阅读说明：本技术 一种定量检测微囊藻的标准品及制备、检测方法 (Standard substance for quantitatively detecting microcystis and preparation and detection methods thereof ) 是由 陈蕾 姜巍巍 姜蕾 于 2019-11-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种定量检测微囊藻的标准品及制备、检测方法,该检测方法包括：步骤一,根据实验优化定量PCR反应条件；步骤二,以重组质粒为标准品模板,根据优化后的定量PCR反应条件用实时定量PCR进行PCR扩增,建立标准品的浓度与临界循环数对应的标准曲线,该重组质粒为包含M16基因的重组质粒或重组细胞,该M16基因的序列由97个脱氧核糖核苷酸组成,为序列表SEQ IDNO.1中的序列；步骤三,用待测样品替换步骤二中的标准品,根据优化后的定量PCR反应条件进行实时定量PCR扩增,根据扩增结果的临界循环数和标准曲线,得到待测样品中微囊藻的数量,通过本发明,可实现水环境样品中微囊藻的快速定量检测。(The invention discloses a standard substance for quantitatively detecting microcystis and a preparation and detection method thereof, wherein the detection method comprises the following steps: step one, optimizing quantitative PCR reaction conditions according to experiments; secondly, using the recombinant plasmid as a standard template, performing PCR amplification by using real-time quantitative PCR according to optimized quantitative PCR reaction conditions, and establishing a standard curve corresponding to the concentration of the standard and the critical cycle number, wherein the recombinant plasmid is a recombinant plasmid or a recombinant cell containing M16 gene, and the sequence of the M16 gene consists of 97 deoxyribonucleotides and is a sequence in a sequence table SEQ ID NO. 1; and step three, replacing the standard substance in the step two with the sample to be detected, carrying out real-time quantitative PCR amplification according to the optimized quantitative PCR reaction conditions, and obtaining the quantity of the microcystis in the sample to be detected according to the critical cycle number and the standard curve of the amplification result.)

一种定量检测微囊藻的标准品及制备、检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种定量检测微囊藻的标准品及制备、检测方法。

背景技术

水体富营养化引起的蓝藻水华，在我国已日趋严重。一些大型湖泊、水库，如太湖、淀山湖、滇池、玄武湖、三峡水库等，每年夏秋季都会爆发蓝藻水华。水华爆发时在水面形成的“绿色浮渣”散发腥臭味，影响娱乐水体的生态景观、影响供水水体的饮用水安全。

在众多富营养化的湖泊、水库中，微囊藻是一个重要的优势种群，它也是全球湖泊水体中分布广、规模大、持续长的一类水华蓝藻。一些微囊藻，如铜绿微囊藻、绿色微囊藻、惠氏微囊藻等，可产生和释放微囊藻毒素，威胁野生动物、家畜、家禽的生命安全。一些浮游动物、鱼类对微囊藻毒素有很大的耐受性，但是微囊藻毒素可在其体内富集，最终通过生态系统、食物链对人类造成潜在威胁。一些不产毒的微囊藻，可增加湖泊水库蓝藻水华发生的频率和严重程度。因此，实有必要加强对湖泊、水库水体中微囊藻的检测，为保护生态环境和保证饮用水安全提供科学依据。

发明内容

为克服上述现有技术存在的不足，本发明之目的在于提供一种定量检测微囊藻的标准品及制备、检测方法，以实现水环境样品中微囊藻的快速定量检测，为保护生态环境和保证饮用水安全提供科学依据。

为达上述目的，本发明提出一种定量检测微囊藻的标准品，所述标准品为包含M16基因的重组质粒或重组细胞，所述M16基因的序列由97个脱氧核糖核苷酸组成，为序列表SEQ IDNO.1中的序列。

优选地，所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。

为达到上述目的，一种上述标准品的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，针对M16基因设计特异性的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，上游引物为SEQ IDNO.2，下游引物为SEQ IDNO.3；

