具体实施方式

本公开的特征是特异性结合至LILRB2的抗体和抗原结合片段。

本公开还提供了编码本文所述的抗体和其抗原结合片段的多核苷酸。此外，本公开涉及在癌症的治疗和/或刺激促炎免疫应答中使用抗LILRB2抗体和其抗原结合片段的方法。

本公开还涉及相关嵌合抗原受体(CAR)和包括其的细胞(例如，T细胞、自然杀伤细胞、或巨噬细胞)，和所述CAR和细胞在靶向肿瘤和杀死它们、哮喘治疗中的用途，或在靶向和去除感染细胞中的用途(例如，以治疗感染或感染性疾病)，或在抑制免疫系统细胞(如自身免疫性疾病或移植排斥中所涉及的)中的用途。

为了提供对说明书和权利要求的清楚理解，下文提供了以下定义。

定义

应理解的是，无论本文所述的实施方案是否具有“包括”的语言描述，还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”的术语描述的其他类似实施方案。

术语“抗体”是指通过免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合靶标如蛋白质(例如，LILR2、其亚基、或受体复合物)、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合的免疫球蛋白分子。典型抗体至少包括通过二硫键相互连接的两条重链(HC)和两条轻链(LC)。每条重链包括“重链可变区”或“重链可变结构域”(本文简称为V_H)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包括“轻链可变区”或“轻链可变结构域”(本文简称为V_L)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域C1。V_H和V_L区可进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变异性区，穿插(intersperse)有称为框架区(FR)的更保守的区域。每个V_H和V_L区由3个CDR和4个FR构成，从氨基末端至羧基末端依照以下次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。如本文所用，术语“抗体”包括完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、抗体片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Facb和Fv片段)、单链Fv(scFv)、小体(如sc(Fv)2、双体抗体)、多特异性抗体如至少两种完整抗体产生的双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体显示出期望的生物活性即可。因此，术语"抗体"包括整个抗体及其任何抗原结合片段或其单链。抗体可以裸露或与其他分子如毒素、放射性同位素、小分子药物、多肽等缀合。

术语“分离的抗体”是指已从其自然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其自然环境中的杂质组分是会干扰抗体诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化(1)至大于95重量％的抗体，如Lowry方法测定的，并且包括超过99重量％的抗体，(2)至足以通过旋转式测序仪(spinning cupsequenator)获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选地银染通过SDS-PAGE同质化。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，这是因为抗体的自然环境中的至少一种组分将不存在。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来生产。

双特异性抗体描述于，例如通过引用结合在此的美国专利号5,932,448中，公开具有通过亮氨酸拉链连接的Fab’部分的双特异性抗体的生产；通过引用结合在此的美国专利号7,538,196，公开其中各部分由接头连接的双特异性抗体的生产；和通过引用结合在此的美国专利号8,148,496，公开具有至少四个彼此通过肽接头连接的可变结构域的多价Fv抗体构建体。

术语“人源化”免疫球蛋白是指包含人类框架区和一个或多个非人源(通常是小鼠或大鼠)免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。不需要存在恒定区，但如果存在恒定区，则必须与人免疫球蛋白恒定区实质上相同，即至少约85-90％，优选约95％以上相同。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分，除了可能的CDR，与天然人免疫球蛋白序列的相应部分实质上相同。“人源化抗体”是包括人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。例如，人源化抗体不包括上文定义的典型嵌合抗体，例如，因为嵌合抗体的整个可变区是非人的。例如，参见美国专利号5585089；5225539(通过引用结合在此)。

术语“抗原结合片段”是指完整抗体的一部分，并指完整抗体的抗原决定可变区。本领域已知抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来执行。抗原结合抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Facb、Fd和Fv片段、线性抗体、单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些情况下，抗体片段可以通过完整或全抗体的蛋白水解消化来生产。例如，抗体片段可以通过用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或纤溶酶等酶处理全抗体而获得。全抗体的木瓜蛋白酶消化产生F(ab)2或Fab片段；全抗体的胃蛋白酶消化产生F(ab')2或Fab'；全抗体的纤溶酶消化产生Facb片段。

术语“Fab”是指与用酶木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白(通常为IgG)获得的抗体片段实质上等同的抗体片段。Fab片段的重链段是Fd片(piece)。此类片段可通过完整抗体的片段化而酶学或化学地产生，或由编码部分抗体序列的基因重组地产生，或者完全或部分合成地产生。术语“F(ab')2”是指抗体片段，其实质上等同于用酶胃蛋白酶在pH4.0-4.5下消化免疫球蛋白(通常为IgG)而获得的片段。此类片段可通过完整抗体的片段化而酶学或化学地产生，或由编码部分抗体序列的基因重组地产生，或者完全或部分合成地产生。术语“Fv”是指通过非共价相互作用而结合在一起的由一个NH和一个N结构域组成的抗体片段。

