一种生物素中间体双氨基物的hplc检测方法
阅读说明：本技术 一种生物素中间体双氨基物的hplc检测方法 (HPLC detection method of biotin intermediate diamino substance ) 是由 吕国锋 王昌泽 单国红 杭姣 王振振 李小军 段文杰 韦念想 于 2019-12-27 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物素中间体含量检测技术领域,具体涉及一种生物素合成中的过程中间体双氨基物的HPLC检测方法。该方法包括如下步骤：用流动相溶解生物素合成过程中的环合反应液后在以下色谱条件下进行检测：色谱柱C18-WCX混合柱；检测波长为195-220nm,测试时间为16-20min,流动相为乙腈-磷酸盐缓冲液。本发明提供的检测方法可以在使待测物质双氨基物的出峰时间稳定在10-12min,解决了双氨基物与溶剂峰出峰重合的问题,使得监测更加准确、可靠。(The invention belongs to the technical field of biotin intermediate content detection, and particularly relates to an HPLC (high performance liquid chromatography) detection method of a diamino compound as an intermediate in a biotin synthesis process. The method comprises the following steps: after the cyclization reaction solution in the biotin synthesis process is dissolved by using a mobile phase, detection is carried out under the following chromatographic conditions: chromatographic column C18-WCX mixed column; the detection wavelength is 195-220nm, the detection time is 16-20min, and the mobile phase is acetonitrile-phosphate buffer solution. The detection method provided by the invention can stabilize the peak emergence time of the diamino substance to be detected within 10-12min, solve the problem of peak emergence coincidence of the diamino substance and the solvent, and ensure that the monitoring is more accurate and reliable.)
技术领域
本发明属于生物素中间体含量检测技术领域，具体涉及一种生物素合成中的过程中间体双氨基物的HPLC检测方法。
背景技术
生物素(如下式a)合成过程中会产生一种双氨基物(如下式b)，该物质是脲酸生成生物素的中间过程物，经羰基化及后处理可得d-生物素。
现有技术中的方法，都以生物素为检测的目标产物，导致能转化为生物素的双氨基物被忽视。因为双氨基物出现在死时间附近，不易确定其残留，从而影响生物素的整体收率。目前，生物素的检测方法主要有微生物法、液相色谱法、酶联免疫分析法、光谱法和电化学法等。微生物法操作费时、费力，成本高；酶联免疫法和光谱法虽然操作简单、分析速度快且准确度高，但市场造价较高，难以在生产上进行推广应用。且以上方法都是基于生物素的检测，而对于杂质的检测欠缺准确性和灵敏性。
经检索，中国专利文献CN200810162138-D-生物素及其杂质含量的HPLC测定方法公开了一种定量检测d-生物素及其杂质含量的方法。本发明采用高效液相色谱法检测时的色谱条件为：采用反相C18柱，质量浓度为0.05％的三氟乙酸水溶液-乙腈的流动相，0.5-1.5ml/min的流速，210-220nm的检测波长，流动相中三氟乙酸水溶液与乙腈的体积比为60-80∶40-20；用流动相溶解含杂质的d-生物素并稀释，进样测定，通过高效液相色谱仪检测d-生物素及其各个杂质的含量。这些杂质A-H结构如下所示：
使用该方法满足了生物素定量检测的需要，而且具有较高的灵敏度(检测限低至0.5ng)，有助于提高生物素的质量控制。
但是该发明提供的实施例，供试品是采用生物素及各杂质溶解后配制而成，其直接采用了流动相作为溶剂。由其出峰图可以看出，杂质双氨基物(结构C)出峰较早(大约1.5-2min左右)。该发明的检测方法适用于最终产品质量检测，而在实际生产过程中，合成生物素的反应溶剂通常是甲醇、甲苯、氢溴酸等。当采用该方法直接检测反应液时，则会出现双氨基物C与溶剂峰重合，无法准确检测其含量的问题。所以，上述方法并无法直接适用于生物素制备过程中反应液的直接检测。
在生物素制备过程中，需要随时监测中间体及产物的含量，以提高产物收率。为此，亟需提出一种具有针对性的用于双氨基物的定量检测的方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种生物素中间体双氨基物的HPLC检测方法。该方法检测结果准确、可靠、操作简便。而且利用该检测方法可以更好的掌握双氨基物的含量，以便于有效控制其转化率，进而提高生物素的整体收率。
为了实现上述发明目的，本发明提供了如下技术方案：
