阅读说明：本技术 同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法 (Method for simultaneously detecting contents of retinol and α -tocopherol in blood ) 是由 贾永娟 雒琴 倪君君 于 2019-12-02 设计创作，主要内容包括：本发明提供了同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法,该方法包括：基于特定的液相条件,利用高效液相色谱仪,分别检测至少三个标准溶液,得到各个标准溶液的色谱图,各标准溶液中均含有浓度已知的视黄醇和α-生育酚的标准品及内标物；根据各个标准溶液的色谱图,拟合得到视黄醇和α-生育酚的标准曲线方程；将混合内标工作液添加到经处理至少2mL待检测血液而得到的血液样本中,经样本前处理以得到待测样本；同样检测待测样本得到其色谱图；根据待测样本的色谱图和各个标准曲线方程,计算血液样本中视黄醇和α-生育酚的含量。本发明能够更加快速的同时检测血液中视黄醇和α-生育酚的含量。(The invention provides a method for simultaneously detecting contents of retinol and α -tocopherol in blood, which comprises the steps of respectively detecting at least three standard solutions by utilizing a high performance liquid chromatograph based on specific liquid phase conditions to obtain chromatograms of the standard solutions, wherein each standard solution contains standard products and internal standard substances of the retinol and α -tocopherol with known concentrations, fitting the standard curve equations of the retinol and α -tocopherol according to the chromatograms of the standard solutions, adding mixed internal standard working solution into a blood sample obtained by processing at least 2mL of blood to be detected, preprocessing the sample to be detected to obtain a sample to be detected, detecting the sample to be detected to obtain the chromatogram thereof, and calculating the contents of the retinol and α -tocopherol in the blood sample according to the chromatograms and each standard curve equation.)

同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法

技术领域

本发明涉及临床化学技术领域，特别涉及同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法。

背景技术

视黄醇又称维生素A(vitaminA)，或抗干眼病因子，是一个具有脂环的不饱和一元醇，属于脂溶性维生素，是构成视觉细胞中感受弱光的视紫红质的组成成分。维生素A可维持人体正常视觉功能和骨骼正常生长发育、维护上皮组织细胞的健康和促进免疫球蛋白的合成、促进生长和生殖等。人体缺乏维生素A时，会出现皮肤干燥、脱屑和脱发等症状，严重缺乏时会产生夜盲症，并通过破坏成骨细胞与破骨细胞间的平衡，或使骨质过度增殖，或使已形成的骨质不吸收，从而影响骨骼的正常生长发育。孕妇如果缺乏维生素A时会直接影响胎儿发育，甚至发生死胎。

α-生育酚是自然界中分布最广泛、含量最丰富、活性最高的维生素E形式，同样是一种脂溶性维生素，它通过促进性激素分泌，使男子***活力和数量增加，使女子***浓度增高，提高生育能力，预防流产。维生素E缺乏时会出现睾丸萎缩、上皮细胞变性，孕育异常等症状。因此，临床上常用维生素E治疗先兆流产和习惯性流产，对防治***也有一定帮助。同时，α-生育酚保护T淋巴细胞、抗自由基氧化、抑制血小板聚集，从而降低心肌梗死和脑梗塞的危险性。另外，α-生育酚在烧伤、冻伤、毛细血管出血、更年期综合症、美容等方面有很好的疗效。尽管维生素E对人体有诸多好处，但也不能随意服用。研究显示，长期大剂量应用维生素E可能出现唇炎、恶心、呕吐、眩晕、视力模糊、胃肠功能及性腺功能紊乱等症状。如果长期服用300～600毫克的大剂量，可诱发血栓性静脉炎、肺栓塞、下肢水肿、使机体免疫功能下降，引发各种疾病，产生严重的毒副作用。因此，及时准确的监测人体内视黄醇和α-生育酚的含量，对于维持人类健康具有非常重要的作用。

目前，可以利用液相色谱-荧光检测方法，来同时检测血液中的视黄醇和α-生育酚的含量，但分析时间较长。比如，一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，公开号为CN106442754A，该方法中，维生素A、维生素A的内标物、维生素E、维生素E的内标物的保留时间分别为0.57min、0.90min、2.25min、2.90min，分析时间为4.2min。

