治疗创伤性脑损伤的方法
阅读说明：本技术 治疗创伤性脑损伤的方法 (Method for treating traumatic brain injury ) 是由 M·C·德维尔德 R·J·J·哈格曼 于 2017-07-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于在患有创伤性脑损伤或从创伤性脑损伤中恢复的哺乳动物中产生白质、产生髓磷脂和/或减小脑部病变大小的组合物,包括经肠内给予受试者一种包含治疗有效量的以下成分的组合物：(i)尿苷、胞苷或其盐、磷酸酯、酰基衍生物或酯中的一种或多种；(ii)脂质成分,其包含二十二碳六烯酸(22:6；DHA)、二十碳五烯酸(20:5；EPA)和二十二碳五烯酸(22:5；DPA)中的至少一种,优选至少DHA,更优选DHA和EPA,其中脂质成分包含小于2重量％的α-亚麻酸(ALA),按所有脂肪酸的重量计算；(iii)胆碱或其盐或酯,以及(iv)至少一种选自维生素B6、B9和B12的维生素B。(The present invention relates to a composition for producing white matter, producing myelin, and/or reducing the size of brain lesions in a mammal suffering from or recovering from traumatic brain injury comprising enterally administering to a subject a composition comprising a therapeutically effective amount of (i) one or more of uridine, cytidine, or a salt, phosphate, acyl derivative or ester thereof, (ii) a lipid component comprising docosahexaenoic acid (22: 6; DHA), eicosapentaenoic acid (20: 5; EPA) and docosapentaenoic acid (22: 5; DPA), preferably at least DHA, more preferably DHA and EPA, wherein the lipid component comprises less than 2% by weight of α -linolenic acid (ALA), based on the weight of all fatty acids, (iii) choline or a salt or ester thereof, and (iv) at least one vitamin B selected from vitamin B6, B9 and B12.)
技术领域
本发明为医学营养学领域，更具体地涉及用于治疗和恢复创伤性脑损伤以及与其相关的症状的营养组合物。
背景技术
创伤性脑损伤(TBI)是非变性获得性脑损伤的一种形式。TBI是一种严重的医学病症，其可在大脑受到重大外部物理撞击后发生。TBI是45岁以下人群残疾和死亡的主要原因，全球每年约有1000万新病例。
根据“精神障碍诊断和统计手册(DSM-5)”中详细描述的诊断标准，TBI与以下特征中的一项或多项的独特组合相关：意识水平的改变；记忆障碍；与定向缺陷有关的混乱；神经系统体征，例如神经影像学可观察到的脑损伤、癫痫症的新发或恶化、视野缺损和轻偏瘫。虽然某些症状可能在受伤后立即出现，但其他症状也会随着时间的推移而发展，这与受伤后神经基质的解剖学变化一致。
TBI的主要阶段描述了由球形肿块效应引起的挫伤或缺氧对脑组织的直接损害。只有通过改善的预防，才能减轻TBI的原发性损伤。继发性损伤在创伤后立即开始，并且成为与TBI相关的功能缺陷的基础。其随后通过诸如再灌注损伤、延迟的皮质水肿、血脑屏障(BBB)破坏、谷氨酰胺能过度兴奋和局部电解质失衡等机制发生。这些紊乱本身通过钙释放、谷氨酸盐毒性、脂质过氧化和线粒体功能障碍而导致活性氧(ROS)介导的神经变性。这种继发性损伤可能发生在与最初预期的损伤部位相邻的大脑中，从而可能在损伤后数月内使损伤区域意外扩大。由这种复杂的细胞、神经化学、炎性和代谢事件的级联所造成的损害可能导致神经元丧失、树突状变化、轴突变化和突触变化以及持续的白质异常。目前，尚无治疗方法可应对此类不良后果。因此，开发有效的治疗性干预措施以在TBI后保护大脑并促进修复是一项特别紧迫的任务。
WO 2012/125034涉及改善在由外力引起的神经性损伤后、例如在创伤性脑损伤后的神经存活。
由TBI引起的一个重要问题是白质丧失或扩散，导致认知功能障碍。参考Cristofori等“White and gray matter contributions to executive functionrecovery after traumatic brain injury”，Neurology(2015年)第84(14)卷第1394-1401页。CN103371993记载了ω-3脂肪酸在创伤性脑损伤治疗中的应用，其对病变大小和白质都有影响(通过监测MBP的荧光强度)，但效果仍然有限。因此，在本领域中仍需改进TBI的治疗。
