阅读说明：本技术 一种用于测定磷霉素钠杂质的高效液相色谱方法 (High performance liquid chromatography method for determining fosfomycin sodium impurities ) 是由 郑玉林 陈玉双 刘丽娟 于 2019-12-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于测定磷霉素钠杂质的高效液相色谱方法。所述高效液相色谱方法使用利用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱并采用磷酸水溶液-甲醇混合液为流动相,其中所述磷酸水溶液中磷酸的浓度质量分数为0.04％～0.06％,磷酸水溶液与甲醇的体积比为99:1 ～99:5。根据本发明的方法增强了对强极性杂质的保留,能够有效分离磷霉素钠复杂的杂质体系,具有较好的通用性和特定杂质的专属性,灵敏度高,操作方便,分析时间适中,为该化合物的质量控制提供了有效保障。(The invention relates to a high performance liquid chromatography method for determining fosfomycin sodium impurities. The high performance liquid chromatography method uses a chromatographic column which uses octadecylsilane chemically bonded silica as a filler and uses a phosphoric acid aqueous solution-methanol mixed solution as a mobile phase, wherein the concentration mass fraction of phosphoric acid in the phosphoric acid aqueous solution is 0.04-0.06%, and the volume ratio of the phosphoric acid aqueous solution to methanol is 99: 1-99: 5. The method enhances the retention of strong polar impurities, can effectively separate a complex impurity system of fosfomycin sodium, has better universality and specificity of specific impurities, has high sensitivity, convenient operation and moderate analysis time, and provides effective guarantee for the quality control of the compound.)

一种用于测定磷霉素钠杂质的高效液相色谱方法

技术领域

本发明属于本药物分析技术领域，具体涉及一种用于测定磷霉素钠杂质的高效液相色谱方法。

背景技术

磷霉素是1967年由美国默克公司(Merck公司)和西班牙CEPA公司联合开发的一种新型广谱抗菌素，在结构上属于磷酸衍生物，具有独特的化学结构，分子量小。磷霉素的作用机制独特，能够抑制细胞壁合成的早期阶段，并且不对其他抗生素产生交叉耐药性，主要用于治疗革兰氏阴性和阳性细菌感染。

目前，磷霉素主要有4个品种，分别是磷霉素钠盐、磷霉素钙盐、磷霉素氨丁三醇盐、磷霉素苄胺盐。磷霉素钠盐、钙盐于1975年在欧洲上市，首先在西班牙投入工业化生产，之后意大利和德国也陆续开始了工业化生产。1980年明治公司的产品在日本上市。磷霉素氨丁三醇于1988年在欧洲上市；1996年12月被美国FDA批准在美国上市。就使用情况而言，欧洲和日本及东南亚使用较多的是钠盐和钙盐，日本药典只收载了磷霉素钠盐、磷霉素钙盐两个品种。而在美国以磷霉素氨丁三醇为主，销量较大。

其中，磷霉素钠的制备及存储过程中可能会生成多种杂质，而产品中杂质的种类和含量直接关系到药品质量和用药安全，因此在使用之前需要准确测定磷霉素钠相关杂质的含量。

刘辉等人的“高效液相色谱法测定磷霉素关键中间体丙二烯磷酸和顺丙烯磷酸”(刘辉，裴世红等，《分析试验室》，2014，33(3):300)公开了一种测定磷霉素钠有关物质的方法。该方法采用Agilent ZORBAX氨基柱为固定相、以磷酸盐溶液和乙腈为流动相、以氨基柱为色谱柱研究了2种中间体杂质丙二烯磷酸和顺丙烯磷酸的含量测定。从结果来看，该方法适于磷霉素合成反应中丙二烯磷酸和顺丙烯磷酸的含量测定。然而，上述方法存在不少缺点，例如采用的氨基柱较为脆弱，且由于磷霉素钠系列杂质极性大、出峰快而无法有效保留、分离极性较大的复杂杂质混合体系。

因此，为了能够有效分析和检测药品质量，保证用药安全，仍需要开发出一种便捷、有效检测磷霉素钠及其复杂杂质的分析方法。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的一个目的在于提供一种高效分离和测定磷霉素钠((-)-(1R，2S)-1，2-环氧丙基膦酸二钠盐，结构式见式(1))杂质的高效液相色谱方法，从而实现对其杂质谱的准确监控和质量的严格控制。

上述目的通过以下方案来实现：

在一方面，本发明提供了一种测定磷霉素钠杂质的高效液相色谱方法，所述方法使用利用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱并采用磷酸水溶液-甲醇混合液为流动相，其中所述磷酸水溶液中磷酸的浓度质量分数为0.04％～0.06％，磷酸水溶液与甲醇的体积比为99:1～99:5。在一个优选方案中，磷酸水溶液中磷酸的浓度质量分数为0.05％。