发明内容

本发明提供了同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法，能够更加快速的同时检测血液中视黄醇和α-生育酚的含量。

为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明提供了同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法，包括：

利用高效液相色谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的视黄醇的标准品及内标物、α-生育酚的标准品及内标物，不同标准溶液中同一标准品的浓度不同；

根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到视黄醇的标准曲线方程和α-生育酚的标准曲线方程；

将一定量的混合内标工作液添加到一定量的血液样本中，并进行样本前处理以得到待测样本；其中，所述血液样本经处理至少2mL待检测血液而得到，所述混合内标工作液中含有浓度已知的视黄醇的内标物和α-生育酚的内标物；

利用高效液相色谱仪，在相同检测条件下，检测一定量的待测样本，得到待测样本的色谱图；

根据待测样本的色谱图和拟合得到的各个标准曲线方程，计算所述血液样本中视黄醇和α-生育酚的含量；

其中，所述检测条件中的液相条件包括：Poroshell 120SB-C18色谱柱，色谱柱的长度为50mm、内径为3.0mm、填料粒径为2.7μm，流动相为甲醇和水，分析时间为2.9-3.5min，柱温为25-35℃，进样量为0.1-10μL，流速为0.5-1mL/min。

优选地，高效液相色谱仪中荧光检测器的检测器转换方式包括：

优选地，所述液相条件包括：洗脱方式为梯度洗脱；

洗脱过程包括：

时间(min)	甲醇(％)	水(％)
			0	92	8
0.2	92	8
			0.3	99	1
1.9	99	1
			2	92	8
3	92	8

。

优选地，所述液相条件包括：柱温为35℃，进样量为5μL，流速为0.8mL/min。

优选地，视黄醇的内标物为视黄醇乙酸酯，α-生育酚的内标物α-生育酚乙酸酯。

本发明提供了同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法，该方法包括：基于特定的液相条件，利用高效液相色谱仪，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，各标准溶液中均含有浓度已知的视黄醇和α-生育酚的标准品及内标物；根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到视黄醇和α-生育酚的标准曲线方程；将混合内标工作液添加到经处理至少2mL待检测血液而得到的血液样本中，经样本前处理以得到待测样本；同样检测待测样本得到其色谱图；根据待测样本的色谱图和各个标准曲线方程，计算血液样本中视黄醇和α-生育酚的含量。本发明能够更加快速的同时检测血液中视黄醇和α-生育酚的含量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一实施例提供的一种同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法的流程图；

图2是本发明一实施例提供的视黄醇的化学结构式；

图3是本发明一实施例提供的α-生育酚的化学结构式；

图4是本发明一实施例提供的一标准溶液中视黄醇标准品和α-生育酚标准品的色谱图；

图5是本发明一实施例提供的一标准溶液中视黄醇的内标物和α-生育酚的内标物的色谱图；

图6是本发明一实施例提供的一待测样本中视黄醇和α-生育酚的色谱图；

图7是本发明一实施例提供的一待测样本中视黄醇的内标物和α-生育酚的内标物的色谱图；

图8是本发明一实施例提供的视黄醇的线性关系图；

图9是本发明一实施例提供的α-生育酚的线性关系图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，本发明实施例提供了一种同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法，可以包括以下步骤：

步骤101：利用高效液相色谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的视黄醇的标准品及内标物、α-生育酚的标准品及内标物，不同标准溶液中同一标准品的浓度不同。

本发明实施例中，所述检测条件中的液相条件包括：Poroshell 120SB-C18色谱柱，色谱柱的长度为50mm、内径为3.0mm、填料粒径为2.7μm，流动相为甲醇和水，分析时间为2.9-3.5min，柱温为25-35℃，进样量为0.1-10μL，流速为0.5-1mL/min。

比如，分析时间的取值可以为2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4或3.5，优选为3.0min；柱温的取值可以为25、27、29、30、31、33或35；进样量的取值可以为0.1、0.5、1、3、5或10；流速的取值可以为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1。