如本文所用，术语“scFv”或“scFv分子”包括由一个轻链可变结构域(VL)或其一部分、和一个重链可变结构域(VH)或其一部分组成的结合分子，其中每个可变结构域(或其一部分)衍生自相同或不同的抗体。单链Fv分子优选包含一个介于VH结构域和VL结构域之间的scFv接头。示例性scFv分子是本领域已知的，并记载于例如美国专利5,892,019；Ho等人，Gene,77:51(1989)；Bird等人，Science,242:423(1988)；Pantoliano等人，Biochemistry,30:101 17(1991)；Milenic等人，Cancer Research,51:6363(1991)；Takkinen等人，Protein Engineering,4:837(1991)。此处使用的术语“scFv接头”是指在scFv的VL和VH结构域之间插入的部分。scFv接头优选将scFv分子维持在抗原结合构象中。在一个实施方案中，scFv接头包含或由scFv接头肽组成。在某些实施方案中，scFv接头肽包含或由Gly-Ser肽接头组成。在其他实施方案中，scFv接头包括二硫键。

术语“LILRB2抗体”、“抗LILRB2抗体”、“抗LILRB2”、“结合LILRB2的抗体”及其任何语法变体是指能够特异性结合至LILRB2并具有足够亲和力的抗体，使得该抗体可用作靶向LILRB2的治疗剂或诊断试剂。本文所公开的抗LILRB2抗体与不相关的非LILRB2蛋白的结合程度小于该抗体与LILRB2结合的约10％，例如通过放射免疫测定(RIA)、BIACORE^TM(使用重组LILRB2作为分析物和抗体作为配体，反之亦然)，或其它本领域已知的结合试验所测定的。在某些实施方案中，结合至LILRB2的抗体的解离常数(KD)为<1μM、<100nM、<50nM、<10nM、或<1nM。

两个多肽(或多核苷酸)序列之间的术语“％相同”是指在比较窗口上序列共享的相同匹配位置的数量，考虑到必须引入添加或缺失(即空位)才能使两个序列最佳地对齐。匹配位置是指在靶序列和参考序列中出现相同的核苷酸或氨基酸的任何位置。目标序列中出现的空位不计入，这是因为空位不是核苷酸或氨基酸。同样，由于对目标序列核苷酸或氨基酸计数，而不是来自参考序列的核苷酸或氨基酸，因此未对参考序列中出现的空位进行计数。序列同一性的百分比是通过确定两个序列中相同氨基酸残基或核酸碱基出现的位置数来获得匹配位置数、将匹配位置数除以比较窗口中的总位置数并将结果乘以100来获得序列同一性的百分比来计算的。比较序列和确定两个序列之间的百分比序列同一性，可以使用现成的软件实现，既可在线使用，也可下载。合适的软件程序可以从各种来源获得，并用于蛋白质和核苷酸序列的比对。一个确定百分比序列同一性的合适程序是bl2seq，它是BLAST程序包的一部分，该程序包可从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)上获得。B12seq使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，BLASTP用于比较氨基酸序列。其他合适的程序例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，是EMBOSS生物信息学程序包的一部分，也可从www.ebi.ac.uk/Tools/psa的欧洲生物信息学研究所(EBI)获得。在某些实施方案中，第一氨基酸序列与第二序列氨基酸的百分比同一性“X”计算为100x(Y/Z)，其中Y是在第一序列与第二序列对齐中评分为相同匹配的氨基酸残基的数量(通过目视检查或特定序列比对程序对齐)，Z是第二序列中的总残基数量。如果第一序列的长度比第二序列长，则第一序列与第二序列的百分比同一性将高于第二序列与第一序列的百分比同一性。本领域技术人员将理解，生成用于计算百分比序列同一性的序列比对并不限于仅由主序列数据驱动的二进制序列-序列比较。序列比对可以从多个序列比对中导出。一个适合生成多序列比对的程序是ClustalW2，可从www.clustal.org(ClustalX是ClustalW2程序移植到Windows环境中的版本)获得。另一个合适的程序是MUSCLE，可从www.drive5.com/muscle获得。另外，ClustalW2和MUSCLE还可例如从EBI获得。

术语“治疗剂”是指用于治疗疾病或病症的任何生物或化学剂。治疗剂包括任何合适的生物活性化合物，生物衍生的组分如细胞、肽类、抗体、CAR(和包括CAR的细胞)、和多核苷酸，以及例如放射性同位素等放射化学治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂包括化学治疗剂或止痛剂。

关于例如缺血等与增加的细胞死亡相关的病症，如本文中所用的术语“治疗(treat和treating)”是指动物或人的组织和/或细胞损伤的发生率减少。预防可以是完全的，例如，在受试者中完全没有组织损伤。预防也可以是部分的，使得受试者的组织损伤的发生率比没有治疗剂的情况下发生得少。

本文所用的术语“预防(prevent、preventing和prevention)”应指疾病或病症的发生率减少或受试者获得疾病或其相关症状的风险减少。预防可以是完全的，例如，受试者中完全没有疾病或病理性细胞。预防也可以是部分的，使得在受试者中疾病或病理性细胞的发生比没有本发明的情况下发生得少。

LILRB2

术语“白细胞免疫球蛋白(Ig)样受体B2”或“LILRB2”是指哺乳动物(如人)LILRB2蛋白或mRNA，或源自哺乳动物(如人)LILRB2蛋白或mRNA的LILRB2蛋白或mRNA。本文描述了LILRB2蛋白和mRNA的非限制性实例。本领域已知LILRB2蛋白和mRNA的其他实例。

