TFA，使其总共为200μL并供于酰胺纯化、碳纯化和质谱分析。
将所得质谱示于图8。m/z 2499.9的峰相当于经乙基酰胺化的唾液酸，是对应于33A2和66A2的峰。m/z 2471.9的峰相当于经甲基酰胺化的唾液酸，是对应于LacA2的峰。如此，通过预先对内酯进行酰胺化后再进行唾液酸连接方式非特异性修饰，可以针对在试样中原本就被内酯化的唾液酸和未被内酯化的唾液酸分别形成质量不同的修饰体，可以用质谱分析识别各自的峰。
(实施例2-2)
<唾液酸的修饰>
实施例2-2将试样供于第1酰胺化反应后，使试样与固相载体结合，在固相载体上进行连接方式非特异性酰胺化(非特异性修饰反应)。在分别含有等摩尔的LacA2、33A2和66A2的评价用糖链试样中加入20μL作为第1酰胺化反应溶液的10％甲胺水溶液，充分搅拌使其再溶解。用SpeedVac使通过再溶解得到的溶液干固并去除溶剂。将试样再溶解于20μL的H2O，使其与具有酰肼基作为配体的上述固相载体(BlotGlyco)结合。糖链的结合按照BlotGlyco的标准规程进行。将结合糖链后的载体用200μL的DMSO洗涤3次后，在洗涤后的载体中加入100μL的上述非特异性修饰反应溶液，边以700rpm搅拌边反应1小时。通过离心去除液体后，对载体用200μL的甲醇进行3次洗涤，进一步用200μL的H2O洗涤3次。然后，按照BlotGlyco的标准规程使反应后的糖链试样自载体游离，用SpeedVac使其干固。将干固的试样供于碳纯化和质谱分析。碳纯化和质谱分析与比较例1同样进行。
将所得质谱示于图9。可知，与实施例2-1相同地，对应于LacA2的峰以及对应于33A2和66A2的峰作为不同的m/z的峰被观测到，成功进行了区别。如此，在结合于固相载体的状态下进行上述第2实施方式中的一部分反应，也成功得到了良好的结果。
<针对氨解的研究>
以下实施例并非是如上述实施方式的分析用试样的制备方法那样对试样中原本含有的内酯进行修饰的，而是示出通过含有胺的溶液引发在糖链的唾液酸中形成的内酯的氨解这一点的。在以下记载中，“内酯化反应”和“酰胺化反应”分别对应于上述实施方式的“内酯化反应”和“第2酰胺化反应”。“酰胺化反应溶液”是根据与上述实施方式中的第1酰胺化反应溶液或第2酰胺化反应溶液同样的条件选出的。
<酰胺化反应中的胺的浓度的研究>
作为试样，使用通过PNGase F从α2,3-唾液酸所结合的α2,3-SGP切出糖链并使其游离而得到的物质。唾液酸糖肽为糖链与几个残基的肽结合而成。使试样与由具有酰肼基作为配体的珠形成的固相载体(BlotGlyco：SUMITOMO BAKELITE Co.,Ltd.)结合。糖链与固相载体的结合按照糖链纯化试剂盒BlotGlyco的标准规程进行。
将结合糖链后的载体用200μL的DMSO洗涤3次。然后，加入含有异丙胺的100μL的内酯化反应溶液(2M异丙胺盐酸盐、500mM EDC-HCl、500mM HOBt)，边以800rpm轻轻搅拌边反应一小时。(由此，使α2,6-唾液酸转换成异丙基酰胺，使α2,3-唾液酸转换成内酯体。)通过离心去除反应溶液后，用200μL的甲醇进行1次洗涤。然后，用200μL的甲胺水溶液(浓度0.1％～10％)洗涤3次，由此进行内酯的酰胺化反应。接着，用200μL的甲醇进行2次洗涤以及用200μL的水进行3次洗涤。然后，以按照标准规程的方法使反应后的糖链试样自载体游离，用Stage Tip Carbon进行脱盐纯化，通过离心浓缩(SpeedVac)使其干固。将干固的试样再溶解于10μL的水，将1μL滴加到聚焦板上，加入0.5μL作为基质的溶解于50％乙腈(ACN)的100mM 3AQ/CA、2mM硫酸铵后，在75℃的加热块上反应1.5小时，进行基于3AQ的糖链的还原末端的标签化。反应结束后，将板冷却至室温，通过MALDI-QIT-TOF-MS(AXIMA-Resonance、Shimadzu/Kratos)以负离子模式进行飞行时间型质谱分析。