步骤102：根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到视黄醇的标准曲线方程和α-生育酚的标准曲线方程。

步骤103：将一定量的混合内标工作液添加到一定量的血液样本中，并进行样本前处理以得到待测样本；其中，所述血液样本经处理至少2mL待检测血液而得到，所述混合内标工作液中含有浓度已知的视黄醇的内标物和α-生育酚的内标物。

详细地，待检测血液通常为取自人体的静脉血。

步骤104：利用高效液相色谱仪，在相同检测条件下，检测一定量的待测样本，得到待测样本的色谱图。

步骤105：根据待测样本的色谱图和拟合得到的各个标准曲线方程，计算所述血液样本中视黄醇和α-生育酚的含量。

经研究发现，C8柱和其他型号的C18柱分离杂质需要的时间比较长，而Poroshell120SB-C18色谱柱这一核壳型的色谱柱，分离效率高、背压低，有利于缩短分析时间。此外，结合流速大小、分离效果、分析时间等，优选规格为3.0mm×50mm 2.7μm的Poroshell120SB-C18色谱柱。

本发明实施例中，基于上述液相条件，可以在保证分离效果的前提下，缩短分析时间，尤其适用于血液样本数量较多的情况，有利于大量血液样本的快速、准确检测。

优选地，柱温为35℃，进样量为5μL，流速为0.8mL/min。

本发明实施例中，选用高效液相法，来检测血液中视黄醇和α-生育酚的含量。与高效液相质谱联用法相比，高效液相法使用的检测仪器为高效液相色谱仪，仪器成本投入大大降低，仪器普及率更高，使得检测方法更容易规范化。

本发明实施例中，使用高效液相法作含量检测，血液用量可低至2mL，尤其适用于检测采血难度较小的人群，比如大多数成年人。考虑到成年人数量庞大，且本发明实施例所用的分析时间更短，使得本发明实施例的应用前景具有一定优势。

请参考图2和图3，图2示出了视黄醇的化学结构式，图3示出了α-生育酚的化学结构式。

通常情况下，标准曲线方程的建立至少需要三个坐标点，以保证所建立方程的准确性，故需要预先配制至少三个标准溶液，从而可以根据各个标准溶液检测所得到的色谱图，拟合出视黄醇的标准曲线方程和α-生育酚的标准曲线方程。

详细地，以视黄醇为例，拟合得到的视黄醇的标准曲线方程通常可以为y＝k×x+b。其中，x、y这两个变量，分别可以为各个标准溶液的色谱图中，视黄醇的标准品与相应内标物的峰面积比值，以及，各个标准溶液中，视黄醇的标准品与相应内标物的浓度比值。如此，根据待测样本的色谱图中，视黄醇与其内标物的峰面积比值，以及待测样本中该内标物的浓度，代入标准曲线方程即可计算出待测样本中视黄醇的浓度。据此，可相应获得血液样本中视黄醇的浓度。当然，这一实现方式同样适用于α-生育酚。

优选地，视黄醇的内标物为视黄醇乙酸酯，α-生育酚的内标物α-生育酚乙酸酯。

通常情况下，取至少2mL待检测血液后，通过对待检测血液进行处理，比如在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得到血清或血浆，即得到上述血液样本。血清或血浆样本置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。

得到血液样本后，即可作前处理，以得到相应可直接上样的待测样本。在本发明一个实施例中，样本前处理的实现过程可以包括：

(1)用移液枪移取10μL混合内标工作液于1.5mL的离心管中，然后加入50-200μL血液样本，加入一定量的稀释液，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合0.5-1.5min；

(2)加入一定量的沉淀蛋白试剂，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合0.5-2min；

(3)加入一定量的萃取剂，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合3-10min后，再在10000-15000rpm的转速下高速离心8-12min；

(4)移取一定量的离心后上清液至干净的1.5mL离心管中，将盛有上清液的1.5mL离心管转移至氮气吹干装置上，将上清液吹干；

(5)移取一定量的复溶液至上清吹干的1.5mL离心管中，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合0.5-1.5min后，再在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min，移取上清液即为待测样本。比如，可以移取80μL的上清液作为待测样本。