针对磷霉素钠杂质的分子量较小、极性大的特点，本发明采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(例如，Warters Atlantis T3色谱柱)进行检测，该色谱柱采用三官能团C18烷基键合相，保证了键合密度，提升了极性化合物的保留并且能够实现100％水相流动相兼容，从而提高了分离效果。

进一步优选地，所述色谱柱的粒径为5μm，色谱柱长度为250mm，色谱柱内径为4.6mm。

通过利用粒径为5μm的色谱柱，分离较快，柱效较高。同时，采用长度较长的色谱柱(例如250mm)，能够提高分离度，从而提高分离水平。

进一步优选地，在所述方法中，所述色谱柱的工作柱温为8℃至12℃。在一个优选实施方案中，柱温为8℃、9℃、10℃、11℃或12℃。进一步地，在所述方法中，流动相流速0.5ml/min至0.7ml/min，检测波长为205nm，进样体积10μl。在一个优选实施方案中，所述流动相的流速为0.6ml/min。

在上述方案中，本发明采用低温(10℃左右)进行异构体的细微区分，保证了结构相似的同分异构体(包括顺反异构体)杂质之间的分离，从而提高了分离效果。若温度高于12℃或低于8℃，则分离效果较差，例如出现杂质峰合并等。

进一步优选地，在所述方法中，利用紫外检测器作为检测器。

在所述方案中，紫外检测器具有灵敏度高、噪音低、非破坏性、线性范围宽、对流速和温度变化不敏感等优点。

进一步优选地，在所述方法中，使用包含丙二烯磷酸钠、顺丙烯磷酸钠、2,3-烯丙基磷酸苯乙胺盐和反丙烯磷酸钠的混合溶液作为系统适应性溶液。

在所述技术方案中，利用前述物质的混合溶液作为系统适应性溶液并观察各个杂质峰之间的分离效果，能够对色谱系统进行试验和调整，并全面检测电信号、分析操作及样品等方面的综合特性。

进一步优选地，所述方法至少能检测出磷霉素钠中存在的以下四种杂质：丙二烯磷酸钠、顺丙烯磷酸钠、2,3-烯丙基磷酸苯乙胺盐和反丙烯磷酸钠。

如前所述，由于本发明方法采用利用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱并且在8-12℃的较低柱温工作，大幅提高了磷霉素钠杂质的分离和检测水平，从而使本发明方法能够有效保留、分离极性较大的复杂杂质混合体系。

综上所述，通过上述技术方案，本发明能够实现如下良好的技术效果：

(1)本发明采用使用利用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(例如，WartersAtlantis T3色谱柱)进行检测，该色谱柱采用三官能团C18烷基键合相，保证了键合密度，提升了极性化合物的保留并且能够实现100％水相流动相兼容，从而提高了分离效果；

(2)本发明采用低温(10℃左右)进行异构体的细微区分，保证了结构相似的同分异构体(包括顺反异构体)杂质之间的分离，从而提高了分离效果；

(3)根据本发明的方法增强了对强极性杂质的保留，能够有效分离磷霉素钠复杂的杂质体系，具有较好的通用性和特定杂质的专属性，灵敏度高，操作方便，分析时间适中，为该化合物的质量控制提供了有效保障；

(4)根据本发明的方法能够有效分离和测定磷霉素钠相关杂质(尤其是极性较大的复杂杂质混合体系)，因此可作为磷霉素钠质量控制的重要组成部分。

附图说明

以下将结合附图来具体描述本发明的一些优选实施方式。本领域的普通技术人员将会理解，这些附图仅用于举例说明的目的，而无意于以任何方式来限制本发明的范围。

图1是根据本发明一个实施方案的系统适用性溶液的检测图谱；

图2是顺丙烯磷酸线性关系图(峰面积-浓度)；

图3是丙二烯磷酸线性关系图(峰面积-浓度)；

图4是反丙烯磷酸线性关系图(峰面积-浓度)；

图5是2,3-烯丙基磷酸线性关系图(峰面积-浓度)。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例来描述本发明的一些具体实施方式。本领域的普通技术人员会理解，提供这些实施例的目的仅仅是为了举例说明如何能够实施本发明的方案，而非以任何方式限制本发明的范围。

