阅读说明：本技术 一种抗HIV药物关键中间体β-胸苷的检测方法 (Method for detecting key intermediate β -thymidine of anti-HIV drug ) 是由 夏颖 叶婷 贾伟 郑雄敏 林崇明 于 2018-11-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种抗HIV药物关键中间体β-胸苷的检测方法,其采用高效液相色谱进行分析检测,将β-胸苷产品成品经预处理后按以下色谱条件进行检测：色谱柱：C18柱或其他等效的色谱柱；流动相：甲醇水溶液；流速：0.8ml/min-1.2ml/min；检测器：紫外检测器；检测波长为260nm-270nm；色谱柱温度：25℃-35℃；本发明快速、准确,为β-胸苷产品成品中β-胸苷的测定提供了一种可靠的分析方法,同时本发明操作简单、方便实用、安全环保、对发酵法生产β-胸苷具有现实的指导意义,且本发明的检测方法精密度好、重复性高,能够快速、准确地测定β-胸苷产品成品中β-胸苷的含量,有助于提高抗HIV药物关键中间体β-胸苷的质量和安全可控。(The invention provides a detection method of β -thymidine, a key intermediate of an anti-HIV drug, which adopts high performance liquid chromatography for analysis and detection, and detects a β -thymidine product finished product after pretreatment according to the following chromatographic conditions, wherein the chromatographic column comprises a C18 column or other equivalent chromatographic columns, a mobile phase comprises methanol aqueous solution, the flow rate is 0.8ml/min-1.2ml/min, the detector comprises an ultraviolet detector, the detection wavelength is 260nm-270nm, and the chromatographic column temperature is 25 ℃ -35 ℃.)

一种抗HIV药物关键中间体β-胸苷的检测方法

技术领域

本发明涉及β-胸苷检测领域，尤其是指一种抗HIV药物关键中间体β -胸苷的检测方法。

背景技术

齐多夫定(叠氮脱氧胸苷)是第一个获得美国FDA批准生产的抗艾滋病药物，因其疗效确切，成为“鸡尾酒”疗法的最基本的组合成分。β-胸苷作为合成抗艾滋病药物齐多夫定关键中间体，其β-胸苷产品技术含量高并且价格高利润丰厚，主要出口到美国、印度等，给国家创外汇，为公司带来经济效益。但是，由于没有国际标准、国家标准或行业标准可以参考，为满足客户、控制产品质量，β-胸苷产品质量的关键参数就是控制有关物质(杂质)和提高含量。为此，需寻求一种简单可靠、经济实用、精密度高的检测方法，以检测β-胸苷产品中杂质和β-胸苷的含量，来控制产品质量。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明目的在于提供一种抗HIV药物关键中间体β-胸苷的检测方法，为β-胸苷产品成品中有关物质检测和β-胸苷的含量测定提供一种快速、准确、可靠地检测分析方法，减少盲目性。为实现上述之目的，本发明采取如下技术方案：

(二)技术方案

一种抗HIV药物关键中间体β-胸苷的检测方法，采用高效液相色谱法对β-胸苷的含量以及有关物质进行检测，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取β-胸苷产品成品，用流动相溶解并稀释成每1ml中约含1mgβ-胸苷的溶液，作为供试品溶液(需临用新制)；

(2)对照品溶液的制备：精密量取1mlβ-胸苷对照品，置100ml量瓶中，用流动相稀释至100ml刻度，摇匀，作为对照品溶液；

(3)采用高效液相色谱法对β-胸苷进行分析检测：

①、检测条件：所述高效液相色谱法所采用的检测器为紫外检测器，其色谱条件如下：色谱柱：C18柱或其他等效的色谱柱；流速： 0.8ml/min-1.2ml/min；色谱柱温度：25℃-35℃；检测波长：260nm-270nm；

②、检测方法：检测时，取对照品溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％；再精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍。

进一步，所述供试品溶液色谱图中的杂质峰，单个杂质峰面积不大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.5％)，各杂质峰面积的和不大于对照溶液主峰面积的2倍(2.0％)。