优选地，样本前处理中，稀释液为纯水，稀释液的量为50-200μL；沉淀蛋白试剂为无水乙醇，蛋白沉淀剂的量为100-300μL；萃取试剂为正己烷，萃取试剂的量为300-800μL；复溶液为甲醇，复溶液的量为50-200μL。

考虑到在高效液相色谱连接的检测器里，荧光检测器的专属性强且灵敏度高，故在本发明一个实施例中，高效液相色谱仪中荧光检测器的检测器转换方式如下述表1所示。

表1

本发明实施例中，视黄醇对应的激发波长为325nm，发射波长为470nm；a-生育酚对应的激发波长为295nm，发射波长为330nm。本发明实施例中选用最大吸收波长，在该波长下，灵敏度最高。

详细地，采用85％或者更低比例的有机相等度洗脱，通常可以将视黄醇和α-生育酚洗脱出来，与干扰物质的分离度良好，但会大大延长目标物的保留时间，使分析时间扩大。而完全使用有机相通常也可将目标物洗脱出来，保留时间通常较短，但通常不能将目标物与干扰物分离，造成准确度差。

基于此，综合考虑目标物与干扰物的分离度以及尽可能短的分析时间，在本发明一个实施例中，优选地，所述液相条件包括：洗脱方式为梯度洗脱；洗脱过程如下述表2所示。

基于上述洗脱方式，不仅可以保证目标物与干扰物的分离度，又使分析时间缩短，同时增加冲洗色谱柱及平衡色谱柱程序，既降低了强保留物质的干扰，又保证了前后多批样本的色谱柱进样状态一致，使样本检测准确度更高，重现性更好。

表2

时间(min)	甲醇(％)	水(％)
			0	92	8
0.2	92	8
			0.3	99	1
1.9	99	1
			2	92	8
3	92	8

此外，本发明实施例中，洗脱梯度的转换速度缓慢，从而可以避免流速较大时，因转变速度过快而影响检测稳定性，进而影响检测准确度。

在本发明一个实施例中，在所述分别检测至少三个标准溶液之前，进一步包括：

制备至少三个标准工作液，标准工作液中含有浓度已知的视黄醇标准品和α-生育酚标准品，且视黄醇标准品的浓度在0.0625-4.00mg/L中，α-生育酚标准品的浓度在0.625-40.00mg/L中；

利用移液器移取90μL标准工作液、10μL所述混合内标工作液置于离心管中；

将该离心管在1500-2000rpm的转速下涡旋混匀0.5-2min后，移取上清液以得到标准溶液；

其中，所述至少三个标准工作液中，视黄醇标准品的浓度为0.0625mg/L、0.125mg/L、0.25mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L、4.00mg/L中的至少三个，α-生育酚标准品的浓度为0.625mg/L、1.25mg/L、2.50mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L、20.00mg/L、40.00mg/L中的至少三个。

详细地，可以结合检测的人群、待检测血液的用量，以及人体内视黄醇和α-生育酚的大致含量范围，来设定线性范围，以保证大部分的临床样本检测结果落在可报告范围内。

优选地，标准工作液的个数为7。

综上所述，本发明实施例提供的这一同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法，是将内标法与高效液相色谱法相结合，使干扰因素大大减少，且特异性强、灵敏度高、检测结果准确，同时分析时间缩短。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明并不仅限于下述实施例。

实施例1

本发明实施例用于获取标准曲线方程。

1.1标准储备液的配制

标准储备液A：视黄醇标准品溶液(107.1±5.4mg/L)，开封后，立即使用。

标准储备液B：精确称取α-生育酚标准品25mg，置于5mL容量瓶，用无水乙醇溶解，并定容于5mL，得到标准储备液B，-80℃保存，有效期6个月。标准储备液B的浓度临用前用紫外分光光度计校正。

1.2内标储备液的配制

内标储备液C：取视黄醇乙酸酯标准品10mg，置于10mL容量瓶，用无水乙醇溶解，并定容至10mL，得到视黄醇乙酸酯母液(1000mg/L)，-80℃保存，避光，有效期6个月。

