一种多胺及其合成通路物质的检测方法
阅读说明：本技术 一种多胺及其合成通路物质的检测方法 (Polyamine and detection method of synthetic pathway substance thereof ) 是由 何敬全 王剑锋 刘瑜 盛正平 黄强 钟召赟 黄颖瑜 刘志鹏 于书红 秦欢欢 于 2019-12-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种多胺及其合成通路物质的检测方法,包括以下步骤：S1.取45-55mg样本于EP管中,加入500μL提取液,涡旋30秒；然后在一定的功率下进行研磨处理,将研磨后的样品在冰水浴下超声1-10min；重复研磨超声步骤3次,得混合物1；S2.将步骤S1得到的混合物1在-20摄氏度静置50-70min；然后在4摄氏度,12000rpm下离心10-20min,得上清液1；S3.取100μL上清液1于EP管中,加入50μL碳酸钠溶液和50μL 20mg/mL衍生化试剂,涡旋混匀；40摄氏度避光衍生反应1h；S4.将衍生反应后的溶液中加入1％甲酸水溶液,涡旋30s；然后在4摄氏度,12000rpm下离心10-20min；得上清液2,作为待检测液；S5.标准溶液配制；S6.将步骤S4得到的待检测液和步骤S5得到的标准溶液进行UHPLC-MS/MS检测分析,计算多胺的含量。(The invention discloses a method for detecting polyamine and a synthetic pathway substance thereof, which comprises the following steps: s1, putting a 45-55mg sample into an EP tube, adding 500 mu L of extracting solution, and vortexing for 30 seconds; then grinding under certain power, and carrying out ultrasonic treatment on the ground sample for 1-10min in ice-water bath; repeating the grinding and ultrasonic steps for 3 times to obtain a mixture 1; s2, standing the mixture 1 obtained in the step S1 for 50-70min at-20 ℃; centrifuging at 12000rpm at 4 deg.C for 10-20min to obtain supernatant 1; s3, taking 100 mu L of supernatant fluid 1, putting the supernatant fluid into an EP tube, adding 50 mu L of sodium carbonate solution and 50 mu L of 20mg/mL derivatization reagent, and uniformly mixing by vortex; carrying out light-shielding derivatization reaction for 1h at 40 ℃; s4, adding 1% formic acid water solution into the solution after the derivatization reaction, and performing vortex operation for 30 s; then centrifuging for 10-20min at 4 ℃ and 12000 rpm; obtaining supernatant 2 as a liquid to be detected; s5, preparing a standard solution; s6, carrying out UHPLC-MS/MS detection analysis on the solution to be detected obtained in the step S4 and the standard solution obtained in the step S5, and calculating the content of polyamine.)