发明内容
本发明人观察到，在TBI之后，在给予一种产品之后，病变大小减小(图1)并产生了白质(图2)，所述产品包含(i)尿苷和胞苷或其盐、磷酸酯、酰基衍生物或酯中的一种或多种，(ii)脂质成分，其包含二十二碳六烯酸(22:6；DHA)、二十碳五烯酸(20:5；EPA)和二十二碳五烯酸(22:5；DPA)或其酯中的至少一种，其中脂质成分包含小于2重量％的α-亚麻酸(ALA)，按所有脂肪酸的重量计算，(iii)胆碱或其盐或酯，以及(iv)至少一种选自维生素B6、B9和B12的维生素B。监测在TBI小鼠模型中在脑部病变大小和白质方面的干预效果(通过髓磷脂的产生)。干预在所述各个方面均表现出成功，而在TBI的情况下这些方面均受到损害。结果在实验部分给出。
本文中的图2显示，与CN103371993中利用DHA获得的结果相比，本发明的干预显示出髓磷脂的产生得到更大的提高：利用本发明的干预的CCI-FC水平几乎与开颅手术组(Cranio-对照组)观察到的水平相同，而TBI干预对照组(CCI对照组)具有明显较低的髓磷脂碱性蛋白(MBP)；相比之下，在CN103371993的图6D和6E中，示出了开颅手术组(假手术组，白色条带)、TBI干预组(RD-CCI，灰色条带)和利用包含DHA的鱼油膳食治疗的TBI干预组(FOD-CCI，黑色条带)的平均MBP强度。当将本发明的开颅手术组(cranio-对照组)的结果设定为1时，CCI-FC为约0.9(相比之下，CCI对照组为0.7)，而CN103371993中的图6中的这些值分别为1以及约0.5和0.65。因此，与对照组水平相比，通过本发明的干预获得的效果显示出髓磷脂水平几乎完全恢复，而在CN103371993的FOD-CCI组中，与TBI干预组(RD-CCI)相比仅略有改善，并且没有恢复到开颅手术组(假手术组)中检测到的水平。
因此，根据一个实施方案，组合物包含：
i)尿苷和胞苷或其盐、磷酸酯、酰基衍生物或酯中的一种或多种；
ii)脂质成分，其包含二十二碳六烯酸(22:6；DHA)、二十碳五烯酸(20:5；EPA)和二十二碳五烯酸(22:5；DPA)或其酯中的至少一种，其中脂质成分包含小于2重量％的α-亚麻酸(ALA)，按所有脂肪酸的重量计算；
iii)胆碱或其盐或酯，以及
iv)至少一种选自维生素B6、B9和B12的维生素B，
其用于在患有创伤性脑损伤或从创伤性脑损伤中恢复的哺乳动物中产生白质、产生髓磷脂和减小脑部病变大小。组合物优选肠内(优选口服)给药。
与此相关，本发明还涉及包含如上定义的(i)-(iv)的组合物在制备用于在患有创伤性脑损伤或从创伤性脑损伤中恢复的哺乳动物中产生白质、产生髓磷脂和减小脑部病变大小的产品中的用途。换句话说，本发明还涉及一种在患有创伤性脑损伤或从创伤性脑损伤中恢复的哺乳动物中产生白质、产生髓磷脂和减小脑部病变大小的方法，所述方法包括向所述哺乳动物经肠内(优选口服)给予包含如上定义的(i)-(iv)的组合物。
尽管各活性成分(i)-(iv)适当地以单一组合物的形式经肠内(优选口服)给药，但其还可以以单独的剂量单位给药。因此，本发明还涉及分别包含(i)-(iv)的成套试剂盒(kit of parts)，一起用于在患有创伤性脑损伤或从创伤性脑损伤中恢复的哺乳动物中产生白质、产生髓磷脂和减小脑部病变大小。
成分(i)、(ii)、(iii)和(iv)以及其他任选成分将在下文中详细描述。
一方面，关于改善的白质产生、改善的髓磷脂产生和减小的脑部病变大小，本发明涉及包含(i)、(ii)、(iii)和(iv)以及其他任选的用于提高TBI的恢复速度的成分的组合物。
附图说明
图1示出了在TBI小鼠模型中膳食干预对病变大小和白质的效果。在成年雄性小鼠中，诱导受控的皮质撞击(CCI)作为TBI模型或对照开颅手术(假损伤)损伤。将动物分为三个实验组(开颅手术对照组[白色条带]，CCI-对照组[深灰色]和CCI-FC[浅灰色])，用对照膳食或干预膳食(FC)治疗：
(A)用H&E染色的代表性冠状切片显示三组之间的病变大小不同。
(B)在TBI后70天，病变大小的量化显示，与CCI对照组小鼠相比，CCI-FC小鼠的病变大小显著减小(单因素方差分析p<0.01；Bonferroni多重比较事后检验；*＊*P<0.001)。病变大小计算为(对侧半球-同侧半球)/对侧半球，并以百分比表示。数据表示为每组5只动物的平均值±SEM。
图2示出了TBI和利用有效治疗TBI的组合物进行的治疗对髓磷脂含量的影响：
(A)利用用于髓磷脂的罗克沙尔固蓝(Luxol Fast blue，LFB)染色的冠状脑组织切片的代表性图像。注意内囊(IC)、苍白球(GP)-外侧段，尾-壳核(CP)和胼胝体(CC)区域(标有矩形并放大的特定区域)的染色差异。在损伤部位的同侧和对侧，相比于在CCI-对照组中看到的虚线图像，在CCI-FC组和开颅手术对照组中，髓磷脂染色的神经束看起来是连续的。
(B)通过蛋白质印迹法分析的髓磷脂碱性蛋白(MBP)水平。与CCI-对照组小鼠相比，CCI-FC组和开颅手术对照组中MBP(20kDa)的表达明显更高(单因素方差分析p<0.001；Bonferroni多重比较事后检验*＊*P<0.001)。图例与图1B相同。
实施方案列表