磷霉素是一种新型广谱抗菌素，用途广泛。然而，在制备其具体各种衍生物(例如磷霉素钠)的过程中，不可避免地引入各种杂质，而这些杂质不容易检测和去除，从而给其应用带来诸多障碍。为了解决该问题，本发明人对磷霉素(尤其是磷霉素钠)的合成工艺和强制降解进行了大量研究，结果发现在所制备的磷霉素钠中可能存在的工艺杂质包括原材料、中间体、副产物等共4种之多，例如丙二烯磷酸钠、顺丙烯磷酸钠、2,3-烯丙基磷酸苯乙胺盐和反丙烯磷酸钠等。这些杂质的存在阻碍了磷霉素钠的实用效果。

基于该发现，本发明人对存在以上至少四种杂质的复杂杂质混合体系进行了大量研究，以图找到能够一次性分离、检测以上至少四种杂质的方法。结果，本发明人发现，使用利用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(例如，Warters Atlantis T3色谱柱)检测，就能够一次性分离和检测上述至少四种主要杂质，从而成功解决了本发明所要解决的技术问题。此外，采用较低的柱温(例如8-12℃)能够进一步增强分离效果。本发明正是基于上述发现做出的。

具体而言，本发明提供了一种测定磷霉素钠的高效液相色谱方法，所述方法使用利用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱并采用磷酸水溶液-甲醇混合液为流动相，其中所述磷酸水溶液中磷酸的浓度质量分数为0.04％～0.06％，磷酸水溶液与甲醇的体积比为99:1～99:5。该色谱柱采用三官能团C18烷基键合相，保证了键合密度，提升了极性化合物的保留并且能够实现100％水相流动相兼容，从而提高了分离效果。

下面将结合实施例对根据本发明的方法进行更为详细的描述和说明。本领域的普通技术人员将会理解，提供这些实施例的目的只是用于示例性说明的目的，即使本领域的普通技术人员能够更好地理解本发明是如何实施的，而不是对本发明的范围构成任何限制。

实施例1

1.样品配制

1)供试品溶液：

取磷霉素钠约0.05g，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相溶解并定量稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2)对照品溶液：

精密称取顺丙烯磷酸钠对照品适量，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中含0.015mg顺丙烯磷酸的溶液，摇匀，滤过，取续滤液作为对照品溶液。

3)系统适用性溶液：

精密称取丙二烯磷酸钠、顺丙烯磷酸钠、2,3-烯丙基磷酸苯乙胺盐和反丙烯磷酸钠杂质对照品各适量，用流动相稀释成约10ug/ml的混合溶液。

2.色谱条件

仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器(购自安捷伦科技(中国)有限公司)

色谱柱：采用Warters Atlantis T3色谱柱；色谱柱粒径为5μm；色谱柱长度为250mm；色谱柱内径为4.6mm。

流动相：0.05％磷酸(购自国药集团化学试剂有限公司)水溶液∶甲醇(购自默克制药(江苏)有限公司)(99∶1)

流速为0.6ml/min，柱温10℃，检测波长为205nm，进样体积为10ul。

3.杂质的计算

供试品溶液色谱图中的杂质峰，按照外标法以对照品溶液中顺丙烯磷酸的峰面积计算各杂质组分含量。具体地，供试品溶液色谱图中的杂质峰按照如下公式计算杂质组分含量：

A对：对照品溶液中顺丙烯磷酸的峰面积；

A样：供试品溶液中各杂质对应的峰面积；

C对：对照品溶液中顺丙烯磷酸钠的浓度(mg/ml)；

C样：供试品溶液中顺丙烯磷酸钠的浓度(mg/ml)；

0.735：顺丙烯磷酸钠与顺丙烯磷酸的折算系数

4.分析方法的验证：

系统适用性溶液：精密称取丙二烯磷酸钠、顺丙烯磷酸钠、2，3-烯丙基磷酸苯乙胺盐和反丙烯磷酸钠杂质对照品各10mg，用流动相稀释成约10ug/ml的混合溶液。

上述溶液按照本发明实施例所述色谱条件检测，系统适用性HPLC图谱以及丙二烯磷酸、顺丙烯磷酸、2，3-烯丙基磷酸和反丙烯磷酸等各杂质在HPLC图谱中出峰位置如图1所示。

测定结果表明，各杂质与主峰间以及90％以上的杂质峰之间分离度均大于1.5，系统适用性符合要求。在图1所示的HPLC图谱中，丙二烯磷酸、顺丙烯磷酸、2,3-烯丙基磷酸(及其异构体)和反丙烯磷酸等各杂质均在HPLC图谱中产生明显的峰，且具有良好的分离度，其表明可以在本发明分析方法中作为相应的杂质对照品用以确认相应各杂质的位置和测定准确含量。