以下提供人LILRB2的氨基酸序列：(NP_001265333.2)

及其变体。

术语“LILRB2激动剂”是指特异性结合至LILRB2蛋白并激活哺乳动物细胞中LILRB2信号通路的试剂。本文描述了LILRB2激动剂的非限制性实例。LILRB2信号通路的实例描述于WO2013/181438和美国公开号US2050174203中，其各自的全部内容并入本文。

术语“LILRB2拮抗剂”是指哺乳动物细胞中特异性结合至LILRB2蛋白并降低LILRB2信号通路的活性、激活或功能的试剂。本文描述了LILRB2拮抗剂的非限制性实例。

抗LILRB2抗体

本公开提供了特异性结合至LILRB2的抗体和其抗原结合片段。表1提供了抗LILRB2拮抗剂抗体(鼠)的实例。

表1

鼠抗LILRB2 CDR^*氨基酸序列

^*CDR是基于Kabat编号系统

表2中提供抗LILRB2激动剂抗体(鼠)的实例。

表2

鼠抗LILRB2 CDR氨基酸序列

^*CDR是基于Kabat编号系统

尽管上表公开了根据Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))的CDR，本公开的抗体可包括根据任何CDR定义(例如，Kabat、Chothia、Enhanced Chothia、contact、IMGT、AbM)的CDR。可以例如通过使用AbYsis数据库确定根据不同CDR定义的抗体的CDR(ABySS:a parallel assembler for short readsequence data.Simpson JT等人.Genome Res.(2009))。

在某些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段具有表1和表2中所公开的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或全部六种CDR(其中所述CDR可根据任何CDR定义)。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:225中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:230中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:244中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:24中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:202中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:216中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:89中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:120中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:158中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:1中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:35中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:50的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:90中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:121中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:159中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:2中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:36中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:51中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:91中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:122中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:160中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:3中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:36中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:52中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:92中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:123中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:161中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:4中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:37中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:53中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:92中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:124中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:161中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:4中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:38中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:53中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:93中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:125中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:162中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:3中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:36中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:52中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:93中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:122中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:160中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:3中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:36中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:52中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:95中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:127中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:164中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:3中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:36中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:52中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:96中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:128中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:165中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:6中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:40中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:55中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:94中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:122中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:166中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:3中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:36中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:56中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:97中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:123中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:161中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:4中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:38中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:57中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:90中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:121中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:167中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:3中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:36中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:52中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:97中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:123中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:161中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:4中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:38中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:57中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:98中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:120中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:158中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:8中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:35中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:58中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:99中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:129中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:158中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:1中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:35中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:50中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:100中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:258中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:168中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:9中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:42中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:59中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:97中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:123中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:161中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:4中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:38中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:57中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:94中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:131中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:169中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:10中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:43中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:60中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:97中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:123中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:161中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:4中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:38中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:57中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:94中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:77中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:170中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:11中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:44中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:61中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:101中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:132中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:171中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:12中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:49中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:62中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:101中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:132中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:171中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:15中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:49中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:65中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:104中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:136中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:158中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:1中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:35中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:50中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:105中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:137中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:177中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:16中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:45中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:68中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:107中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:138中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:178中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:18中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:41中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:69中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:94中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:139中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:179中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:20中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:39中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:71中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:102中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:133中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:175中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:13中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:41中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:67中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:108中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:140中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:180中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:21中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:45中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:72中记载的氨基酸序列的LCDR3。

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在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:103中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:135中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:174中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:7中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:41中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:66中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:94中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:142中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:184中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:23中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:46中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:74中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:222中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:228中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:240中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:13中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:41中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:213中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:114中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:255中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:146中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:27中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:48中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:250中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:112中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:258中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:188中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:12中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:49中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:80中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:377中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:125中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:378中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:3中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:36中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:52中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:363中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:364中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:365中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:176中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:253中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:362中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:101中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:132中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:171中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:374中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:375中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:376中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:267中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:138中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:174中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:7中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:41中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:119中记载的氨基酸序列的LCDR3。

在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含以下的VH：包含SEQ ID NO:18中记载的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:41中记载的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:69中记载的氨基酸序列的HCDR3；和包含以下的VL：包含SEQ ID NO:107中记载的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:138中记载的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:178中记载的氨基酸序列的LCDR3。