进一步，所述β-胸苷的检测方法，具体包括如下步骤：

(1)样品制备：取β-胸苷产品成品50ml，18000r/min离心10分钟，取上清液，量取Xml置于容量瓶中，加水溶解并稀释至100倍体积，摇匀， 0.45μm微孔滤膜过滤，再取过滤液Yml移至量瓶中，加水稀释至10倍体积，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，得待测液；

(2)采用高效液相色谱进行分析检测，标准工作液设有不包含零点的六个浓度梯度，以β-胸苷量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，按外标法计算待测液中β-胸苷的含量，即得β-胸苷产品成品中β- 胸苷的含量。

进一步，所述步骤(3)中，色谱柱为4.6mm×250mm、5μm的Shim-pack ODS C18柱；流速为1ml/min；色谱柱温度：30℃；检测波长为265nm；

进一步，所述流动相为甲醇含量为92％的甲醇水溶液

(三)有益效果

本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果，具体而言，本发明操作简单、方便实用、安全环保、对发酵法生产β-胸苷具有现实的指导意义；本发明的检测方法精密度好、重复性高，能够快速、准确地测定β- 胸苷产品成品中β-胸苷的含量，有助于提高抗HIV药物关键中间体β-胸苷的质量和安全可控性。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述。

一种抗HIV药物关键中间体β-胸苷的检测方法，采用高效液相色谱法对β-胸苷的含量以及有关物质进行检测，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取β-胸苷产品成品，用流动相溶解并稀释成每1ml中约含1mgβ-胸苷的溶液，作为供试品溶液(需临用新制)；

(2)对照品溶液的制备：精密量取1mlβ-胸苷对照品，置100ml量瓶中，用流动相稀释至100ml刻度，摇匀，作为对照品溶液；

(3)采用高效液相色谱法对β-胸苷进行分析检测：

①、检测条件：所述高效液相色谱法所采用的检测器为紫外检测器，其色谱条件如下：色谱柱：C18柱或其他等效的色谱柱；流速： 0.8ml/min-1.2ml/min；色谱柱温度：25℃-35℃；检测波长：260nm-270nm；

②、检测方法：检测时，取对照品溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％；再精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍。

为保证产品质量，所述供试品溶液色谱图中的杂质峰，单个杂质峰面积不大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.5％)，各杂质峰面积的和不大于对照溶液主峰面积的2倍(2.0％)。

其中β-胸苷产品中β-胸苷的检测方法，具体包括如下步骤：

(1)样品制备：取β-胸苷产品成品50ml，18000r/min离心10分钟，取上清液，量取Xml置于容量瓶中，加水溶解并稀释至100倍体积，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，再取过滤液Yml移至量瓶中，加水稀释至10倍体积，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，得待测液；

(2)采用高效液相色谱进行分析检测，标准工作液设有不包含零点的六个浓度梯度，以β-胸苷量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，按外标法计算待测液中β-胸苷的含量，即得β-胸苷产品成品中β- 胸苷的含量。

实施例1有关物质的研究

利用高效液相色谱法分离目标成分

取β-胸苷产品，用流动相溶解并稀释成每1ml中约含1mg的溶液，作为供试品溶液(临用新制)；精密量取1mlβ-胸苷对照品，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。照含量测定项下的色谱条件，取对照品溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％，再精密量取供试品溶液与对照品溶液10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍。

二.目标成分化学成分归属

图谱杂质分析，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积是对照溶液主峰面积的0.28倍(0.28％)，各杂质峰面积的和是对照溶液主峰面积的1.1倍(1.1％)。

实施例2高效液相色谱法测定β-胸苷含量

一.仪器与样品和试剂

1.高效液相色谱仪：岛津高效液相色谱仪(LC-20A)，紫外检测器。

2.超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司KQ-300DE型数控超声波清洗器。

3.β-胸苷标准品、β-胸苷样品(样品批号：20180901)，由江西诚志生物工程有限公司提供。水为双蒸水、甲醇(色谱纯)。

二.系统适应性

分离度≥1.5、相对标准偏差≤2.0％、对称因子≤1.3、理论塔板数均≥ 2000。

三.色谱条件

色谱柱：Shim-pack ODS C18柱(4.6mm×250mm，5μm)或其他等效的色谱柱；

流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B，A相92％，B相8％；

流速：1.0ml/min；

检测器：紫外检测器；

色谱柱温度：30℃；

检测：265nm；

进样量：10μl。

四.供试品溶液和对照品溶液的制备

取β-胸苷产品成品100mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得，作为供试品溶液。另取β-胸苷对照品100mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得，作为对照品溶液。