图10是示出以1％(a)和10％(b)的甲胺水溶液作为酰胺化反应溶液引发氨解时的质谱的图。作为试样的自α2,3-SGP游离的33A2(相当于图3的(B))通过上述内酯化反应溶液进行分子内脱水缩合而转换成内酯体(相当于图3的(A))。在此，然后不使用脱水缩合剂而仅用甲胺溶液洗涤酰肼珠，可知原本为内酯的结构发生了甲基酰胺化(相当于m/z 2471.9的峰)。在m/z 2360.9观测到的峰是一处未结合甲胺而形成了羧基的峰。推测该峰并非对应于内酯的氨解而是对应于发生了水解的糖链。使用10％甲胺水溶液的酰胺化反应中，来源于该水解的峰进一步变小，基本只发生了氨解。
图11是示出针对相对于酰胺化反应溶液中的甲胺的浓度、根据质谱上的峰的信号强度算出的发生水解的唾液酸与发生氨解的唾液酸的比例(氨解效率)图表。可知，即使在甲胺溶液的浓度为1％的情况下也发生了充分的氨解，而通过使用含有更高浓度的甲胺的酰胺化反应溶液，可以更高效地引发氨解。
<酰胺化反应中的胺的种类的研究>
图12是示出在与针对胺浓度的上述研究大致相同的条件下分别使用3M的氨水或烷基胺水溶液(为甲胺的情况下，相当于10％浓度)作为酰胺化反应溶液进行酰胺化反应时的生成比的图表。
从图12的结果来看的话，氨和不具有支链的伯烷基胺的情况下，可以高效引发氨解，异丙胺、叔丁胺等具有支链的烷基胺的氨解效率低，水解(-COOH生成)占优。此外，在酰胺化反应溶液使用叔胺的情况下，由于本来即使在脱水缩合剂的存在下也不反应，因此仅发生水解，而在使用仲胺的情况下也不太反应，水解的发生占优。此外，对于烯丙胺和乙醇胺，氨解的发生占优。因此发现，如果为至少在烃链部分不具有支链的伯胺，则可以含有其他官能团，也可以含有双键、羟基。由上可知，要想引发氨解，碳链中不具有支链的伯胺是特别合适的。
<酰胺化反应中的溶剂的研究>
图13是示出在与上述研究大致相同的条件下使用溶解于90％ACN的1.2M甲胺、溶解于甲醇的3M甲胺或溶解于ACN的3M乙醇胺等作为酰胺化反应溶液的生成比的图表。
从图13的结果来看的话，在任一情况下均以高比例发生氨解，主要观察到与经酰胺化的糖链对应的峰。即使是实质上不含水的状态的甲醇、溶解于ACN的胺也没有问题地发生了酰胺化，由此给出很强的启示：内酯并非是先暂且水解后再酰胺化的，而是发生了通过胺直接作用于内酯来进行酰胺化的氨解。在实质上不含水的条件下，水解进一步受到抑制，即使在酰胺化反应溶液使用制成水溶剂时会有5％左右的唾液酸发生水解的乙醇胺的情况下也几乎全部酰胺化。
<酰胺化反应中的pH的研究>
图14是示出在与上述研究大致相同的条件下使用以任意的比例将3M甲胺水溶液与3M甲胺盐酸盐水溶液混合而得的溶液作为酰胺化反应溶液时的生成比的图表。图14的”MA”表示甲胺水溶液，”MA-HCl”表示甲胺盐酸盐水溶液。
本研究假定：即使在试样中加入酰胺化反应溶液后，在一部分条件下，α2,3-唾液酸也以仍具有内酯的形态残留。因此，为了进一步对不稳定的内酯进行定量评价，在试样中加入酰胺化反应溶液进行酰胺化反应后，用200μL的H2O洗涤2次、用200μL的ACN洗涤2次，然后用含有溶解于ACN的3M乙醇胺的酰胺化反应溶液再次进行酰胺化反应。在以2阶段进行的酰胺化反应的条件下，能够明确区别在第一阶段的酰胺化反应中酰胺化的物质(通过甲基酰胺化体检测)、水解的物质(通过-COOH检测)和仍以内酯的形态残留的物质(通过与乙醇胺的酰胺化体检测)。需要说明的是，本研究中的酰胺化反应并非如之前那样用200μL的酰胺化反应溶液洗涤3次，而是通过加入100μL的酰胺化反应溶液并以700rpm搅拌2分钟来进行。
从图14的结果来看的话，在未加入酰胺化反应溶液的情况下(“无氨解(withoutaminolysis)”)、以3M甲胺盐酸盐溶液(pH 4.7)作为酰胺化反应溶液的情况下，几乎不发生氨解，唾液酸实质上仍全部为内酯。如果增加制备酰胺化反应溶液时的甲胺溶液的比例来提高pH，则唾液酸会发生缓慢水解和氨解，唾液酸在pH 8.8进行90％左右的酰胺化，用pH10.3以上的酰胺化反应溶液的话实质上全部酰胺化。