步骤二，取地表水水样，利用DNA提取试剂盒进行总DNA提取纯化，得到DNA样本；

步骤三，以步骤二中的DNA样本为模板进行PCR扩增；

步骤四，对PCR扩增产物进行纯化；

步骤五，将纯化后的PCR扩增产物与质粒载体pMD18-T链接，获得转化了质粒的白色菌落；

步骤六，选取饱满的单菌落接种于培养液中培养过夜，并利用质粒提取试剂盒提取质粒，获得大量的质粒标准品，以用于菌液PCR鉴定和测序分析。

优选地，于步骤六后，所述方法还包括：

将获得的大量质粒标准品用pH 8.0的1×TE缓冲液梯度稀释后，利用超微量核酸蛋白测定仪测定质粒标准品的浓度，计算质粒的拷贝数，计算后确定质粒标准品的拷贝数为5.88×10⁸copies/μL。

优选地，于步骤三中，采用反应体系为50μL，引物信息为：上游引物为SEQ IDNO.2，下游引物为SEQ IDNO.3，反应程序为：95℃预变性5分钟，随后95℃15秒，退火温度60℃45秒和72℃延伸40秒，进行45个循环，最终72℃延伸10分钟，并通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。

为达到上述目的，本发明还提供一种定量检测微囊藻的方法，包括如下步骤：

步骤一，根据实验优化定量PCR反应条件；

步骤二，以重组质粒为标准品模板，根据优化后的定量PCR反应条件用实时定量PCR进行PCR扩增，建立标准品的浓度与临界循环数对应的标准曲线，所述重组质粒为包含M16基因的重组质粒或重组细胞，所述M16基因的序列由97个脱氧核糖核苷酸组成，为序列表SEQ IDNO.1中的序列；

步骤三，用待测样品替换步骤二中的标准品，根据优化后的定量PCR反应条件进行实时定量PCR扩增，根据扩增结果的临界循环数和标准曲线，得到待测样品中M16基因的拷贝数，即得到所述待测样品中微囊藻的数量。

优选地，所述实时定量PCR扩增的体系包括实时定量PCR扩增缓冲液、引物对和模板，所述引物对包括：上游引物为SEQ IDNO.2，下游引物为SEQ IDNO.3，所述上游引物、下游引物在反应体系中的浓度均为0.1～0.3μM/L。

优选地，于步骤二中，将质粒标准品进行若干倍梯度稀释，作为定量PCR模板DNA，进行实时定量PCR扩增，按照试剂盒说明进行操作，加入实时定量PCR试剂，所述PCR试剂包括所述实时定量PCR扩增缓冲液、引物对，所述PCR反应体系为20μL，加入2μL质粒标准品作为反应模板，进行实时定量PCR反应，采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃15秒；PCR反应，45个循环，95℃5秒，60℃45秒，以去离子水作为阴性对照，以标准品稀释梯度的对数值为横坐标，以临界循环数为纵坐标建立实时定量PCR的标准曲线。

优选地，所述标准品模板在所述实时定量PCR扩增的体系中的浓度为5.88×10^1-5.88×10⁸copies/μL。

优选地，于步骤一中，确定所述基因M16引物的最佳退火温度为60℃，最佳引物浓度为0.2μM/L。

与现有技术相比，本发明一种定量检测微囊藻的标准品及制备、检测方法针对M16基因设计特异性引物，通过制备外标准品、优化实时定量PCR反应条件，采用实时定量PCR方法定量检测水环境中微囊藻，本发明的定量检测微囊藻的标准品具有广谱识别和特异性相结合的特点，敏感性高，制备方法简便，可以长期保存，纯度好，线性检测范围宽，可以用于水环境样品中微囊藻的快速定量检测。

附图说明

图1为本发明第二实施例一种定量检测微囊藻的标准品的制备方法的步骤流程图；

图2为本发明第三实施例一种定量检测微囊藻的方法的步骤流程图；

图3为本发明具体实施例中定量PCR标准品的扩增曲线；

图4为本发明具体实施例中标准品的溶解曲线。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例并结合附图说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明亦可通过其它不同的具体实例加以施行或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用，在不背离本发明的精神下进行各种修饰与变更。

在本发明第一实施例中，本发明一种定量检测微囊藻的标准品为含有M16基因的重组质粒；所述M16基因的序列为序列表SEQ IDNO.1中的序列，所述重组质粒中的出发质粒为pMD-18T。