技术领域
本申请属于多胺检测技术领域，具体涉及一种多胺及其合成通路物质的检测方法。
背景技术
多胺是一类含有两个或更多氨基的化合物，其合成的原料主要为鸟氨酸和精氨酸，关键酶是鸟氨酸脱羧酶和精氨酸脱羧酶。最普遍也是有重要生理功能的多胺是腐胺，尸胺，亚精胺，精胺等.多胺有促进某些组织生长的作用，对于膜的正常维持也起着重要的作用。
多胺具有多聚阳离子特性，能与带负电荷的膜磷脂及酶蛋白结合，是植物生长发育的重要调节物质，参与植物的生长发育、果实成熟与衰老、性别分化、延迟衰老以及逆境胁迫等重要生理过程，还参与生化过程，包括DNA的复制转录、膜稳定、RNA和蛋白质的翻译等。在环境胁迫下，植物体内积累大量的多胺类物质，对稳定细胞膜、核酸及蛋白质等大分子物质的构象有重要的作用，故被认为是一类与植物逆境生理有密切关系的物质；关于多胺的作用机制，一般认为其作为植物激素的媒介，像cAMP一样起着“第二信使”的作用，因此检测植物体内的多胺含量是非常有意义的。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的第一个方面提供了一种多胺及其合成通路物质的检测方法，包括以下步骤：
S1.取45-55mg样本于EP管中，加入500μL提取液，涡旋30秒；然后在一定的功率下进行研磨处理，将研磨后的样品在冰水浴下超声1-10min；重复研磨超声步骤3次，得混合物1；
S2.将步骤S1得到的混合物1在-20摄氏度静置50-70min；然后在4摄氏度，12000rpm下离心10-20min，得上清液1；
S3.取100μL上清液1于EP管中，加入50μL碳酸钠溶液和50μL 20mg/mL衍生化试剂，涡旋混匀；40摄氏度避光衍生反应1h；
S4.将衍生反应后的溶液中加入1％甲酸水溶液，涡旋30s；然后在4摄氏度，12000rpm下离心10-20min；得上清液2，作为待检测液；
S5.标准溶液配制；
S6.将步骤S4得到的待检测液和步骤S5得到的标准溶液进行UHPLC-MS/MS检测分析，计算多胺的含量。
作为一种优选的技术方案，所述步骤S1中提取液为乙腈、碳原子数为1-2的一元醇与水的混合溶液，所述乙腈、碳原子数为1-2的一元醇、水的体积比为(1-3)：2：1。
作为一种优选的技术方案，所述乙腈、碳原子数为1-2的一元醇、水的体积比为2：2：1。
作为一种优选的技术方案，所述提取液为乙腈、甲醇与水的混合溶液，所述乙腈、甲醇、水的体积比为2：2：1。
作为一种优选的技术方案，所述步骤S3中所述衍生化试剂为丹磺酰氯或苯甲酰氯。
作为一种优选的技术方案，所述步骤S3中所述衍生化试剂为丹磺酰氯。
作为一种优选的技术方案，所述步骤S6中，液相色谱流动相A为甲酸铵/甲酸溶液，流动相B为乙腈。
作为一种优选的技术方案，液相色谱流动相A为9-11mM甲酸铵/甲酸溶液，流动相B为乙腈。
作为一种优选的技术方案，所述液相色谱的梯度洗脱条件为：
0-0.5min：流动相A为75％→75％，流动相B为25％→25％；
0.5-5.9min：流动相A为75％→2％，流动相B为25％→98％；
5.9-9.4min：流动相A为2％→2％，流动相B为98％→98％；
9.4-9.5min：流动相A为2％→75％，流动相B为98％→25％；
9.5-12min：流动相A为75％→75％，流动相B为25％→25％。
作为一种优选的技术方案，所述步骤S6中，质谱的离子源参数如下：Capillaryvoltage＝+4000/-3500V，nozzle voltage＝+500/-500V，gas(N2)temperature＝300℃，gas(N2)flow＝5L/min，sheath gas(N2)temperature＝250℃，sheath gas flow＝11L/min，nebulizer＝45psi。