<以自胎球蛋白(fetuin)游离的糖链作为试样的酰胺化反应的研究>
将糖蛋白的胎球蛋白溶解于20mM碳酸氢铵、10mM DTT 0.02％SDS，在100℃下处理3分钟，进行改性和还原。然后，冷却至室温，加入PNGase F，在37℃下培养过夜，使糖链游离。翌日，通过在100℃下进行3分钟的热处理使PNGase F失活来停止酶反应。
游离的糖链与上述研究同样进行与酰肼珠的结合以及使用含有异丙胺的内酯化反应溶液的连接方式特异性修饰，接着，进行基于10％甲胺水溶液的酰胺化反应。按与上述研究同样的方法进行从珠的洗脱、用质谱分析的检测。
图15是自胎球蛋白游离的糖链的质谱。关于与各峰对应显示的数字，左侧的数字表示与峰对应的分子所含有的α2,3-唾液酸的数量，右侧的数字表示该分子所含有的α2,6-唾液酸的数量。可知，未检测出基于水解的产物、未反应物，对经内酯化的唾液酸高效进行了甲基酰胺化。将该质谱与专利文献1、非专利文献3中报告的质谱相比较的话可知，即使不进行使用脱水缩合剂的酰胺化反应，通过氨解也高效地直接对内酯进行了甲基酰胺化。
<在HILIC载体上的酰胺化反应的研究>
将α2,3-SGP溶解于20mM碳酸氢铵，加入PNGase F在7℃下培养整晚，由此使糖链游离。翌日，通过在100℃下进行3分钟的热处理使PNGase F失活来使酶反应停止。然后，用Stage Tip Carbon进行脱盐处理，通过SpeedVac在微量离心管(Eppendorf tube)内干固。
然后，加入含有20μL的异丙胺的内酯化反应溶液(2M异丙胺盐酸盐、500mM EDC-HCl、500mM HOBt)，边以2000rpm搅拌边反应一小时。此后，用120μL ACN稀释，加入到酰胺吸头(GL science)中以4000xg进行离心，由此进行液体流通并使糖链吸附于含有酰胺基的HILIC用的载体。然后，以20～200μL的90％ACN 4％甲胺溶液作为酰胺化反应溶液进行液体流通来进行酰胺化反应。进一步通过使90％ACN 0.1％TFA100μL进行2次液体流通来进行洗涤，最后进行20μL H2O的2次液体流通来使糖链洗脱，用SpeedVac使洗脱液干固。然后，进一步用Stage Tip Carbon进行脱盐操作，如上述研究那样进行点靶(on target)3AQ化，进行质谱分析。
图16的(a)、图16的(b)、图16的(c)和图16的(d)是示出各酰胺化反应溶液的量与生成比的图表。确认到在图16的(a)、图16的(b)、图16的(c)和图16的(d)的全部的情况下基本完全进行了氨解。在将酰胺化反应溶液减少至20μL的状态下，认为载体与酰胺化反应溶液接触的时间最长也就数十秒左右，启示了氨解的反应极其迅速地发生。
<使用HILIC的纯化后的酰胺化反应的研究>
通过与上述研究同样的操作将糖链从α2,3-SGP切出并使其游离，对该糖链加入含有异丙胺的内酯化反应溶液进行反应，加入ACN稀释并使其吸附在HILIC载体上。然后，通过使90％ACN 0.1％TFA溶液100μL进行2次液体流通来进行洗涤，最后进行H2O 20μL的2次液体流通使糖链洗脱。向其中加入40％甲胺水溶液6.7μL制成甲胺的最终浓度为10％的酰胺化反应溶液，轻轻搅拌后在室温下静置2分钟进行酰胺化反应。然后，通过SpeedVac去除溶剂，进一步用Stage Tip Carbon进行脱盐操作，如上述研究那样采用点靶3AQ化进行质谱分析。
结果示于图16的(e)。试样中的内酯基本发生了甲基酰胺化，但也检测出基于水解的产物。可以解释为这是由于，通过HILIC载体将含有异丙胺的内酯化反应溶液去除后，在洗涤载体的工艺中内酯发生了一部分水解。因此，可以对自HILIC载体洗脱的试样加入酰胺化反应溶液，从实质上全部内酯发生氨解、使反应效率最大化的角度来看，优选将试样以吸附于HILIC载体的状态加入酰胺化反应溶液。