图1为本发明第二实施例一种定量检测微囊藻的标准品的制备方法的步骤流程图。如图1所示，本发明一种定量检测微囊藻的标准品的制备方法，包括如下步骤：

步骤101，针对M16基因设计特异性的引物。

具体地，在GenBank(美国国家生物技术信息中心National Center forBiotechnology Information，NCBI)中下载M16基因序列，进行同源性比较分析，设计和合成特异性的引物，PCR产物长度为97bp(具体见SEQ IDNO.1)。引物序列如下：上游引物为5’-AGTTGGTGGGGTAAGAGCCTA-3’(SEQ IDNO.2)，下游引物为5’-CGTAGGAGTCTGGGCCGTG-3’(SEQIDNO.3)。用无菌双蒸水将引物配制成100μM的储存液，分装，于-20℃保存。

步骤102，获取地表水水样，利用DNA提取试剂盒进行总DNA提取纯化，得到DNA样本。

步骤103，以步骤102中的DNA样本为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL。反应程序为：95℃预变性5min，随后95℃15s，退火温度60℃ 45s和72℃延伸40s，进行45个循环，最终72℃延伸10min，并通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。

步骤104，对PCR扩增产物进行纯化。具体地，可利用Axygen的DNA柱式胶回收试剂盒进行胶回收，对PCR扩增产物进行纯化，通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认回收是否成功。

步骤105，将纯化后的PCR扩增产物与质粒链接，获得转化了质粒的白色菌落。具体地，将上述纯化后的PCR扩增产物与质粒载体pMD18-T连接，并进一步转化到DH5α感受态大肠杆菌溶液，然后涂布到加入Amp抗性的LB固体培养基上，通过蓝白斑筛选，挑选转化了质粒的白色菌落。

步骤106，选取饱满的单菌落(即挑选步骤105中转化好的单个白色菌落)接种于含有Amp的液体LB培养液中，于37℃、200转/分钟振荡培养过夜，并利用质粒提取试剂盒提取质粒，获得大量的质粒标准品，以用于菌液PCR鉴定和测序分析。

步骤107，质粒的检测：将上述获得的大量质粒标准品用pH 8.0的1×TE缓冲液梯度稀释后，利用超微量核酸蛋白测定仪(NanoDrop ND-2000C，美国)测定质粒标准品的浓度，计算质粒的拷贝数，计算后确定质粒标准品的拷贝数为5.88×10⁸copies/μL。

图2为本发明第三实施例一种定量检测微囊藻的方法的步骤流程图。如图2所示，本发明一种定量检测微囊藻的方法，包括如下步骤：

步骤201，根据实验，优化定量PCR反应条件。

利用第二实施例提取的DNA样本作为模板。按照

Premix Ex Taq^TM试剂盒说明进行操作，加入实时定量PCR所需试剂，反应体系为20μL，2μLDNA样品，设立阴性对照和阳性对照。

应用ABI公司的Stepone plus Detection System进行实时定量PCR反应，采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃15s；PCR反应，45个循环，95℃5s，60℃45s。

实验结果表明，基因M16引物的最佳退火温度为60℃，最佳引物浓度为0.2μM/L，扩增效果最好。

步骤202，以重组质粒为标准品模板，根据优化的定量PCR反应条件用实时定量PCR进行PCR扩增，建立标准品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线。

所述实时定量PCR扩增体系由实时定量PCR扩增缓冲液、引物对和模板组成；所述引物对包括上下游引物，上下游引物在反应体系中的浓度均为0.1～0.3μM/L(以0.2μM/L为最佳)，上游引物为5’-AGTTGGTGGGGTAAGAGCCTA-3’(SEQ IDNO.2)，下游引物为5’-CGTAGGAGTCTGGGCCGTG-3’(SEQ IDNO.3)。

具体地，将本发明第二实施例得到的质粒标准品进行10倍梯度稀释，作为定量PCR模版DNA，进行实时定量PCR扩增，即按照试剂盒(如

Premix Ex Taq^TM))说明进行操作，加入实时定量PCR试剂，所述PCR试剂包括实时光定量PCR扩增缓冲液、引物对(所述引物对中上下游引物在试剂中的浓度均为0.2μM/L)，PCR反应体系为20μL，加入2μL质粒标准品作为反应模板，最终浓度为5.88×10^1-5.88×10⁸copies/μL，进行实时定量PCR反应，采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃15秒；PCR反应，45个循环，95℃5秒，60℃45秒，以去离子水作为阴性对照，以标准品稀释梯度的对数值为横坐标，以临界循环数(Threshold Cycle，Ct)为纵坐标建立实时定量PCR的标准曲线。