有益效果：本实验优化了样品的前处理条件，首次尝试采用UHPLC-MS/MS，建立了柑橘根系中9种生物胺提取方法及准确定量检测的方法。在所建立的色谱条件下，可以在9分钟内检测到样品。所述方法重现性好、简便、快速、准确、可靠，适用于大批量样品的快速检测。
附图说明
图1为本发明实施例1柑橘根系的提取离子色谱图(EICs)。
图2为本发明实施例1标准溶液的提取离子色谱图(EICs)。
符号说明：1-鲱精胺；2-精氨酸；3-腐胺；4-尸胺；5-鸟氨酸；6-亚精胺；7-S-腺苷蛋氨酸；8-精胺。
具体实施方式
为了解决上述问题，本发明提供了一种多胺及其合成通路物质的检测方法，包括以下步骤：
S1.取45-55mg样本于EP管中，加入500μL提取液，涡旋30秒；然后在一定的功率下进行研磨处理，将研磨后的样品在冰水浴下超声1-10min；重复研磨超声步骤3次，得混合物1；
S2.将步骤S1得到的混合物1在-20摄氏度静置50-70min；然后在4摄氏度，12000rpm下离心10-20min，得上清液1；
S3.取100μL上清液1于EP管中，加入50μL碳酸钠溶液和50μL 20mg/mL衍生化试剂，涡旋混匀；40摄氏度避光衍生反应1h；
S4.将衍生反应后的溶液中加入1％甲酸水溶液，涡旋30s；然后在4摄氏度，12000rpm下离心10-20min；得上清液2，作为待检测液；
S5.标准溶液配制；
S6.将步骤S4得到的待检测液和步骤S5得到的标准溶液进行UHPLC-MS/MS检测分析，计算多胺的含量。
其中，所述多胺及其合成通路物质提取于柑橘根系，指腐胺、亚精胺、精胺、尸胺、鸟氨酸、精氨酸、S-腺苷蛋氨酸、鲱精胺。
所述柑橘(Citrus reticulata Blanco)属芸香科下属植物。
作为一种优选的实施方式，所述步骤S1中提取液为乙腈、碳原子数为1-2的一元醇与水的混合溶液，所述乙腈、碳原子数为1-2的一元醇、水的体积比为(1-3)：2：1。
优选的，所述乙腈、碳原子数为1-2的一元醇、水的体积比为2：2：1。
优选的，所述提取液为乙腈、甲醇与水的混合溶液，所述乙腈、甲醇、水的体积比为(1-3)：2：1。
更优选的，所述提取液为乙腈、甲醇与水的混合溶液，所述乙腈、甲醇、水的体积比为2：2：1。
样品的前处理过程是提取目标化合物的全过程。所述提取是指利用物理、化学、生化的原理和方法，在不破坏目标化合物的结构和功能的条件下，较高纯度的分离出目标化合物的方法，是一项严格、细致、复杂的工艺过程。
在测定柑橘根系中多胺的含量时，由于柑橘根系中含有糖类、蛋白质、氨基酸等多种物质，需要将多胺进行提取，目前所用的提取剂一般为水和酸性溶液(例如三氯乙酸、盐酸等)，但是本申请中采用酸性溶液进行提取检测的结果并不理想，本申请人发现，所述提取液为乙腈、碳原子数为1-2的一元醇与水的混合溶液，且所述乙腈、碳原子数为1-3的一元醇、水的体积比为2：2：1时，能够提高检测的准确度，猜测是因为一方面不同的溶剂形成极性适当的提取液，另一方面乙腈中碳原子和氮原子通过叁键相连，甲醇中含有的羟基和甲基与水三者协同，促进了腐胺、亚精胺、精胺、尸胺、鸟氨酸、精氨酸、S-腺苷蛋氨酸、鲱精胺的析出，同时也阻止了其他氨基酸、糖醛酸等的析出，从而提高了检测的准确度。
步骤S1中，所述研磨功率为45Hz。
作为一种优选的实施方式，所述步骤S1具体为：取50mg样本于EP管中，加入500μL提取液，涡旋30秒；然后在45Hz下进行研磨处理4min，将研磨后的样品在冰水浴下超声5min；重复研磨超声步骤3次，得混合物1；
作为一种优选的实施方式，所述步骤S2具体为：将步骤S1得到的混合物1在-20摄氏度静置60min；然后在4摄氏度，12000rpm下离心15min，得上清液1。
作为一种优选的实施方式，所述步骤S3中所述衍生化试剂为丹磺酰氯或苯甲酰氯。
所述步骤S3中所述衍生化试剂为丹磺酰氯或苯甲酰氯。
优选的，所述步骤S3中所述衍生化试剂为丹磺酰氯。
所述步骤S3中碳酸钠溶液为碳酸钠饱和溶液。
所述步骤S4中1％甲酸水溶液指体积百分数。