内标储备液D：取α-生育酚乙酸酯标准品1500mg，置于100mL容量瓶，用无水乙醇溶解，并定容于100mL，得到α-生育酚乙酸酯母液(15000mg/L)，-80℃保存，避光，有效期6个月。

1.3检测用仪器

岛津LC-20A。

1.4检测器转换方式

同上述表1。

1.5液相条件

1.5.1色谱柱

安捷伦公司的Poroshell 120 SB-C18色谱柱，色谱柱的长度为50mm、内径为3.0mm、填料粒径为2.7μm。

1.5.2流动相

甲醇和纯水。

1.5.3洗脱方式

采用梯度洗脱，洗脱过程如上述表2所示。

1.5.4其他

分析时间为3min，柱温为35℃，进样量为5μL，流速为0.8mL/min。

1.6标准工作液的配制

标准工作液：取适量标准储备液A、标准储备液B，用无水乙醇进行稀释混合，得到含有0.0625-4.00mg/L视黄醇、0.625-40.00mg/Lα-生育酚的七个标准工作液，并在-80℃条件下保存，有效期为3个月。

七个标准工作液中，视黄醇标准品的浓度分别为0.0625mg/L、0.125mg/L、0.25mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L、4.00mg/L；α-生育酚标准品的浓度分别为0.625mg/L、1.25mg/L、2.50mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L、20.00mg/L、40.00mg/L。

1.7混合内标工作液的配制

混合内标工作液：取适量内标储备液C和内标储备液D，用无水乙醇进行稀释，得到含视黄醇乙酸酯7.5mg/L、α-生育酚乙酸酯750mg/L的混合内标工作液，-80℃保存，避光，有效期3个月。

1.8标准溶液的配制

对于每一个标准工作液，用移液器移取90μL标准工作液和10μL混合内标工作液分别置于离心管中，然后在2000rpm的转速下涡旋混匀1min后，取上清液作为待检测的标准溶液。

如此，针对七个标准工作液，可以得到七个标准溶液。

1.9检测标准溶液，生成标准曲线方程

得到各个标准溶液后，即可利用高效液相色谱仪对七个标准溶液分别进行检测，对应得到各个标准溶液的色谱图。

请参考图4和图5，图4示出了一标准溶液中视黄醇标准品和α-生育酚标准品的色谱图，图5示出了一标准溶液中视黄醇的内标物(即上述视黄醇乙酸酯标准品)和α-生育酚的内标物(即上述α-生育酚乙酸酯标准品)的色谱图。

从标准溶液的色谱图中，可以得到视黄醇标准品、α-生育酚标准品的色谱峰面积和各个内标物的色谱峰面积，然后结合各个标准溶液中标准品和内标物的已知浓度，即可得到视黄醇的标准曲线方程和α-生育酚的标准曲线方程。

请参考图8和图9，图8示出了得到的视黄醇线性关系图，图9示出了得到的α-生育酚线性关系图。

对应于图8，得到的视黄醇的标准曲线方程为Y＝4.42921×X+(-0.00123629)，相关系数R²＝0.9997534。

对应于图9，得到的α-生育酚的标准曲线方程为Y＝2355.28×X+0.0282314，相关系数R²＝0.9992942。

可以看出，视黄醇在0.05625-3.6mg/L的线性范围内，相关系数R²＞0.9900，表示线性关系良好；α-生育酚在0.5625-36mg/L的线性范围内，相关系数R²＞0.9900，表示线性关系良好。基于这两个标准曲线方程来计算血液中视黄醇和α-生育酚含量时，准确性高，误差小。

得到标准曲线方程后，即可对血液样本作前处理，以得到待测样本，进而在相同检测条件下，对待测样本进行检测，结合得到的标准曲线方程，即可得到血液样本中视黄醇和α-生育酚的含量。