在本发明具体实施例中，所述标准品模板在所述实时定量PCR扩增的体系中的浓度为5.88×10²copies/μL、5.88×10³copies/μL、5.88×10⁴copies/μL、5.88×10⁵copies/μL、5.88×10⁶copies/μL和5.88×10⁷copies/μL。

步骤203，用待测样品替换步骤202中的标准品，根据优化的定量PCR反应条件进行实时定量PCR扩增，根据扩增结果的临界循环数和标准曲线，得到待测样品中M16基因的拷贝数，即得到待测样品中微囊藻的数量。

具体地，取地表水水样，利用DNA提取试剂盒进行总DNA提取纯化，得到DNA样本作为待测样品，用待测样品替换步骤202中的标准品，进行实时定量PCR扩增，即按照试剂盒(如

Premix Ex Taq^TM))说明进行操作，加入实时定量PCR所需试剂，所述PCR试剂包括实时光定量PCR扩增缓冲液、引物对(所述引物对中上下游引物在试剂中的浓度均为0.2μM/L)，反应体系为20μL，2μLDNA样品，设立阴性对照和阳性对照，进行实时定量PCR反应，采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃15秒；PCR反应，45个循环，95℃5秒，60℃45秒，根据扩增结果的临界循环数和标准曲线，得到待测样品中M16基因的拷贝数，即得到待测样品中微囊藻的数量。

以下将通过具体实施例来进一步说明本发明：

实施例一、定量检测微囊藻质粒标准品的制备

1、针对M16基因设计特异性的引物

在GenBank中下载M16基因序列，进行同源性比较分析，设计和合成特异性的引物，PCR产物长度为97bp(SEQ IDNO.1)。引物序列如下：上游引物为5’-AGTTGGTGGGGTAAGAGCCTA-3’(SEQ IDNO.2)，下游引物为5’-CGTAGGAGTCTGGGCCGTG-3’(SEQIDNO.3)。用无菌双蒸水将引物配制成100μM的储存液，分装，于-20℃保存。

2、样品中总基因组DNA的提取

利用DNA提取试剂盒进行总DNA提取纯化，得到DNA样本。

3、质粒标准品制备

1)目的片段的制备

以步骤2中的DNA样本为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL。反应程序为：95℃预变性5min，随后95℃15s，退火温度60℃ 45s和72℃延伸40s，进行45个循环，最终72℃延伸10min。通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。

2)PCR产物纯化

对目标基因进行纯化：利用Axygen的DNA柱式胶回收试剂盒进行胶回收，对目标基因进行纯化，通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认回收是否成功。

3)PCR产物与质粒链接

将上述纯化后的PCR产物与质粒载体pMD18-T连接，并进一步转化到DH5α感受态大肠杆菌溶液，然后涂布到加入Amp抗性的LB固体培养基上，通过蓝白斑筛选，挑选转化了质粒的白色菌落。

4)PCR鉴定阳性克隆和测序分析

选取饱满的单菌落接种于含有Amp的液体LB培养液中，于37℃、200转/min振荡培养过夜，用于菌液PCR鉴定和测序分析。

5)质粒标准品的大量获得

将转化了质粒接种于含有Amp的液体LB培养液中，过夜培养，利用质粒提取试剂盒提取质粒，获得大量的质粒标准品。即所述标准品为含有M16基因的重组质粒，所述M16基因的序列为序列表SEQ IDNO.1中的序列，所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。

6)质粒的检测

将上述获得的大量质粒标准品用pH 8.0的1×TE缓冲液梯度稀释后，利用超微量核酸蛋白测定仪(NanoDrop ND-2000C，美国)测定质粒标准品的浓度，计算质粒的拷贝数。计算后确定质粒标准品的拷贝数为5.88×10⁸copies/μL。