1.一种组合物，其用于在患有创伤性脑损伤或从创伤性脑损伤中恢复的哺乳动物中产生白质、产生髓磷脂和/或减小脑部病变大小，包括经肠内给予受试者一种包含治疗有效量的以下成分的组合物：
(i)尿苷、胞苷或其盐、磷酸酯、酰基衍生物或酯中的一种或多种；
(ii)脂质成分，其包含二十二碳六烯酸(22:6；DHA)、二十碳五烯酸(20:5；EPA)和二十二碳五烯酸(22:5；DPA)中的至少一种，优选至少DHA，更优选DHA和EPA，
其中脂质成分包含小于2重量％的α-亚麻酸(ALA)，按所有脂肪酸的重量计算；
(iii)胆碱或其盐或酯，以及
(iv)至少一种选自维生素B6、B9和B12的维生素B。
2.根据实施方案1所述的用于所述用途的组合物，其中脂质成分包含中链脂肪酸，其中中链脂肪酸C6:0+C7:0+C8:0的总和相比于C9:0和C10:0的总和小于2:1。
3.根据实施方案1或2所述的用于所述用途的组合物，其中基于总脂肪酸计，脂质成分包含小于2重量％的具有小于14个碳原子的脂肪酸。
4.根据前述实施方案中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中组合物还包含含量小于15g/100g脂肪酸的亚油酸(LA)。
5.根据前述实施方案中任一项所述的用于所述用途的组合物，其包含(iv)至少两种选自维生素B6、B9和B12的维生素B。
6.根据实施方案5所述的用于所述用途的组合物，其包含(iv)维生素B6、B9和B12。
7.根据前述实施方案中任一项所述的用于所述用途的组合物，其包含每日500-5000mg DHA+EPA。
8.根据前述实施方案中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中组合物包含每日100至6000mg尿苷、胞苷或其盐、磷酸酯或酯中的一种或多种，以尿苷和胞苷计算；优选每日100-6000mg尿苷或其盐、磷酸酯或酯，以尿苷计算。
9.根据前述实施方案中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中组合物包含每日大于50mg胆碱或其盐或酯，以胆碱计算。
10.根据前述实施方案中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中组合物还包含治疗有效量的至少一种且更优选至少两种抗氧化剂维生素C、维生素E和硒。
11.根据前述实施方案中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中组合物还包含至少一种磷脂。
12.根据前述实施方案中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中组合物在每100ml液体中包含：
100-500mg EPA，
1000-1500mg DHA，
80-600mg磷脂，
200-600mg胆碱，
400-800mg尿苷单磷酸(UMP)，
20-60mgα-TE(维生素E)，
60-100mg维生素C，
40-80μg硒，
1-5μg维生素B12，
0.5-2mg维生素B6，以及
200-600μg叶酸。
13.根据前述实施方案中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中从被诊断为TBI的1个月内开始向所述哺乳动物给予组合物。
14.根据前述实施方案中任一项所述的用于所述用途的组合物，其用于提高从创伤性脑损伤中恢复的速度。
15.组合物在制备用于在患有创伤性脑损伤或从创伤性脑损伤中恢复的哺乳动物中产生白质、产生髓磷脂和/或减小脑部病变大小的产品中的用途，其中所述产品经肠内给药，其中所述产品包含治疗性有效量的：
(i)尿苷、胞苷或其盐、磷酸酯、酰基衍生物或酯中的一种或多种；
(ii)脂质成分，其包含二十二碳六烯酸(22:6；DHA)、二十碳五烯酸(20:5；EPA)和二十二碳五烯酸(22:5；DPA)中的至少一种，其中脂质成分包含小于2重量％的α-亚麻酸(ALA)，按所有脂肪酸的重量计算；
(iii)胆碱或其盐或酯，以及
(iv)至少一种选自维生素B6、B9和B12的维生素B。
16.根据实施方案15所述的用途，用于提高从创伤性脑损伤中恢复的速度。
17.一种在患有创伤性脑损伤或从创伤性脑损伤中恢复的哺乳动物中产生白质、产生髓磷脂和/或减小脑部病变大小的方法，所述方法包括经肠内给予一种包含治疗有效量的以下成分的产品：
(i)尿苷、胞苷或其盐、磷酸酯、酰基衍生物或酯中的一种或多种；
(ii)脂质成分，其包含二十二碳六烯酸(22:6；DHA)、二十碳五烯酸(20:5；EPA)和二十二碳五烯酸(22:5；DPA)中的至少一种，其中脂质成分包含小于2重量％的α-亚麻酸(ALA)，按所有脂肪酸的重量计算；
(iii)胆碱或其盐或酯，以及
(iv)至少一种选自维生素B6、B9和B12的维生素B。
18.一种用于在患有创伤性脑损伤或从创伤性脑损伤中恢复的哺乳动物中产生白质、产生髓磷脂和/或减小脑部病变大小的试剂盒，所述试剂盒包括具有治疗有效量的以下成分的容器：
(i)尿苷、胞苷或其盐、磷酸酯、酰基衍生物或酯中的一种或多种；
(ii)脂质成分，其包含二十二碳六烯酸(22:6；DHA)、二十碳五烯酸(20:5；EPA)和二十二碳五烯酸(22:5；DPA)中的至少一种，其中脂质成分包含小于2重量％的α-亚麻酸(ALA)，按所有脂肪酸的重量计算；