本文所述的抗LILRB2抗体或其抗原结合片段的V_H和或V_L区可与恒定区(例如，野生型人Fc区或包括一种或多种改变的Fc区)连接。在一些实施方案中，抗体具有源自人κ序列的轻链恒定区。在一些实施方案中，抗体具有源自人λ序列的轻链恒定区。在特定实施方案中，轻链恒定区包括人亚基κ1序列。在某些实施方案中，抗体具有选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4(例如，人IgG1、人IgG2、人IgG3、或人IgG4同种型)组成的组的同种型。在某些实施方案中，抗体具有人IgG1同种型。在某些实施方案中，抗体具有人IgG1同种型和人κ轻链恒定区。在某些实施方案中，抗体具有人IgG2同种型。在某些实施方案中，抗体具有人IgG2同种型和人κ轻链恒定区。重链恒定区可以是野生型人Fc区，或包含一个或多个氨基酸取代的人Fc区。抗体可具有稳定免疫球蛋白两条重链之间的二硫键的突变，例如IgG4的铰链区中的突变，如本领域所公开的(例如，Angal等人，Mol.Immunol,30:105-08(1993))。另见，例如，美国2005/0037000。重链恒定区也可具有改变抗体性质的取代(例如，减少一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、脱酰胺、与补体结合、或甲硫氨酸氧化)。在一些情况下，抗体可具有突变，如美国专利5,624,821和5,648,260中所描述的突变。在一些实施方案中，修饰抗体以降低或消除效应功能。在一些实施方案中，重链恒定区具有以下突变的一种或多种：S228P；N297Q；和T299A(根据Kabat编号)。重链恒定区可以是嵌合的，例如，Fc区可以包含IgG4同种型的IgG抗体的CHI和CH2结构域，和来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域(参见例如，美国专利申请No.2012/0100140A1，通过引用将其全部内容并入本文)。在具体实施方案中，本文所述的人源化抗LILRB2抗体具有嵌合恒定区，该嵌合恒定区包括IgG4同种型的IgG抗体的CH1和CH2结构域，以及来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域，并且还包含S228P和N297Q突变(根据Kabat编号)。

本公开还包含抗LILRB2抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，抗LILRB2抗体或其抗原结合分子包含或由以下组成：(i)单链Fv(“scFv”)；(ii)双体抗体；(iii)sc(Fv)2；(iv)抗体的多肽链；(v)F(ab')2；或(vii)F(ab)。在一个实施方案中，抗原结合片段是Fab分子。片段抗原结合区(Fab片段)是一种结合抗原的抗体区域。它由重链和轻链各自的一个恒定结构域和一个可变结构域构成。这些结构域形成了异位体，即抗原结合位点。酶木瓜蛋白酶可用于将免疫球蛋白单体裂解为两个Fab片段和一个Fc片段。重组方法也可用于生产Fab分子。在另一个实施方案中，抗原结合片段是单链片段变体(scFv)。scFv包括抗体的重链和轻链的可变区。它仅为Fab片段大小的一半，但保留了母体免疫球蛋白的原始特异性。生产ScFv的方法在本领域是公知的(参见，例如，Ahmad等人，Clinical and DevelopmentalImmunology,vol.2012,Article ID 980250,15pages,2012.doi:10.1 155/2012/980250)。

在某些实施方案中，抗LILRB2抗体或其抗原结合分子可以是靶向部分。这些靶向部分在将目标试剂(例如，治疗剂、小分子药物)运送至细胞中是有用的。

本公开还提供了“嵌合分子”，所述“嵌合分子”包括，例如，本文所公开的至少一种LILRB2抗体或其抗原结合片段，其与至少一个异源部分连接和/或缀合和/或以其他方式相关联。在某些实施方案中，异源部分是运送或输送到细胞或其局部环境的试剂。这样的试剂可以是例如治疗剂如化学治疗剂。本文所公开的嵌合分子包括包含以下的任意分子：(i)本文所公开的LILRB2抗体或其抗原结合分子(例如，Fab或scFv)，和(ii)至少一个(例如，一、二、三、四个)异源部分(例如，治疗部分、化学治疗剂、半衰期延伸部分)，并且任选地包括一个或多个接头。在一些实施方案中，嵌合分子是嵌合蛋白，即其中其所有组分(异源部分和/或接头)是多肽的嵌合分子。其他嵌合分子可包含非多肽异源部分(如PEG、脂质、碳水化合物、核酸、小分子治疗剂、放射性核素、荧光探针等)和/或非多肽接头。

在一些实施方案中，嵌合分子包括衍生自第一来源的第一氨基酸序列，共价或非共价键合到衍生自第二来源的第二氨基酸序列，其中第一来源和第二来源不相同。不同的第一来源和第二来源可以包括两个不同的生物实体，或者来自相同的生物实体、或者生物实体和非生物实体的两种不同的蛋白质。嵌合分子可以包括例如衍生自至少两种不同生物来源的蛋白质。生物来源可包括任何非合成产生的核酸或氨基酸序列(例如，如本文进一步描述的基因组或cDNA序列、质粒或病毒载体、天然病毒粒子或上述任何一种的突变体或类似物)。合成来源可以包括化学地而不是通过生物系统(例如，氨基酸序列的固相合成)产生的蛋白质或核酸序列。嵌合分子还可包括衍生自至少两种不同合成来源的蛋白质或衍生自至少一种生物来源和至少一种合成来源的蛋白质。嵌合分子还可包含衍生自第一来源的第一氨基酸序列，其共价或非共价连接到衍生自任何来源的核酸或衍生自任何来源的小的有机或无机分子。嵌合分子还可包括在第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之间或在第一氨基酸序列与核酸之间，或在第一氨基酸序列与小的有机或无机分子之间的连接分子。