由于腐胺、尸胺、亚精胺、精胺等结构差异较少，主要体现在相差一个或多个氨丙基或氨乙基上，本申请以丹磺酰氯作为衍生化试剂，丹磺酰氯在碳酸钠的条件下，主要与伯胺基反应，剩余次级胺基的存在使得丹磺化产物与Waters ACQUITY UHPLC HSS T3色谱柱上的1.8微米的高强度硅胶颗粒产生不同程度的结合力，从而能够实现很好的分离，提高了检测的准确度、灵敏度。而且我们选用BEH-C18柱子时，腐胺、亚精胺与尸胺的保留时间分别为5.01，16.91和9.03min，在同样的色谱条件下，选用丹磺酰氯与ACQUITY UHPLC HSS T3色谱柱结合使用，腐胺、亚精胺与尸胺的保留时间分别为6.20，7.35和6.71min，可以在10分钟之内实现多胺的分离，而且具有很好的分离度。选用苯甲酰氯作为衍生化试剂，检测效果较差，可能是因为苯甲酰氯与多胺的反应是将苯甲酰基基团连在一级和二级氨基上，利用紫外检测不能实现很好的分离。
S5.标准溶液的配置
具体步骤为：
(1)准确称取相应量的标准品于10mL容量瓶中，加入溶剂(乙腈：甲醇：水＝2：2：1)，分别配制成10mmol/L的标准品储备液。
(2)然后取相应量的标准品储备液于10mL容量瓶中，配制成混合标准溶液。加入溶剂(乙腈：甲醇：水＝2：2：1)依次稀释该混合标准溶液得一系列标准溶液，多胺的系列标准品溶液浓度见表1，单位nmol/L。
(3)将得到的系列标准溶液按照步骤S3和S4的方法进行衍生处理，将衍生处理后的进行上机检测得到标准曲线方程。
表1多胺的系列标准品溶液浓度
S6.上机检测
所述UHPLC的条件为：使用Agilent 1290Infinity IIseries(AgilentTechnologies)超高效液相色谱仪，通过Waters ACQUITY UHPLC HSS T3(100×2.1mm,1.8μm,Waters)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。
液相色谱流动相A为10mM甲酸铵/甲酸溶液，流动相B为乙腈；
所述液相色谱的梯度洗脱条件为：
0-0.5min：流动相A为75％→75％，流动相B为25％→25％；
0.5-5.9min：流动相A为75％→2％，流动相B为25％→98％；
5.9-9.4min：流动相A为2％→2％，流动相B为98％→98％；
9.4-9.5min：流动相A为2％→75％，流动相B为98％→25％；
9.5-12min：流动相A为75％→75％，流动相B为25％→25％。
所述10mM甲酸铵/甲酸溶液指甲酸铵在甲酸中的浓度为10mM。
柱温箱温度为35摄氏度，样品盘设为4摄氏度，进样体积为1μL，流速为0.4mL/min。
由于腐胺、尸胺、亚精胺、精胺等结构差异较少，主要体现在相差一个或多个氨丙基或氨乙基上，本申请以丹磺酰氯作为衍生化试剂，丹磺酰氯在碳酸钠的条件下，主要与伯胺基反应，剩余次级胺基的存在使得丹磺化产物与Waters ACQUITY UHPLC HSS T3色谱柱上的1.8微米的高强度硅胶颗粒产生不同程度的结合力，从而能够实现很好的分离，提高了检测的准确度、灵敏度。而且我们选用BEH-C18柱子时，腐胺、亚精胺与尸胺的保留时间分别为5.01，16.91和9.03min，在同样的色谱条件下，选用丹磺酰氯与ACQUITY UHPLC HSS T3色谱柱结合使用，腐胺、亚精胺与尸胺的保留时间分别为6.20，7.35和6.71min，可以在9分钟之内实现多胺的分离，而且具有很好的分离度。选用苯甲酰氯作为衍生化试剂，检测效果较差，可能是因为苯甲酰氯与多胺的反应是将苯甲酰基基团连在一级和二级氨基上，不能实现很好的分离。
本申请人还发现，选用液相色谱流动相A为10mM甲酸铵/甲酸溶液，流动相B为乙腈，以及以不同比例进行洗脱时，能够提高检测的准确度、灵敏度等。猜测是因为甲酸铵与甲酸的混合溶液能够调节乙腈在不同时间段与色谱柱的填充颗粒接触的时间及结合程度，同时通过乙腈调节保留时间，可以实现部分目标化合物不同时间出峰；达到很好的分离效果。乙腈的含量高时，可缩短分离时间，但是导致出峰不完全，组分得不到完全分离。
所述质谱条件为：使用装备AJS-ESI离子源的Agilent 6460三重四极杆质谱仪，以多反应监测(MRM)模式进行质谱分析。