(iii)胆碱或其盐或酯，以及
(iv)至少一种选自维生素B6、B9和B12的维生素B。
19.试剂盒在制备用于在患有创伤性脑损伤或从创伤性脑损伤中恢复的哺乳动物中产生白质、产生髓磷脂和/或减小脑部病变大小的产品中的用途，所述试剂盒包括具有治疗有效量的以下成分的容器：
(i)尿苷、胞苷或其盐、磷酸酯、酰基衍生物或酯中的一种或多种；
(ii)脂质成分，其包含二十二碳六烯酸(22:6；DHA)、二十碳五烯酸(20:5；EPA)和二十二碳五烯酸(22:5；DPA)中的至少一种，其中脂质成分包含小于2重量％的α-亚麻酸(ALA)，按所有脂肪酸的重量计算；
(iii)胆碱或其盐或酯，以及
(iv)至少一种选自维生素B6、B9和B12的维生素B。
具体实施方式
本发明人发现，本发明的组合物在TBI的治疗中是有效的并且改善了TBI的恢复。在一个优选的方面，在诊断为TBI后不久，优选在诊断为TBI后3个月内、优选2个月内、更优选1个月内、更优选2周内、最优选1周内开始给予本发明的组合物。在一个优选的方面，每天给予或使用组合物，持续至少5天，优选至少7天，优选至少14天，更优选至少1个月，更优选至少3个月。
本发明的方法和用途包括将下文概述的组合物给予有此需要的患有TBI的哺乳动物，优选有此需要的患有TBI的人。TBI是指由机械外力对大脑造成的损害。在本发明的上下文中，TBI可以是轻度的(无意识的水平小于30分钟和/或格拉斯哥昏迷评分为13-15)或中度至重度的TBI(无意识的水平超过30分钟和/或格拉斯哥昏迷评分小于13)。TBI可由跌倒、火器伤、运动事故、建筑事故和车辆事故等原因引起。看起来，创伤性脑损伤是士兵在战斗中最普遍的伤害(例如，在***和阿富汗的美军中)。TBI的受害者可能会在受伤后患有多种身体、认知、社交、情感和/或行为障碍。最初的撞击导致直接的神经细胞丧失，主要表现为坏死，然后通常是一系列的继发性损伤级联，包括兴奋性毒性、氧化应激、线粒体功能障碍、血脑屏障破坏和炎症。根据“精神障碍诊断和统计手册(DSM-5)”中详细描述的诊断标准，TBI与以下特征中的一项或多项的独特组合相关：意识水平的改变；记忆障碍；与定向缺陷有关的混乱；神经系统体征，例如神经影像学可观察到的脑损伤、癫痫症的新发或恶化、视野缺损和轻偏瘫。
在本发明的一个方面，治疗涉及在TBI后减小脑部病变大小。
在本发明的一方面，治疗涉及在患有TBI或从TBI中恢复的患者中产生白质。一方面，治疗涉及改善患有TBI或从TBI中恢复的患者的髓鞘化。在TBI的情况下，白质丧失不同于与神经退行性疾病如阿尔茨海默病相关的白质变性。治疗优选涉及提高髓磷脂的产生。在轻度以及中度和重度TBI中均观察到白质破坏。用本发明的组合物进行干预导致增加的白质产生和提高的髓磷脂产生。可以使用对熟练的从业人员而言可用的成像技术来监测髓磷脂和白质的产生，例如正电子发射型断层显像(PET)、单光子发射计算机断层成像术(SPECT)、功能性磁共振成像(fMRI)和弥散张量成像(DTI)。
在本发明的一个方面，治疗不涉及神经发生、神经元存活和神经发炎。在本发明的另一方面，排除患有PKU或高苯丙氨酸血症的哺乳动物。在本发明的另一方面，还排除与衰老相关的白质疾病或室周白质疾病或白质变性的治疗。
在本发明的一个方面，本发明的组合物可以用作包含一种或多种药学上可接受的载体材料的药物产品。
在本发明的另一方面，本发明的组合物可以用作营养产品，例如用作营养补充剂(例如用作正常饮食的添加剂)，用作强化剂以添加到正常饮食中，或用作完整的营养物。
优选用于肠内施用的药物产品可以是固体或液体盖伦制剂。固体盖仑制剂的实例为含有活性成分和常规盖仑载体的片剂、胶囊剂(例如硬壳或软壳明胶胶囊)、丸剂、散剂(sachet)、粉末剂、颗粒剂等。可以使用任何常规的载体材料。载体材料可为适合于口服给药的有机或无机惰性载体材料。合适的载体包括水、明胶、***树胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁，滑石粉、植物油等。另外，可以根据药物配制的公认惯例添加添加剂，例如调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂等。
如果组合物为药物产品，则产品可包含一个或多个剂量单位的日剂量。剂量单位可以是液体形式或固体形式，其中在固体形式的情况下，日剂量可以以一个或多个固体剂量单位提供，例如以一个或多个胶囊剂或片剂提供。
在本发明的另一方面，本发明的组合物可用于包含脂肪、蛋白质和碳水化合物的营养产品中。应当理解，营养产品与药物产品的不同之处在于存在营养物——其为被给予组合物的受试者提供营养——特别是存在蛋白质、脂肪、可消化的碳水化合物和膳食纤维。其还可包含诸如矿物质、维生素、有机酸和调味剂的成分。尽管在文献中经常使用术语“营养保健品(nutraceutical product)”，但其表示具有药物成分或药物目的的营养产品。因此，本发明的营养组合物还可用于营养保健品中。
本发明的产品是肠内用组合物，旨在用于口服给药。优选以液体形式给药。在一个实施方案中，产品包含脂质成分，以及碳水化合物和蛋白质中的至少一种，其中脂质组分提供食品的20至50能量％。这是基于以下假设：脂质、碳水化合物和蛋白质分别产生约9、4和4kcal/g，这3种成分共同构成了组合物的所有热量贡献。在一个实施方案中，食品是一种液体组合物，每毫升含有0.8至1.4kcal。