本文所公开的嵌合分子的异源部分可包括、由以下组成、或基本上由以下组成：例如，预防剂和/或治疗剂(例如，化学治疗剂或止痛剂)，能够改善药代动力学(PK)特性的分子(例如，血浆半衰期延长部分)，和可检测部分(例如，荧光分子或放射性核素)。在一些实施方案中，异源部分包括凝血因子(例如因子VII)。在一些实施方案中，异源部分包含可以改变缺乏这种异源部分的嵌合分子的物理化学性质的分子。在其他实施方案中，异源部分掺入嵌合分子可改善一种或多种药代动力学特性，而不会显著影响其生物活性或功能。在其他实施方案中，异源部分增加本发明嵌合分子或其片段的稳定性。

在一些实施方案中，异源部分是一种多肽，其包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：至少约10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000或4000个氨基酸。在其他实施方案中，异源部分是一种多肽，其包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：约100至约200个氨基酸、约200至约300个氨基酸、约300至约400个氨基酸、约400至约500个氨基酸、约500至约600个氨基酸、约600至约700个氨基酸、约700至约800个氨基酸、约800至约900个氨基酸，或约900至1000个氨基酸。

在一些实施方案中，嵌合分子包含至少一种异源部分，即“半衰期延伸部分”。半衰期延伸部分可以包括，例如，(i)XTEN多肽；(ii)Fc；(iii)白蛋白，(iv)白蛋白结合多肽或脂肪酸，(v)人绒毛膜促性腺激素β亚单位C末端肽(CTP)；(vi)PAS；(vii)HAP；(viii)转铁蛋白；(ix)聚乙二醇(PEG)；(x)羟乙基淀粉(HES)；(xi)聚唾液酸(PSA)；(xii)清除受体或其阻断嵌合分子与清除受体的结合的片段；(xiii)低复杂度肽类；(xiv)vWF；或(xv)其任何组合。在一些实施方案中，半衰期延伸部分包括Fc区。在其他实施方案中，半衰期延伸部分包括由接头融合的两个Fc区。示例性异源部分还包括，例如，FcRn结合部分(例如，完整Fc区或其结合FcRn的部分)，单链Fc区(scFc区，例如，如记载于美国公开No.2008-0260738和国际公开WO 2008-012543和WO2008-1439545)，或可加工的scFc区。在一些实施方案中，异源部分可包括用于例如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、聚唾液酸等非多肽部分或这些部分的任何衍生物、变体或组合的连接位点。

在某些实施方案中，本公开的嵌合分子包含至少一个(例如，一个、两个、三个、或四个)半衰期延伸部分，该半衰期延伸部分与不存在这种异源部分的相应嵌合分子的体内半衰期相比，增加嵌合分子的体内半衰期。嵌合分子的体内半衰期可以通过本领域技术人员已知的任何方法来确定，例如，活性测定(显色测定或一阶段凝血aPTT测定)、ELISA等。在一些实施方案中，一种或多种半衰期延伸部分的存在导致嵌合分子的半衰期与不存在这类一种或多种半衰期延伸部分的相应嵌合分子的半衰期相比增加。包括半衰期延伸部分的嵌合分子的半衰期为至少约1.5倍，至少约2倍，至少约2.5倍，至少约3倍，至少约4倍，至少约5倍，至少约6倍，至少约7倍，至少约8倍，至少约9倍，至少约10倍，至少约11倍，或至少约12倍长于不存在这类半衰期延伸部分的相应嵌合分子的体内半衰期。

在一个实施方案中，包含半衰期延伸部分的嵌合分子的半衰期为约1.5倍至约20倍、约1.5倍至约15倍、或约1.5倍至约10倍长于不存在这类半衰期延伸部分的相应嵌合分子的体内半衰期。在另一个实施方案中，与不存在这类半衰期延伸部分的相应嵌合分子的体内半衰期相比，包含半衰期延伸部分的嵌合分子的半衰期延伸约2倍至约10倍，约2倍至约9倍，约2倍至约8倍，约2倍至约7倍，约2倍至约6倍，约2倍至约5倍，约2至约4倍，约2至约3倍，约2.5至约10倍，约2.5至约9倍，约2.5至约8倍，约2.5至约7倍，约2.5至约6倍，约2.5至约5倍，约2.5至约4倍，约2.5至约3倍，约3至约10倍，约3至约9倍，约3至约8倍，约3至约7倍，约3至约6倍，约3至约5倍，约3至约4倍，约4至约6倍，约5倍至约7倍，或约6倍至约8倍。

抗体的特性

本文所述的抗体的LILRB2结合特性可通过任何标准方法测量，例如，以下一种或多种方法：表面等离子共振(SPR)、BIACORE^TM分析、酶联免疫吸附试验(ELISA)、EIA(酶免疫测定)、RIA(放射免疫测定)、和荧光共振能量转移(FRET)。

可使用系统分析目标蛋白(抗LILRB2抗体或其功能片段)与靶标(如LILRB2)的结合相互作用。在这种方法中，FortéBio公司制造的几种仪器(如Qke和QK)中的一种用于确定蛋白质相互作用、结合特异性和表位映射。系统提供了一种简单的方法，通过测量偏振光的变化来监测实时结合，偏振光沿着定制的吸管端(tip)传播，然后返回到传感器。