离子源参数如下：Capillary voltage＝+4000/-3500V，nozzle voltage＝+500/-500V，gas(N2)temperature＝300℃，gas(N2)flow＝5L/min，sheath gas(N2)temperature＝250℃，sheath gas flow＝11L/min，nebulizer＝45psi。
进行UHPLC-MS/MS分析之前，将目标化合物标准品储备液引入质谱中，针对每个目标化合物，选取信号强度最高的数个母离子-子离子对(transition)，对其MRM参数进行优化，并选取其中响应最好的离子对用于定量分析，其它离子对用于目标化合物定性分析，具体参数见表2。
本项目中，所有质谱数据采集及目标化合物定量分析工作，均通过AgilentMassHunterWork Station Software(B.08.00,Agilent Technologies)来完成。
表2
本申请人发现，流动相的选择除考虑色谱的分离效果外还要考虑化合物的离子化，由于本申请选用电喷雾离子化，正负离子模式，在流动相中添加甲酸铵与甲酸的混合溶液有利于目标化合物的离子化和改善色谱峰。
下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售得到的。
实施例
实施例1
一种多胺及其合成通路物质的检测方法，包括以下步骤：
S1.取50mg柑橘根系于EP管中，加入500μL提取液，涡旋30秒；然后在45Hz下进行研磨处理4min，将研磨后的样品在冰水浴下超声5min；重复研磨超声步骤3次，得混合物1；
S2.将步骤S1得到的混合物1在-20摄氏度静置60min；然后在4摄氏度，12000rpm下离心15min，得上清液1；
S3.取100μL上清液1于EP管中，加入50μL碳酸钠饱和溶液和50μL 20mg/mL衍生化试剂，涡旋混匀；40摄氏度避光衍生反应1h；
S4.将衍生反应后的溶液中加入1％甲酸水溶液，涡旋30s；然后在4摄氏度，12000rpm下离心15min；得上清液2，作为待检测液；
S5.标准溶液配制；
S6.将步骤S4得到的待检测液和步骤S5得到的标准溶液进行UHPLC-MS/MS检测分析，计算多胺的含量。
所述步骤S1中，所述提取液为乙腈、甲醇与水的混合溶液，所述乙腈、甲醇、水的体积比为2：2：1。
所述步骤S3中所述衍生化试剂为丹磺酰氯。
步骤S5中标准溶液的配置：
具体步骤为：
(1)准确称取相应量的标准品于10mL容量瓶中，加入溶剂(乙腈：甲醇：水＝2：2：1)，分别配制成10mmol/L的标准品储备液。
(2)然后取相应量的标准品储备液于10mL容量瓶中，配制成混合标准溶液。加入溶剂(乙腈：甲醇：水＝2：2：1)依次稀释该混合标准溶液得一系列标准溶液，多胺的系列标准品溶液浓度见表1，单位nmol/L。
(3)将得到的系列标准溶液按照步骤S3和S4的方法进行衍生处理，将衍生处理后的进行上机检测得到标准曲线方程。
步骤S6.上机检测的具体条件为：
所述UHPLC的条件为：使用Agilent 1290Infinity IIseries(AgilentTechnologies)超高效液相色谱仪，通过Waters ACQUITY UHPLC HSS T3(100×2.1mm,1.8μm,Waters)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。
液相色谱流动相A为10mM甲酸铵/甲酸溶液，流动相B为乙腈；
所述液相色谱的梯度洗脱条件为：
0-0.5min：流动相A为75％→75％，流动相B为25％→25％；
0.5-5.9min：流动相A为75％→2％，流动相B为25％→98％；
5.9-9.4min：流动相A为2％→2％，流动相B为98％→98％；
9.4-9.5min：流动相A为2％→75％，流动相B为98％→25％；
9.5-12min：流动相A为75％→75％，流动相B为25％→25％。
柱温箱温度为35摄氏度，样品盘设为4摄氏度，进样体积为1μL，流速为0.4mL/min。
所述质谱条件为：使用装备AJS-ESI离子源的Agilent 6460三重四极杆质谱仪，以多反应监测(MRM)模式进行质谱分析。