DHA/EPA/DPA
本发明的方法、产品、组合物或试剂盒包含治疗有效量的至少一种ω-3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA；链长为18个或更多个碳原子)，其选自二十二碳六烯酸(22:6，ω-3；DHA)、二十碳五烯酸(20:5，ω-3；EPA)和二十二碳五烯酸(22:5，ω-3；DPA)，优选至少DHA和/或EPA，更优选至少DHA，最优选DHA和EPA。EPA转化为DPA(ω-3)，从而增加了大脑中DPA向DHA的后续转化。因此，本发明的组合物优选包含大量的EPA，以便进一步刺激体内DHA的形成。
优选以甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、游离脂肪酸或其盐或酯、磷脂、溶血磷脂、甘油醚、脂蛋白、神经酰胺、糖脂或其组合的形式提供DHA，EPA和/或DPA。优选地，本发明的组合物至少包含甘油三酯形式的DHA。合适的ω-3LCPUFA和/或DHA来源包括金枪鱼油、(其他)鱼油、富含DHA的烷基酯、藻油、卵黄或富含ω-3LCPUFA的磷脂，例如磷脂酰丝氨酸-DHA。优选地，本发明的产品、组合物或试剂盒包含提供ω-3LCPUFA的鱼油。ω-3LCPUFA的另一个特别合适的来源是藻油。
就日剂量而言，本发明的方法优选包括每日给予500至5000mg DHA+EPA+DPA。在优选的实施方案中，就日剂量而言，本发明的方法优选包括每日给予500-5000mg DHA+EPA，更优选每日给予1000-4000mg DHA+EPA。优选给予的DHA的量为每日400-4500mg、更优选每日750-3250mg。另外，优选给予的EPA的量为每日100-4600mg、更优选每日250-3250mg。
关于单位剂量，总脂肪酸中的DHA+EPA+DPA(优选DHA+EPA)的比例优选为5-95重量％，更优选10-80重量％，最优选15-70重量％。本发明的组合物优选包含基于总脂肪酸计5-95重量％的DHA，优选基于总脂肪酸计10-75重量％的DHA，更优选基于总脂肪酸计10-60重量％的DHA。本发明的组合物优选包含基于总脂肪酸计5-95重量％的EPA，优选10-75重量％的EPA，最优选15-60重量％，基于总脂肪酸计。
DHA与EPA的重量比优选大于1，更优选为2:1至10:1，更优选为3:1至8:1。上述比例和量考虑并优化了几个方面，包括风味(LCP水平太高会削弱风味，导致顺应性降低)、DHA和其前体之间的平衡以确保在维持低容量剂型的同时有最佳的效果。
ALA/LA
优选地，将组合物的α-亚麻酸[ALA]含量维持在低水平。本发明人认为由于创伤性脑损伤的炎症性质，过量供应高度不饱和脂肪酸会因为过氧化PUFA的作用而增加进一步损害受损组织的风险，即使已经观察到在神经创伤中体内供应α-亚麻酸是神经保护性的(King等人.J.Neurosci.(26)17:4672-4680)。本发明人发现，ALA浓度优选维持在小于2.0重量％、更优选小于1.5重量％、尤其是小于1.0重量％的水平，按所有脂肪酸的重量计。在所附的动物研究中，其水平为约0.8g/100g脂肪酸。
亚油酸[LA]浓度可以维持在正常水平，即20-30重量％，但是在一个实施方案中，LA浓度也被显著地降低至小于15g/100g脂肪酸且优选甚至小于10重量％的量。LA浓度优选为脂肪酸的至少1重量％。LA:ALA比优选在10:1至7:1的范围内。
在一个实施方案中，本发明的组合物中重量比ω-3/ω-6优选为0.3-7，优选1.4:1-5.9:1，更优选3:1-5.5:1，最优选3:1-5:1，尤其是小于5:1。ω-6LCPUFA的量优选为小于配方物中脂肪酸的50重量％，优选为5-40重量％，更优选为8-30重量％。
中链甘油三酯(MCT)
在一个实施方案中，组合物、产品、试剂盒或方法含有小于5重量％、优选小于2重量％的具有小于14个的碳原子的脂肪酸。中链脂肪酸[MCT]定义为具有六个(C6:0)、七个(C7:0)、八个(C8:0)、九个(C9:0)或十个(C10:0)碳原子的直链或支链的饱和羧酸。MCT的量优选小于总脂肪酸的2重量％，更优选小于1.5重量％，最优选小于1.0重量％。在一个实施方案中，中链脂肪酸C6:0+C7:0+C8:0的总和与C9:0和C10:0的总和的比例小于2:1，更优选小于1.8:1，最优选小于1.6:1，特别是小于1.4:1。
尿苷或胞苷
本发明的组合物、产品、方法或试剂盒包含治疗有效量的尿苷、胞苷和/或其等价物，所述等价物包括盐、磷酸酯、酰基衍生物和/或酯。关于尿苷，组合物优选包含至少一种选自尿苷(即核糖尿嘧啶)、脱氧尿苷(脱氧核糖尿嘧啶)、磷酸尿苷(UMP、dUMP、UDP、UTP)、核碱基尿嘧啶和酰化尿苷衍生物的尿苷或其等价物。在一个实施方案中，还可以使用胞苷、CMP、胞磷胆碱(CDP-胆碱)。优选地，本发明的组合物包含选自尿苷单磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷三磷酸(UTP)的磷酸尿苷；和/或磷酸胞苷(CMP、CDP、CTP，优选CMP)。最优选地，本发明的组合物包含UMP，因为UMP被身体最有效地吸收。优选地，在本发明的组合物中，UMP提供至少50重量％的尿苷，更优选至少75重量％，最优选至少95重量％。必须给予的剂量以UMP形式给予。可以采用相对UMP量的摩尔当量来计算尿嘧啶来源的量。