目标蛋白(抗LILRB2抗体或其功能片段)与靶(例如LILRB2)的结合相互作用可使用表面等离子共振(SPR)分析。SPR或生物分子相互作用分析(Biomecular InteractionAnalysis，BIA)实时检测生物特异性相互作用，而没有标记任何相互作用物质。BIA芯片的结合表面处质量的变化(表示结合事件)导致近表面光的折射率发生变化(表面等离子共振(SPR)的光学现象)。折射率的变化产生可检测的信号，测量其作为生物分子之间的实时反应的指示。使用SPR的方法记载于例如美国专利No.5,641,640；Raether(1988)SurfacePlasmons Springer Verlag；Sjolander and Urbaniczky(1991)Anal.Chem.63:2338-2345；Szabo等人(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705和由BIAcore InternationalAB(Uppsala,Sweden)提供的在线资源。来自SPR的信息可用于提供平衡离解常数(Kd)和动力学参数(包括Kon和Koff)的准确和定量的测量，以使生物分子与靶标结合。

也可通过使用BIACORE色谱技术评价不同抗LILRB2抗体或其功能片段相互竞争与人LILRB2结合的能力来直接定位表位(Pharmacia BIAtechnology Handbook,“EpitopeMapping”,Section 6.3.2,(May 1994)；另见Johne等人(1993)J.Immunol.Methods,160:191-198)。

当采用酶免疫测定法时，将包含抗体的样品，例如，抗体产生细胞的培养上清液或纯化抗体添加到抗原包被板中。加入标记有例如碱性磷酸酶等酶的二抗，培养板，洗涤后添加例如对硝基苯磷酸等酶底物，测定吸光度，评价抗原结合活性。

评价抗体的其他一般指南，如Western印迹和免疫沉淀试验，可见于抗体:ALaboratory Manual,由Harlow和Lane编辑,Cold Spring Harbor press(1988)。

为了表征抗体的拮抗和激动生物活性，本发明人进行了LPS刺激的PBMC(最重要的，主要靶向髓系细胞)和OKT3刺激的PBMC(主要靶向T细胞)作为中试筛选策略。拮抗性抗体可增加TNFa，伴以降低/未改变IL-10分泌，同时增加/未改变T细胞增殖(TNFa>1.5倍，IL-10<1.1倍)。另一方面，激动性抗体可增加IL-10分泌，伴以降低/未改变TNFa分泌，同时，降低T细胞增殖(IL-10>1.2倍，TNFa<1.1倍和T细胞增殖<0.8倍)。抗体候选物对LPS和OKT3刺激的PBMC的影响见表3-6。值得注意的是，从基于T细胞的试验中筛选的抗体候选物的拮抗和激动生物活性多数是与基于髓系细胞的试验一致的，但少数会与其不一致。此外，由CD163、CD206、HLA-DR、PD-L1和CD14、CD16(图2C)以及混合淋巴细胞反应(图3C)对抗体候选物进行测试LILRB2报告检验、M1/M2分化/人MDSC标记物。拮抗剂可降低M2分化(下调CD163、CD206、PD-L1)、增加HLA-DR、降低人MDSC CD33+CD14+CD16+，而相对地，激动剂则可反调节或维持上述参数。这些试验为确定抗体候选物的活性或比较有效性/效价提供了重要的参数。

抗LILRB2嵌合抗原受体(CAR)

本文还提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含本文所述的抗体的VH和VL。在一个实施方案中，VH包含以下：包含SEQ ID NO:92中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ IDNO:123中记载的氨基酸序列的HCDR2、和包含SEQ ID NO:161中记载的氨基酸序列的HCDR3；和VL包含以下：包含SEQ ID NO:4中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:37中记载的氨基酸序列的LCDR2、和包含SEQ ID NO:53中记载的氨基酸序列的LCDR3。在一个实施方案中，VH包含以下：包含SEQ ID NO:225中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:230中记载的氨基酸序列的HCDR2、和包含SEQ ID NO:244中记载的氨基酸序列的HCDR3；和VL包含以下：包含SEQ ID NO:24中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:202中记载的氨基酸序列的LCDR2、和包含SEQ ID NO:216中记载的氨基酸序列的LCDR3。

本领域已知生产CAR的方法。

本文还提供编码本文所述的CAR的多核苷酸(一种或多种)。

本文还提供包含编码本文所述的CAR的多核苷酸的载体。

本文还提供包含本文所描述的CAR的细胞。本文还提供包含编码本文所描述的CAR的多核苷酸的细胞。本文还提供包含载体的细胞，所述载体包含编码本文所描述的CAR的多核苷酸。在一个实施方案中，细胞为T细胞。在一个实施方案中，细胞为自然杀伤细胞。在一个实施方案中，细胞为巨噬细胞。

本文还提供包含本文所描述的CAR和合适的药物运载体的药物组合物。本文还提供包含细胞和合适的药物运载体的药物组合物，所述细胞包含本文所描述的CAR。本文还提供包含细胞和合适的药物运载体的药物组合物，所述细胞包含编码本文所描述的CAR的多核苷酸。在另一方面，本文提供包含细胞和合适的药物运载体的药物组合物，所述细胞包括含有编码本文所描述的CAR的多核苷酸的载体。

本文还提供生产本文所描述的CAR的方法，其包括(a)培养本文所描述的细胞(例如，包含编码本文所描述的CAR的多核苷酸的细胞或包括含有编码CAR的多核苷酸的载体的细胞)和(b)分离CAR。