5.线性验证

分别配制顺丙烯磷酸、丙二烯磷酸、2，3-烯丙基磷酸和反丙烯磷酸的线性系列溶液，然后按照本发明所述色谱条件检测(见下表1-4)。

表1顺丙烯磷酸线性结果

该表所示的结果在图3(顺丙烯磷酸线性关系图(峰面积-浓度))中直观示出。其中，L1-L5浓度级别(除定量限浓度外)的响应因子的相对标准偏差分别为0.35％、0.20％、0.05％和0.02％，符合RSD≤2.0％的要求；顺丙烯磷酸在0.0797μg/ml～86.1407μg/ml浓度范围内，线性方程为y＝211.1x+457.19，R²＝0.9963，线性关系良好。

结果表明，顺丙烯磷酸测定浓度在0.0797μg/ml～86.1407μg/ml的范围内，线性方程为y＝211.1x+457.19，相关系数R²＝0.9963，相关系数大于0.99，线性符合要求。

表2丙二烯磷酸线性结果

该表所示的结果在图3(丙二烯磷酸线性关系图(峰面积-浓度))中直观示出。其中，L1-L5浓度级别的响应因子的相对标准偏差分别为0.82％、0.53％、0.27％、0.06％和0.17％，符合RSD≤2.0％的要求；丙二烯磷酸在0.2792μg/ml～69.2160μg/ml浓度范围内，线性方程为y＝28.925x+12.844，R²＝0.9998，线性关系良好。

结果表明，丙二烯磷酸测定浓度在0.2792μg/ml～69.2160μg/ml的范围内，线性方程为y＝28.925x+12.844，相关系数R²＝0.9998，相关系数大于0.99，线性符合要求。

表3反丙烯磷酸线性结果

该表所示的结果在图4(反丙烯磷酸线性关系图(峰面积-浓度))中直观示出。其中，L1-L5浓度级别的响应因子的相对标准偏差分别为1.62％、0.37％、0.19％、0.05％和0.13％，符合RSD≤2.0％的要求；反丙烯磷酸在0.0801μg/ml～78.6832μg/ml浓度范围内，线性方程为y＝131.64x+300.08，R²＝0.9948，线性关系良好。

结果表明，反丙烯磷酸测定浓度在0.0801μg/ml～78.6832μg/ml的范围内，线性方程为y＝131.64x+300.08，相关系数R²＝0.9948，相关系数大于0.99，线性符合要求。

表4 2,3-烯丙基磷酸(RRT0.70)线性结果

该表所示的结果在图5(2,3-烯丙基磷酸线性关系图(峰面积-浓度))中直观示出。其中，L1-L5浓度级别的响应因子的相对标准偏差分别为0.97％、0.39％、0.34％、0.08％和0.23％，符合RSD≤2.0％的要求；2,3-烯丙基磷酸在0.9900μg/ml～77.5757μg/ml浓度范围内，线性方程为y＝17.062x-3.5683，R²＝0.9998，线性关系良好。

结果表明，2,3-烯丙基磷酸测定浓度在0.9900μg/ml～77.5757μg/ml的范围内，线性方程为y＝17.062x-3.5683，相关系数R²＝0.9998，相关系数大于0.99，线性符合要求。

6.溶液稳定性

将前述制备的供试品溶液置室温(25℃±2℃)条件下放置，在24小时内供试品溶液单个杂质和总杂质的变化率在±0.05％之内，表明供试品溶液在室温条件下24小时内稳定。

1)室温下溶液稳定性

分别考察供试品溶液和对照品溶液在室温条件下放置0h、4h、8h、12h、24h后主峰面积变化情况，室温稳定性试验结果见表5。

表5室温溶液稳定性试验结果

2)冷藏溶液稳定性

将对照品溶液与供试品溶液冷藏条件下放置，分别在0天、2天、4天、6天、7天和10天考察其稳定性，试验结果表6。

表6冷藏溶液稳定性试验结果

7.结论

对照品溶液在室温条件下放置24小时，峰面积RSD为0.3％，回收率在99.4％～100.1％,对照品溶液在室温放置24小时稳定；对照品溶液冰箱冷藏10天回收率在98.3％～100.3％，对照品溶液冰箱冷藏条件下10天内稳定；供试品溶液在室温条件下放置24小时，峰面积RSD为0.2％，回收率在99.5％～100.0％,供试品溶液在室温下放置24小时内稳定；供试品溶液冰箱冷藏10天回收率在98.1％～99.7％，对照品溶液冰箱冷藏条件下10天内稳定。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。