本发明的方法优选包括以下述量给予尿苷(尿苷、脱氧尿苷、磷酸尿苷、核碱基尿嘧啶和酰化尿苷衍生物的累积量)：(i)0.1-6g/天，优选0.2-3g/天，更优选0.4-2g/天，和/或(ii)0.1-6g/100ml(液体)组合物，优选0.2-3g/100ml(液体)组合物，更优选0.4-2g/100ml(液体)组合物。上述量还考虑了组合物或方法中包括的胞苷、磷酸胞苷和胞磷胆碱的任何量。
优选地，本发明的组合物包含磷酸尿苷，优选尿苷单磷酸(UMP)。UMP被身体非常有效地吸收。因此，在本发明的组合物中包含UMP使得能够以最低剂量获得高功效和/或对受试者进行低容量给药。
胆碱
本发明的组合物、产品、方法或试剂盒包含治疗有效量的胆碱、胆碱盐和/或胆碱酯。胆碱盐优选选自氯化胆碱、酒石酸氢胆碱或硬脂酸胆碱。胆碱酯优选选自磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱。本发明的方法优选包括给予大于50mg胆碱/天，优选80-3000mg胆碱/天，更优选100-2000mg胆碱/天，最优选150-1000mg胆碱/天。本发明的组合物优选包含80mg-3000g胆碱/100ml液体组合物，优选100mg-2000mg胆碱/100ml，优选200-1000mg胆碱/100ml组合物，最优选200mg-600mg胆碱/100ml。上述数字是基于胆碱计的，可以考虑相对于胆碱的摩尔当量来计算胆碱等价物或来源的量。
维生素
本发明的组合物、产品、方法或试剂盒包含治疗有效量的至少一种维生素B且优选至少两种维生素B，所述维生素B选自维生素B6(吡哆辛、吡哆醛或吡哆胺或盐酸吡哆辛)、维生素B9(叶酸(folic acid)或叶酸(folate))和维生素B12(钴胺素)。这些术语涵盖功能等价物。特别地，包含治疗有效量的所有维生素B6、维生素B12和维生素B9的结合物已获得良好效果。
维生素B以有效剂量给予，其剂量取决于所用维生素B的类型。按照经验法则，可以基于已知的膳食推荐、本文公开的信息以及任选的有限量的常规试验来选择适合的最小或最大剂量，所述已知的膳食推荐为例如由美国国家科学院医学研究所(Institute ofMedicine(IOM)of the U.S.National Academy of Sciences)或由食品科学委员会(Scientific Committee on Food)(欧盟的科学委员会)所推荐的那些。最小剂量可以基于估计的平均需要量(EAR)，但是更低的剂量可能已经是有效的。最大剂量通常不超过可容许的最高摄入水平(UL)，如IOM所推荐的水平。
如果存在维生素B6，则其优选以这样的量存在，以提供0.1-100mg、特别是0.5-25mg、更特别是0.5-5mg的日剂量。本发明的组合物优选包含0.1-100mg维生素B6/100g(液体)产品，更优选0.5-5mg维生素B6/100g(液体)产品，更优选0.5-5mg维生素B6/100g(液体)产品。
如果存在维生素B12，则其优选以这样的量存在，以提供0.5-100μg、特别是1-10μg、更特别是1.5-5μg的日剂量。本发明的组合物优选包含0.5-100μg维生素B12/100g(液体)产品，更优选1-10μg维生素B12/100g(液体)产品，更优选1.5-5μg维生素B12/100g(液体)产品。术语“维生素B12”包括本领域中已知的所有钴胺素等价物。
如果存在维生素B9(叶酸)，则其优选以这样的量存在，以提供50-5000μg、特别是100-1000μg、更特别是200-800μg的日剂量。本发明的组合物优选包含50-5000μg叶酸/100g(液体)产品，更优选100-1000μg叶酸/100g(液体)产品，更优选200-800μg叶酸/100g(液体)产品。叶酸(folate)包括叶酸(folic acid)、亚叶酸，甲基化、次甲基化(methenylated)和甲酰化形式的叶酸(folate)，它们的盐或酯，以及它们与一个或多个谷氨酸的衍生物，并且全部为还原或氧化形式。
磷脂
优选在组合物中引入至少一种磷脂。术语“磷脂”不包括已经在胆碱成分中占比率的PC。本发明的组合物优选包含至少一种磷脂，其含量为0.01-1g/100ml，更优选为0.05-0.5g/100ml，最优选为80-600mg/100ml。优选通过使用卵磷脂、更优选大豆卵磷脂来提供至少一种磷脂。
维生素C、维生素E、硒
本发明的组合物、产品、方法或试剂盒优选包含治疗有效量的至少一种且更优选至少两种选自维生素C、维生素E和硒的抗氧化剂。
维生素C或其功能等价物可以以这样的量存在，以提供20-2000mg、特别是30-500mg、更特别是75-150mg的日剂量。在一个实施方案中，维生素C或其功能等价物的存在量为20-2000mg/100ml组合物，特别是30-500mg/100ml组合物，更特别是75-150mg/100ml组合物。