其它试剂

MDSC

MDSC最近被认为是免疫系统的中央调节剂之一。MDSC代表包括髓系祖细胞、未成熟巨噬细胞、未成熟粒细胞和未成熟树突状细胞在内的髓系来源的细胞的异质性群体。MDSC分化并极化为Gr1⁺CD11b⁺CD115⁺Ly6C⁺单核(M)-细胞和Gr1⁺CD11b⁺Ly6G⁺粒细胞(G)-细胞(Gabrilovich等人，Cancer Res.67:425,2007；Huang等人，Cancer Res.66:1123-1131,2006；Movahedi等人，Blood 111:4233-4244,2008)。人MDSC表征为CD11b⁺CD14^LowCD33⁺或Lin-HLA-DR^Low-CD33⁺髓系细胞(Ostrand-Rosenberg等人，J.Immunol.182:4499-4506,2009；Raychaudhuri等人，Neurol.Oncol.13:591-599,2011)。反映了1型经典活化样(M1)和2型替代活化样(M2)巨噬细胞的命名，MDSC可分化并极化为M1和M2细胞(M1细胞表达iNOS、TNF-α、IFN-gR、MHC I类和CCR7，M2细胞表达精氨酸酶、IL-10、CD36、CD206和CCR2)。肿瘤相关MDSC主要表现为M2样表型，具有促肿瘤和免疫抑制活性。M2细胞由多种增强的特征标记物如IL-10、精氨酸酶、IL-10、Tie-2、CD36、CD206、IL-4R和CCR2表型表征(Ma等人，Immunity34:385-395,2011)。M1细胞具有升高的的iNOS、NO、TNF-α、IFN-γR、MHCI、CCR7表达(Ma等人，Immunity34:385-395,2011)。M2细胞上调精氨酸酶、CCL2、CCL5和MMP-9的表达。相反，M1细胞显示TNF-α、Fas和ICAM-1的表达水平升高。

MDSC通过与T细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞及其他免疫细胞经由多种机制相互作用而发挥免疫抑制作用。MDSC与其他免疫细胞如何相互作用的详细描述见Bunt等人(J.Leukoc.Biol.85:996-1004,2009)、Ostrand-Rosenberg等人(Nat.Rev.Immunol.12:253-268,2012)、和Sinha等人(J.Immunol.179:977-983,2007)。就T细胞而言，MDSC可诱导效应性T细胞(Teff)失活和凋亡(参见，例如，Apolloni等人，J.Immunol.165:6723-6730,2000)和扩增调节性T细胞(Treg)(参见，例如，Adeegbe等人，Cell Transplant.20:941-954,2011)。由MDSC的T细胞抑制和Treg扩增的调节是细胞接触、MHCⅡ类、NO和/或精氨酸酶依赖性的。M2细胞与其M1样对应物相比在T细胞共培养中具有较强的抑制Teff激活和扩增的能力(Ma等人，Immunity34:385-395,2011)。M2细胞在体外和体内的Treg扩增能力均高于M1细胞(Ma等人，Immunity 34:385-395,2011)。M2细胞诱导的Treg细胞增加似乎是IL-10、IL-4和IL-13介导的以及精氨酸酶依赖性的(Ma等人，Immunity 34:385-395,2011)。与M1/M2细胞的功能相似，G1和G2细胞分别具有抗肿瘤和促肿瘤活性(Fridlender等人，CancerCell 16:183-194,2009)。

MDSC亚群从一种表型向另一种表型的极化是伴随着功能变化的。M2细胞主要通过包括增加精氨酸酶和免疫抑制细胞因子的增强免疫抑制作用来促进肿瘤生长(参见，例如Ma等人，Immunity 34:385-395,2011)。M1细胞通过增加自由基、死亡配体和免疫刺激细胞因子，增加直接杀伤肿瘤并促进抗肿瘤免疫的发展(参见，例如Ma等人Immunity 34:385-395,2011)。M1/M2的极化平衡可对疾病和健康有显著影响。

本领域已知生产和分离MDSC的方法。例如，可以使用识别本文所述的不同MDSC亚群的任何特定蛋白标记物的抗体利用荧光辅助细胞分选来分离MDSC。生产和分离MDSC的示例性方法记载于美国专利申请公开第2008/0305079号和WO 11/087795号中(其各自均以引用的方式并入本文)。

动员剂

在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种动员剂或与一种或多种动员剂组合使用。动员剂刺激自哺乳动物骨髓的MDSC的释放。动员剂的非限制性实例包括，例如，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、环磷酰胺、AMD3100、Fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3-L)、GM-CSF、M-CSF、IL-34、TSLP-1、SCF、FK560、S100 A8、和S100 A9。

在一些实施方案中，本公开提供了一种组合物，其包含动员剂和至少一种LILRB1、LILRB2、LILRB2、LILRB4、和/或LILRB5激动剂。在一些实施方案中，组合物包含动员剂，至少一种LILRB1、LILRB2、LILRB2、LILRB4、和/或LILRB5激动剂，和至少一种JNK抑制剂。在一些实施方案中，本公开提供了还包含动员剂且不包括MDSC的组合物。