实施例2

本发明实施例用于检测人静脉血中视黄醇和α-生育酚的含量。

2.1获取血液样本

血液样本经处理至少2mL待检测血液而得到。得到血液样本后，即可作前处理，以得到相应可直接上样的待测样本。

2.2血液样本前处理

用移液枪移取10μL混合内标工作液于1.5mL的离心管中，然后加入100μL血液样本，加入100μL的纯水，在2000rpm的转速下涡旋混合1min后，再加入200μL的无水乙醇，在2000rpm的转速下涡旋混合1min后，加入400μL的正己烷，在2000rpm的转速下涡旋混合5min后，再在12000rpm的转速下高速离心10min，移取350μL离心后上清液至干净的1.5mL离心管中，将盛有上清液的1.5mL离心管转移至氮气吹干装置上，将上清液吹干，移取100μL的甲醇至上清吹干的1.5mL离心管中，在2000rpm的转速下涡旋混合1min后，再在12000rpm的转速下高速离心5min，移取80μL上清液即为待测样本。

2.3待测样本检测

在实施例1的检测条件下，使用同一高效液相色谱仪对待测样本进行检测，得到待测样本的色谱图。

请参考图6和图7，图6示出了待测样本中视黄醇和α-生育酚的色谱图，图7示出了待测样本中视黄醇的内标物(即上述视黄醇乙酸酯标准品)和α-生育酚的内标物(即上述α-生育酚乙酸酯标准品)的色谱图。

请参考图4至图7，待测样本中视黄醇的保留时间与标准溶液中视黄醇标准品的保留时间相一致，待测样本中α-生育酚的保留时间与标准溶液中α-生育酚标准品的保留时间相一致，且分别以视黄醇乙酸酯和α-生育酚乙酸酯为内标物，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜、特异性强、准确度和灵敏度高。

2.4待测样本中视黄醇和α-生育酚含量的计算

根据待测样本的色谱图中，视黄醇、α-生育酚和各个内标物的色谱峰面积，以及待测样本中各个内标物的已知浓度，对应代入上述2个标准曲线方程，即可计算出待测样本中视黄醇和α-生育酚的含量。

实施例3

本发明实施例用于测定定量限和检测限。

制备不同来源的血清/血浆样本，用生理盐水做不同程度的稀释，从而制备得到不同浓度的血清/血浆样本稀释液，并按实施例2中的血液样本前处理方式及测定条件，对这些血清/血浆样本稀释液进行测定。经检测发现，视黄醇、α-生育酚的检测限和定量限如下所示：

视黄醇

(1)检测限(LOD)：0.02mg/L。

(2)定量限(LOQ)：0.04mg/L。

α-生育酚

(1)检测限(LOD)：0.075mg/L。

(2)定量限(LOQ)：0.4mg/L。

由本实施例可知，视黄醇的检测限可低至0.02mg/L，定量限可低至0.04mg/L，α-生育酚的检测限可低至0.075mg/L，定量限可低至0.4mg/L，灵敏度很高，对视黄醇或α-生育酚含量很低的生物样本也能准确定量，保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。

实施例4

本发明实施例用于测定回收率和精密度。

分别取含视黄醇和α-生育酚的标准工作液，配制成高、中、低3种浓度，进行加样回收率和精密度实验，按实施例2中的检测方法进行测定，分析测定3批次，视黄醇、α-生育酚的回收率和精密度如表3所示。

表3

可以看出，α-生育酚、视黄醇在低、中、高的3个添加水平范围内，平均回收率为93.90％～101.63％，重现性良好，加样回收率良好，精密度为0.37％～1.17％，检测结果的准确度较高，可消除系统误差。

对比例1

一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，公开号为CN106442754A。

对比文件1中，维生素A、维生素A的内标物、维生素E、维生素E的内标物的保留时间分别为0.57min、0.90min、2.25min、2.90min，分析时间为4.2min。

而本发明实施例中，请参考图4至图7，视黄醇的出峰时间在0.86min，视黄醇内标物的出峰时间在1.27min，α-生育酚的出峰时间在2.08min，α-生育酚内标物的出峰时间在2.5min，分析时间为3min。

可见，本发明实施例分析时间显著缩短。

最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。