离子源参数如下：Capillary voltage＝+4000/-3500V，nozzle voltage＝+500/-500V，gas(N2)temperature＝300℃，gas(N2)flow＝5L/min，sheath gas(N2)temperature＝250℃，sheath gas flow＝11L/min，nebulizer＝45psi。
进行UHPLC-MS/MS分析之前，将目标化合物标准品储备液引入质谱中，针对每个目标化合物，选取信号强度最高的数个母离子-子离子对(transition)，对其MRM参数进行优化，并选取其中响应最好的离子对用于定量分析，其它离子对用于目标化合物定性分析，具体参数见表2。
本项目中，所有质谱数据采集及目标化合物定量分析工作，均通过AgilentMassHunterWork Station Software(B.08.00,Agilent Technologies)来完成。
所述多胺及其合成通路物质指腐胺、亚精胺、精胺、尸胺、鸟氨酸、精氨酸、S-腺苷蛋氨酸、鲱精胺。
实施例2
一种多胺及其合成通路物质的检测方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，所述步骤S1中，所述提取液为乙腈、甲醇与水的混合溶液，所述乙腈、甲醇、水的体积比为4：2：1。
步骤S5中标准溶液的配置：
具体步骤为：
(1)准确称取相应量的标准品于10mL容量瓶中，加入溶剂(乙腈：甲醇：水＝4：2：1)，分别配制成10mmol/L的标准品储备液。
(2)然后取相应量的标准品储备液于10mL容量瓶中，配制成混合标准溶液。加入溶剂(乙腈：甲醇：水＝4：2：1)依次稀释该混合标准溶液得一系列标准溶液，多胺的系列标准品溶液浓度见表1，单位nmol/L。
(3)将得到的系列标准溶液按照步骤S3和S4的方法进行衍生处理，将衍生处理后的进行上机检测得到标准曲线方程。
实施例3
一种多胺及其合成通路物质的检测方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，所述步骤S1中，所述提取液为乙腈、甲醇与水的混合溶液，所述乙腈、甲醇、水的体积比为2：4：1。
步骤S5中标准溶液的配置：
具体步骤为：
(1)准确称取相应量的标准品于10mL容量瓶中，加入溶剂(乙腈：甲醇：水＝2：4：1)，分别配制成10mmol/L的标准品储备液。
(2)然后取相应量的标准品储备液于10mL容量瓶中，配制成混合标准溶液。加入溶剂(乙腈：甲醇：水＝2：4：1)依次稀释该混合标准溶液得一系列标准溶液，多胺的系列标准品溶液浓度见表1，单位nmol/L。
(3)将得到的系列标准溶液按照步骤S3和S4的方法进行衍生处理，将衍生处理后的进行上机检测得到标准曲线方程。
实施例4
一种多胺及其合成通路物质的检测方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，所述步骤S1中，所述提取液为乙腈、乙醇与水的混合溶液，所述乙腈、乙醇、水的体积比为4：2：1。
步骤S5中标准溶液的配置：
具体步骤为：
(1)准确称取相应量的标准品于10mL容量瓶中，加入溶剂(乙腈：乙醇：水＝2：2：1)，分别配制成10mmol/L的标准品储备液。
(2)然后取相应量的标准品储备液于10mL容量瓶中，配制成混合标准溶液。加入溶剂(乙腈：乙醇：水＝2：2：1)依次稀释该混合标准溶液得一系列标准溶液，多胺的系列标准品溶液浓度见表1，单位nmol/L。
(3)将得到的系列标准溶液按照步骤S3和S4的方法进行衍生处理，将衍生处理后的进行上机检测得到标准曲线方程。
实施例5
一种多胺及其合成通路物质的检测方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，所述步骤S3中所述衍生化试剂为苯甲酰氯。结合紫外检测，检测波长为230nm。
实施例6
一种多胺及其合成通路物质的检测方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，所述UHPLC的条件为：使用Agilent 1290Infinity IIseries(Agilent Technologies)超高效液相色谱仪，通过BEH-C18液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。