生育酚和/或其等价物(即具有维生素E活性的化合物)可以以这样的量存在，以提供10-300mg、特别是30-200mg、更特别是35-100mg的日剂量，以防止由膳食PUFA导致的对损伤部位的氧化损害。在一个实施方案中，生育酚和/或等价物的存在量为10-300mg/100ml组合物，特别是30-200mg/100ml组合物，更特别是35-100mg/100ml组合物。本说明书中使用的术语“生育酚和/或其等价物”包括生育酚、生育三烯酚(tocotrienol)、它们的药学和/或营养学上可接受的衍生物以及它们的任意组合。上述数字基于本领域中公认的生育酚等价物。
在一个实施方案中，本发明的组合物优选包含维生素C和E，和/或其等价物。
本发明的组合物优选还含有硒。硒的抗氧化活性有利地防止和/或抑制对大脑区域的损害。优选地，本发明的方法包括给予包含0.01-5mg硒/100ml液体产品、优选0.02-0.1mg硒/100ml液体产品的组合物。每日给予的硒的量优选大于0.01mg，更优选为0.01-0.5mg。
组合物、产品、方法或试剂盒还可包含蛋白质物质。如果包含蛋白质成分，则该蛋白质成分包含完整蛋白质、可通过水解完整蛋白质和通过合成获得的肽、包含大于80重量％的氨基酸的肽的衍生物。在本发明的上下文中，来自核苷物质和胆碱的氮不被算作蛋白质。
优选地，牛磺酸(包括牛磺酸盐)的量为每日剂量小于0.1g，优选小于0.05g。另外地或者替代地，优选地，牛磺酸(包括牛磺酸盐)的量小于5mg/100g组合物，更优选小于2.5g/100g组合物。在一个实施方案中，组合物包含小于25mg、更优选小于20mg、最优选小于15mg的半胱氨酸和牛磺酸/100ml(液体)组合物。在一个实施方案中，组合物包含小于25mg、更优选小于20mg、最优选小于15mg的半胱氨酸/100ml(液体)组合物。优选地，蛋白质成分包含大于70重量％的酪蛋白或酪蛋白酸盐或其水解物，更优选80重量％以上，因为与其他蛋白质来源相比，酪蛋白包含相对少量的半胱氨酸。还优选加热液体组合物，以氧化存在于蛋白质中的半胱氨酸分子。这削弱了存在于配方物中的任何残余半胱氨酸的生物利用度。优选的热处理包括灭菌。优选地，将温度维持在低于135℃，优选低于132℃，并持续足够长的时间以使半胱氨酸氧化，即大于30秒，优选大于40秒。
在一个实施方案中，优选地，组合物的蛋白质含量为小于组合物的总能量含量的15能量％(en％)，更优选小于10能量％，最优选小于5能量％。使用以下换算因子计算所述组分的能量百分数：每克脂质9kcal，每克蛋白质或每克可消化的碳水化合物4kcal，每克膳食纤维2kcal，组合物中的其他组分为0kcal。在一个实施方案中，优选地，组合物包含小于0.5-10g蛋白质/100ml，更优选小于1-6g蛋白质/100ml，最优选2-6g蛋白质/100ml。
已发现，在本发明的方法中提高锰和钼的水平不是获得对TBI的有益效果所必需的。在本发明的方法中，所消耗/给予的锰的量优选小于300μg/100ml，优选小于250μg/100ml，更优选小于100μg/100ml，特别是小于60μg/100ml。在一个实施方案中，每日给予的锰的量优选小于100μg，更优选小于50μg。在一个实施方案中，本发明的100ml液体组合物包含小于0.05mg钼，优选小于0.025mg钼。
在一个实施方案中，本发明的组合物在每日剂量或每125ml液体(优选水)中包含：
100-600mg，优选200-500mg，更优选约300mg EPA；
900-1500mg，优选950-1300mg，更优选约1200mg DHA；
50-600mg，优选60-200mg，更优选约106mg磷脂；
200-600mg，优选300-500mg，更优选约400mg胆碱；
400-800mg，优选500-700mg，更优选约625mg UMP(尿苷单磷酸)；
20-60mg，优选30-50mg，更优选约40mg维生素E(α-TE)；
60-100mg，优选60-90mg，更优选约80mg维生素C；
40-80μg，优选45-65μg，更优选约60μg硒；
1-5μg，优选2-4μg，更优选约3μg维生素B12；
0.5-3mg，优选0.5-2mg，更优选约1mg维生素B6；和
200-600μg，优选300-500μg，更优选约400μg叶酸。
上述组合物可用作营养治疗、营养支持、用作医疗食物、用作用于特定医疗目的的食物或用作营养补充剂。在TBI恢复和/或康复期间，每日可消费一份、两份或三份的125ml所述产品。
实施例
为了更完整地理解本公开内容，现在参考以下实施例和附图。
实施例1--TBI小鼠模型中神经保护作用的探索
在创伤性脑损伤的实验模型中评估包含本发明的膳食的组合物的效果，所述膳食包含表1中列出的成分。表1列出了对照膳食和FC膳食的成分。
使用体重为22-27g的成年10-12周龄的雄性C57BL/6小鼠(Charles RiverLaboratories，Harlow，UK)。将小鼠分成四组并关在提供有浓缩物(enrichment object)的标准笼子中，光照/黑暗周期为12小时，随意饮食和饮水。每日监测食物摄入量和体重。根据EU Directive 2010/63/EU，所有动物程序均已获得伦敦玛丽皇后大学(Queen MaryUniversity of London)动物福利和道德审查机构(Animal Welfare and Ethical ReviewBody)以及英国内政部(UK Home Office)的批准。