下面对本发明所提供的检测方法进行方法学考察：

1.空白试验

按制备不含有β-胸苷产品成品的样品，按上述β-胸苷含量测定方法试验，结果在β-胸苷峰处未见干扰(β-胸苷主出峰时间约17.6min)。

2.色谱条件考察

色谱柱：Shim-pack ODS C18柱(4.6mm×250mm，5μm)或其他等效的色谱柱；

流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B，A相92％，B相8％；

流速：1.0/min；

检测器：紫外检测器；

色谱柱温度：30℃；

检测波长：265nm；

2.1.流动相的考察

色谱柱：Shim-pack ODS C18柱(4.6mm×250mm，5μm)或其他等效的色谱柱；

流速：1.0/min；

检测器：紫外检测器；

色谱柱温度：30℃；

检测波长：265nm；

流动相如下：

序号	流动相A％	流动相B％
			1	88	12
2	90	10
			3	92	8
4	94	6
			5	96	4

选择流动相3时，分离效果最好，所以选择流动相3作为检测β-胸苷的流动相，即以甲醇为流动相A，以水为流动相B，A相92％，B相8％。

2.2.检测波长的考察

由于β-胸苷在265nm处有最大吸收峰，所以选择检测波长265nm。

3.线性关系的考察

精密称取β-胸苷对照品适量，分别加流动相制成浓度为1.003mg/ml、 1.501mg/ml、2.004mg/ml、2.531mg/ml、3.052mg/ml、4.007mg/ml，以β- 胸苷浓度为横坐标，峰面积积分值缩小1000倍为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：Y＝6195.9X+102.93，r＝1结果表明β-胸苷的浓度在1.003～4.007mg/ml范围内峰面积积分值与浓度呈良好的线性关系(见表1)。

表1 β-胸苷标准曲线测定数据

编号	β-胸苷量(mg/ml)	峰面积积分值
			1	1.003	6304892
2	1.501	9419097
			3	2.004	12576716
4	2.531	15807584
			5	3.052	19039081
6	4.007	24949802

4.精密度试验

分别取同一对照品溶液与同一供试品溶液，各分别连续进样6次，测定峰面积值，对照品溶液与供试品溶液的RSD分别为0.19％和0.48％(见表2)。结果表明，该方法精密度良好。

表2 精密度试验结果

5.稳定性试验

取供试品溶液，配制后放置0、1、2、4、6、8、10、12h分别测定，结果表明在12h内稳定，见表3。

表3 稳定性试验结果

6.重复性试验

取同一批号(20180901)产品成品样品，按β-胸苷产品成品中β-胸苷残留含量测定方法重复测定6次得其平均含量为98.49％，RSD为0.10％。结果表明，该方法重复性良好(见表4)。

表4 重复性试验结果

7.回收率试验

按照样品中分别加样比例80％、100％、120％配置三个浓度的样品各3 份，按照β-胸苷残留含量的检测方法检测，计算平均回收率为97.92％ (n＝9)，RSD为0.81％(见表5)。结果表明，该法方法回收率良好。

表5 回收率试验

8.耐用性考察

本实验考察了三个品牌的高效液相色谱仪、三种流速的耐用性，结果见表6。

表6 β-胸苷产品成品中β-胸苷的含量

三台仪器同一色谱柱检测出的结果RSD为0.15％，同一仪器，同一色谱柱不同流速检测出的结果RSD为0.08％。结果表明，该方法耐用性良好。

本发明为β-胸苷产品成品中β-胸苷的测定提供了一种可靠的分析方法，具有操作简单、方便实用、安全环保等优点，对发酵法生产β-胸苷具有现实的指导意义，同时本发明的检测方法精密度好、重复性高，能够快速、准确地测定β-胸苷产品成品中β-胸苷的含量，有助于提高抗HIV药物关键中间体β-胸苷的质量和安全可控性。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。