实施例7
一种多胺及其合成通路物质的检测方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，液相色谱流动相A为8mM甲酸铵/甲酸溶液，流动相B为乙腈。
实施例8
一种多胺及其合成通路物质的检测方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，液相色谱流动相A为12mM甲酸铵/甲酸溶液，流动相B为乙腈。
实施例9
一种多胺及其合成通路物质的检测方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，液相色谱流动相A为10mM甲酸铵/乙酸溶液，流动相B为乙腈。
实施例10
一种多胺及其合成通路物质的检测方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，所述液相色谱的梯度洗脱条件为：
0-0.5min：流动相A为75％→75％，流动相B为25％→25％；
0.5-5.9min：流动相A为75％→25％，流动相B为25％→75％；
5.9-9.4min：流动相A为25％→2％，流动相B为75％→98％；
9.4-9.5min：流动相A为2％→75％，流动相B为98％→25％；
9.5-12min：流动相A为75％→75％，流动相B为25％→25％。
实施例11
一种多胺及其合成通路物质的检测方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，所述液相色谱的梯度洗脱条件为：
0-0.5min：流动相A为75％→75％，流动相B为25％→25％；
0.5-5.9min：流动相A为75％→10％，流动相B为25％→90％；
5.9-9.4min：流动相A为10％→5％，流动相B为90％→95％；
9.4-9.5min：流动相A为5％→75％，流动相B为95％→25％；
9.5-12min：流动相A为75％→75％，流动相B为25％→25％。
性能测试
(1)相关系数(R2)：对各实施例所述的表1系列标准品溶液进行UHPLC-MS/MS分析，以y表示待测多胺的峰面积，x表示待测多胺的浓度(nmol/L)，计算相关系数(R2)。
(2)方法检出限和定量限：
取表1中的标2溶液进行UHPLC-MS/MS分析，通过其信噪比来计算方法的检出限和定量限。方法最低检出限(LLOD)定义为信噪比为3时所对应的化合物浓度，方法最低定量限(LLOQ)定义为信噪比为10时所对应的化合物浓度。
(3)方法精密度及准确度：
取QC样品进行UHPLC-MS/MS分析，方法的精密度通过重复进样的标准相对偏差(RSD)来评估。准确度通过加标回收率(Recovery)来评估，测得浓度与加标浓度的百分比值即为加标回收率。
QC样品中：腐胺的浓度为5000nmol/L，亚精胺的浓度为500nmol/L，精胺的浓度为500nmol/L，尸胺的浓度为500nmol/L，鸟氨酸的浓度为500nmol/L，精氨酸的浓度为10000nmol/L，S-腺苷蛋氨酸的浓度为5000nmol/L，鲱精胺的浓度为5000nmol/L。
(4)实际样品分析：采用实施例1的测试条件对5份柑橘根系进行分析，采用标准曲线进行定量，测试结果见表4，单位为nmol/L。
实施例1的测试结果见表3。
实施例2-11的测试结果见表5(由于数据较多，实施例2-11以鲱精胺的部分测试结果为代表)。
表3实施例1的测试结果
表4
表5实施例2-11的测试结果
从图1、图2中可以看出：本申请所采用的分析方法，所有目标化合物均呈现出对称的色谱峰；而且很好地实现了各个目标化合物的色谱分离；所述柑橘根系中的目标化合物与标准品溶液中的保留时间及色谱峰形均无明显差异。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对发明作其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或更改为等同变化的等效实施例，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。