实施例二、定量PCR检测

1、定量PCR反应条件的优化

利用实施例一中提取的DNA样本作为模板。按照Premix Ex Taq^TM试剂盒说明进行操作，加入实时定量PCR所需试剂，反应体系为20μL，2μLDNA样品。设立阴性对照和阳性对照。

应用ABI公司的Stepone plus Detection System进行实时定量PCR反应，采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃15s；PCR反应，45个循环，95℃5s，60℃45s。

实验结果表明，基因M16引物的最佳退火温度为60℃，最佳引物浓度为0.2μM/L，扩增效果最好。

2、定量PCR检测限、定量区间及标准曲线

将实施例一得到的质粒标准品进行10倍梯度稀释，作为定量PCR模版DNA。PCR反应体系为20μL，加入2μL质粒标准品作为反应模板，最终浓度为5.88×10^1-5.88×10⁸copies/μL。以上述优化后的最佳条件进行定量PCR反应。以去离子水作为阴性对照。以标准品稀释梯度的对数值为横坐标，以临界循环数(Threshold Cycle，Ct)为纵坐标建立实时定量PCR的标准曲线。

标准品PCR扩增曲线如图3所示，目的基因的指数扩增期和平台期都十分明显，荧光定量动力学曲线平滑，扩增曲线平滑，说明本发明PCR方法扩增效果较好，可用于定量分析。

利用定量PCR反应条件检测质粒标准品，最低检测限为5.88×10¹copies/μL，定量检测区间为5.88×10²-5.88×10⁷copies/μL，标准曲线方程的标准曲线斜率为-3.56，R²为0.9987，扩增效率E为90.91％。

以上结果说明本发明的实时定量PCR方法扩增该标准品的效率较高，线性关系良好，检测方法精确可行，符合制备实时定量PCR标准曲线的要求。

3、定量PCR检测方法的特异性分析

标准品PCR溶解曲线如图4所示，通过溶解曲线分析发现，目的基因的溶解曲线呈现单一峰，溶解温度为84.34±1℃，表明基因M16可被特异性扩增，说明该PCR方法特异性好，实时定量PCR结果可信。

4、定量PCR检测方法的重复性

采用实施例2的方法制得7批次质粒标准品。

将上述不同批次的质粒标准品反复冻融6次，用优化后的PCR反应条件进行定量PCR测定，根据循环数的变异系数(CV)对重复性进行评价。

结果如表1所示，7批次质粒标准品的循环数变异系数为0.39％-2.88％，结果表明，质粒标准品的标准曲线重复性良好。

表1质粒标准品不同批次间重复性分析

实施例三、利用定量PCR方法检测实际水体中微囊藻

1、实际水样采集和浓缩

在9月，于水面下0.5m处取地表水样。水样经过0.22μm微孔过滤后，将滤膜保存至-20℃，用于后续实验分析。

2、DNA提取

实验结束后按照试剂盒操作说明进行样品总DNA的提取纯化，最终每个样品获得DNA样本50μL。

3、定量PCR检测

取2μL获得的DNA样本为模板，进行定量PCR检测，定量PCR检测体系和方法参考前述实施例二。

表2利用定量PCR检测水体中M16基因的拷贝数

本发明针对M16基因设计特异性引物，采用实时定量PCR方法定量检测水环境中微囊藻，其关键的技术是制备外标准品，优化实时定量PCR反应条件。本发明的实验证明，本发明的定量检测微囊藻的标准品具有广谱识别和特异性相结合的特点，敏感性高，制备方法简便，可以长期保存，纯度好，线性检测范围宽，可以用于水环境样品中微囊藻的快速定量检测。

综上所述，本发明一种定量检测微囊藻的标准品及制备、检测方法针对M16基因设计特异性引物，通过制备外标准品、优化实时定量PCR反应条件，采用实时定量PCR方法定量检测水环境中微囊藻，本发明的定量检测微囊藻的标准品具有广谱识别和特异性相结合的特点，敏感性高，制备方法简便，可以长期保存，纯度好，线性检测范围宽，可以用于水环境样品中微囊藻的快速定量检测。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何本领域技术人员均可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰与改变。因此，本发明的权利保护范围，应如权利要求书所列。