在这项研究中使用了受控的皮质撞击(CCI)TBI模型和仅开颅手术(对照)模型。简而言之，在1周适应期后，使用***(50mg/Kg)和美托咪定(0.5mg/Kg)的混合物在无菌盐水中经腹膜内(i.p.)给药来麻醉小鼠。将小鼠置于立体定位框架中，并进行中线纵向切口以暴露颅骨。使用空气钻进行右侧开颅手术，在前囱后方2.0mm处和中线外侧2.5mm处。使用以下装置诱发CCI损伤：使用PCI3000 Precision Cortical ImpactorTM(HatterasInstruments，Inc.，US)施加的3mm撞击器尖端，速度3m/s，深度2.2mm，停留时间100ms。对照组仅进行开颅手术。受伤后，将颅骨骨瓣放回原处并缝合皮肤。使小鼠在培养箱(37℃)中恢复直至其完全清醒并活跃。在TBI后，经皮下(s.c.)给予的丁丙诺啡(0.05mg/kg)在术前用于先发性镇痛，并在术后每12h使用一次，持续3天。
受伤后，将CCI小鼠随机分为两组，每日喂饲新鲜的对照膳食('CCI-对照组'；n＝10)或多营养的干预膳食('CCI-FC'；n＝10)，持续70天。每日给开颅手术组的小鼠喂饲对照膳食(开颅手术；n＝10)。膳食由Nutricia Research,Nutricia Advanced MedicalNutrition(Utrecht,The Netherlands)配制，并由Ssniff(Soest,Germany)制造并粒化。将膳食在-20℃下保存直至使用，以防止脂质氧化，并每日给予动物新鲜膳食。在整个实验过程中，平均每日食物摄入量和体重增加(各组之间)没有发现显著性差异。
表1：对照膳食和干预膳食(FC)的营养组成，以g/100g膳食计
在TBI后第70天，用戊巴比妥钠(50mg/kg，经腹膜内；Sagatal，Rhone Merieux，Harlow，UK)深度麻醉来自每组的5只动物，并接受使用磷酸盐缓冲液(PBS；0.01M，pH 7.4)进行经心脏灌注，然后接受使用4％的于磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.4，4℃)中的多聚甲醛(PFA)进行经心脏灌注。解剖大脑并用石蜡固定脑组织块，以用于组织学和免疫组织化学(IHC)。
所有组织染色均在病变所在的前囟-1.28和前囟-2.34之间进行。简而言之，将7μm的切片通过一系列二甲苯和乙醇浴进行脱蜡和水合。将切片在80℃下用10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)进行抗原修复30分钟，并在室温下冷却30分钟。然后，利用于PBS中的0.2％Triton X-100中的5％正常驴血清将组织封闭1小时，然后用PBS洗涤3次，并用第一抗体染色过夜。第二抗体为Alexa 488或Alexa 555(Molecular Probes，Leiden，TheNetherlands；1:200)，并使用Hoechst 33342染色剂(Sigma，UK；1μg/ml PBS)使细胞核可视化。使用Vectashield荧光固定介质(H-1000；Vector Laboratories，Burlingame，CA)固定玻片并盖上盖玻片。
蛋白质印迹
将来自每组(CCI或开颅手术)的5只动物的组织用于蛋白质印迹分析。在第70天断头后，迅速取出大脑，并使用矢状脑切片器矩阵切开病变周围的右半球立方体。将组织速冻并在-80℃下保存直至分析。在包含蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)的RIPA裂解缓冲液(Sigma-Aldrich)中制备大脑样本并进行超声处理。然后将样本在4℃下以10000g离心10分钟并取出上清液。使用Bradford蛋白测定法测定蛋白浓度。将来自每个样本的等量蛋白质(50μg)与
病变大小
为了计算病变的大小，用苏木精和曙红对相距200μm且横跨受损皮层的整个首尾(rostro-caudal)范围的7μm切片进行染色。病变的大小用ImageJ软件(NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,USA)测量。使用以下公式计算病变大小：对侧(非病变)半球尺寸减去受伤的半球尺寸，再除以对侧半球尺寸。结果表示为半球组织的百分比。
对CCI模型中病变大小的分析表明，在70dpi时，脑组织明显丧失，同侧海马几乎全部丧失。FC补充剂导致病变大小显著减小(图1A和B)。
白质-髓磷脂
将整个病变区中有代表性的随机选择的切片的一部分用于罗克沙尔固蓝(Sigma，UK)髓磷脂染色。受伤后动物大脑切片的罗克沙尔固蓝染色(LFB)显示，CCI后髓磷脂受到破坏，在尾-壳核和内囊中尤为明显。定性观察表明，在CCI-FC和开颅手术对照组小鼠的这些区域中(图2A)，髓磷脂的模式得以保留，其中髓磷脂染色的神经束看起来是连续的，而CCI对照膳食动物显示出严重破坏的模式。使用蛋白质印迹法对组织髓磷脂碱性蛋白(MBP)进行的测量显示，喂饲对照膳食的CCI小鼠的表达水平在统计学上显著下降，其中经过FC治疗后所述水平完全恢复(图2B)。总体而言，这些结果表明：FC膳食恢复了TBI相关的脱髓鞘过程并保护TBI后的白质。
实施例2：每125ml份液体产品包含：
缩写：EPA，二十碳五烯酸；DHA，二十二碳六烯酸；
TE，生育酚当量；NE，烟酸当量。
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