一种生物素中间体双氨基物的HPLC检测方法，其包括如下步骤：采用流动相将含有生物素和双氨基物的样品溶解后在以下色谱条件下进行检测：色谱柱C18－WCX混合柱；
检测波长为195-220nm，测试时间为16-20min，流动相为乙腈-磷酸盐缓冲液。
所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾缓冲液。
优选地，所述磷酸盐缓冲液为0.01-0.03mol/L。进一步优选为0.015mol/L。
优选地，流动相乙腈-磷酸盐中乙腈与磷酸盐缓冲液的配比为：60％-80％：40％-20％，优选乙腈-磷酸盐配比为70％：30％。
优选地，HPLC检测过程中采用等浓度洗脱。
优选地，所述检测波长为200nm。
优选地，所述生物素的结构式如下(a)，双氨基物结构式如下(b)：
优选地，所述含有生物素和双氨基物的样品与流动相的比例为：0.05g：10mL。
优选地，进样体积：10uL、柱温为30℃；流速：1.0-1.5mL/min。
优选地，双氨基物的含量计算公式为：
式中：A双氨基—样品溶液色谱图中双氨基物对应的峰面积；ΣAi—样品溶液色谱图中各组分对应的峰面积之和。
与现有技术相比，本发明所取得的有益效果是：
(1)本发明提供的检测方法可以在使待测物质双氨基物的出峰时间稳定在10-12min，解决了双氨基物与溶剂峰出峰重合的问题，使得监测更加准确、可靠。
(2)本发明提供的检测方法能够更准确的掌握生物素中杂质双氨基物的含量，可更好的控制反应终点，将双氨基物有效转化为生物素，使生物素的收率平均提高10％左右。
(3)本发明提供的检测方法精密度高，经重复性试验验证，双氨基物的色谱峰面积和保留时间的相对标准偏差范围分别为0.31％-1.20％和0.14％-1.94％。
(4)该方法检出限低，双氨基物的最小检测限度为1.2ng。
附图说明
图1为本发明双氨基物标准物在195nm处的HPLC检测结果色谱图；
图2为本发明双氨基物标准物在200nm处的HPLC检测结果色谱图；
图3为本发明双氨基物标准物在210nm处的HPLC检测结果色谱图；
图4为本发明双氨基物标准物在220nm处的HPLC检测结果色谱图；
图5为反应液中双氨基物在195nm处的HPLC检测结果色谱图；
图6为反应液中双氨基物在200nm处的HPLC检测结果色谱图；
图7为反应液中双氨基物在210nm处的HPLC检测结果色谱图；
图8为反应液中双氨基物在220nm处的HPLC检测结果色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
1、仪器与试剂
仪器型号：戴安液相色谱仪，U3000
试剂：乙腈为色谱纯试剂，其他试剂为分析纯试剂
2、标准品溶液的配制
双氨基物标准物溶液配制：取适量的氨基物标准物溶于流动相中，必要时超声处理使完全溶解。
缓冲液的配制：称取0.015moL的磷酸氢二钾溶于1L去离子水中，并用0.22um微孔滤膜过滤后备用，且现配现用。
3、待测样品的配制
用毛细管取0.05g的生物素合成后的反应液至15ml取样瓶内，加10mL流动相溶解，超声后备用。
本专利中生物素的制备过程为：脲酸上溴生成单苄并快速转化为生物素，但同时因过度反应而开环生成双氨基物，双氨基物通过光化环合重新生成生物素。所述生物素合成后的反应液是指光化环合反应结束时的反应液(光化反应液)。如下给出生物素的具体制备实施例：
在带有精馏塔的500ml四口烧瓶中，投入双苄基生物素(30g，70mmol)和300ml一定浓度的氢溴酸，于130℃下搅拌反应，反应过程中及时从精馏塔顶分离溴化苄。用HPLC监测反应完全后，冷却至80℃，加入100ml甲苯萃取分层，得到的水层中含有生物素和过度反应生成的双氨基物，减压回收其中的氢溴酸。回收毕，加入氢氧化钠溶液调节PH至9-10，于-5℃冰浴下滴入固体光气甲苯溶液(50ml，16mmol)，滴加固体光气过程中持续加入氢氧化钠溶液维持反应体系PH 9-10。滴加毕继续保温搅拌30min，取样监测反应结果。该样品即为光化反应液，需要静置5-10min，取水层进行检测。
4、检测波长的选择
称取双氨基标准物，用流动相配制成合适浓度的溶液，在紫外190-400nm波长范围内扫描，结果显示，在200nm处，双氨基物的响应值最高，因此检测波长优选200nm。不同波长下双氨基物的高效液相检测结果色谱图如图1-4所示。
5、色谱柱条件
色谱柱：AcclaimTM Mixed-Mode WCX-1；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
测试时间：20min；
进样体积：20uL；
流动相：乙腈-磷酸二氢钾缓冲液(70％：30％)。
6、洗脱方式：等浓度洗脱。
7、检测结果：如上反应液在不同波长的高效液相检测结果色谱图如图5-8所示。
对比图5-8可以明显看出，波长在195-220nm条件下，双氨基物出峰时间稳定在10-12min，均与其它杂质较好的分离开。而且反应液中的所有杂质均在16min左右完全出峰。检测时间短。
如上反应液中各杂质的含量测定结果如下表1所示。
195nm虽然响应更好，但基线开始变差；220nm，各种峰响应开始改变，综合来讲200nm测试结果更佳。
方法学考察
1、精密度考察
取100倍稀释的双氨基物标准品，在如上检测条件下进行7次重复性试验，得到的双氨基物的色谱峰面积和保留时间的相对标准偏差范围分别为0.31％-1.20％和0.14％-1.94％，表明本方法精密度良好。
2、检测限
在本发明中的色谱条件下，用流动相在室温条件下逐步溶解双氨基标准品溶液，进样检测，进行分析，计算的双氨基物的最小检测限度为1.2ng。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。