JNK抑制剂

在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种JNK抑制剂或与至少一种JNK抑制剂组合使用。JNK抑制剂的非限制性实例包括例如，BI-78D3、SP600125、AEG 3482、JIP-1、SU3327、TCS JNK 5a和TCS JNK 6o。JNK抑制剂的其他实例记载于WO 00/35906、WO 00/35909、WO 00/35921、WO 00/64872、WO 01/12609、WO 01/12621、WO 01/23378、WO 01/23379、WO01/23382、WO 01/47920、WO 01/91749、WO 02/046170、WO 02/062792、WO 02/081475、WO02/083648和WO 03/024967，其各自均以引用方式并入本文。

抗炎剂

在一些情况下，组合物还可包含一种或多种抗炎剂或与一种或多种抗炎剂组合使用。抗炎剂包括，例如，皮质类固醇、非甾体抗炎剂(NSAID，例如，环氧合酶I(COXI)抑制剂和环氧合酶II(COX-II)抑制剂)、免疫选择性抗炎衍生物(ImSAID)和生物制品。本文所述或本领域已知的任何示例性抗炎剂均可包括在本文所述的组合物中。

NSAID的非限制性实例为水杨酸盐(例如，阿司匹林、双氟尼酸(diflusinal)和双水杨酸盐(salsalate))、丙酸衍生物(例如，布洛芬、右布洛芬、萘普生、非诺洛芬、酮洛芬、右旋酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普嗪和洛索洛芬)、乙酸衍生物(例如，吲哚美辛、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、双氯芬酸和萘丁美酮)、烯醇酸衍生物(例如，吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、屈昔康、氯诺昔康和伊索昔康)、芬那酸衍生物(例如，甲氨蝶呤酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸和托芬那酸)、磺胺类(例如，尼美舒利)、利克飞龙(licofelone)和赖氨酸氯尼辛。在一些实施方案中，NSAID是COX-I抑制剂或COX-II抑制剂。COX-I抑制剂的非限制性实例包括阿司匹林、布洛芬和萘普生。COX-II抑制剂的非限制性实例包括塞来昔布、伐地昔布和罗非昔布。

ImSAID的非限制性实例包括FEG(Phe-Glu-Gly)、其D-异构体feG和SGP-T肽。皮质类固醇的非限制性实例包括氢化可的松、醋酸可的松、替可的松特戊酸酯(tixocortolpivalate)、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、泼尼松、曲安奈德、曲安奈德醇、莫米松、安西奈德、布地奈德、地索奈德、氟欣诺隆(fluocinolone)、哈西奈德、倍他米松、地塞米松和氟可龙。生物制品的非限制性实例包括托珠单抗、赛妥珠单抗、依那西普、阿达木单抗、阿那白滞素、阿巴西普、依法利珠单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗和戈利木单抗。

免疫抑制剂

本文所述的组合物还可包含一种或多种免疫抑制剂或与一种或多种免疫抑制剂组合使用。免疫抑制剂的非限制性实例包括霉酚酸酯、环孢素、环孢素、他克莫司、西罗莫司和吡美莫司。本领域已知其他免疫抑制剂。

化学治疗剂

在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种化学治疗剂或与一种或多种化学治疗剂组合使用。化学治疗剂的非限制性实例包括烷化剂(例如，环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、瘤可宁和美法仑)、蒽环类(例如，柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌和戊柔比星)、紫杉烷类(例如，紫杉醇和多西他赛)、埃坡霉素类、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(例如，伏立诺他和罗米地辛)、拓扑异构酶II抑制剂(例如，依托泊苷、替尼泊苷和他氟泊苷(tafluposide))、激酶抑制剂(例如，硼替佐米、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼、和Vismodegib)、贝伐单抗、西妥昔单抗、易匹木单抗(ipilimumab)、易匹木单抗、奥法木单抗、奥美珠单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗、维罗非尼、赫赛汀、核苷酸类似物(例如，阿扎胞苷、硫唑嘌呤(azathioprine)、卡培他滨、阿糖胞苷、多西氟尿苷、双氟尼酸、吉西他滨、羟基脲、巯基嘌呤、甲氨蝶呤和硫代鸟嘌呤)、肽类抗生素(例如，博来霉素和放线菌素)、铂类药物(例如，卡铂、顺铂和奥沙利铂)、维甲酸类(例如，维A酸、阿曲替诺和贝沙罗汀，和长春花生物碱(例如，长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨)。

止痛剂

在一些实施方案中，组合物还可包含一种或多种止痛剂或与一种或多种止痛剂组合使用。本文所述或本领域已知的任何示例性止痛剂均可被包含在本文所述的组合物中。止痛剂的非限制性实例包括阿片类药物(如吗啡、鸦片、可待因、羟考酮、氢可待因、二吗啡、二氢吗啡、哌替啶(pethidine)、丁丙诺啡、芬太尼、美沙酮、哌替啶(meperidine)、喷他佐辛、二哌酮和曲马多)、对乙酰氨基酚、文拉法辛、氟哌替汀、奈福帕姆、加巴喷丁、普瑞巴林、罗非那定、环苯那平、曲唑酮、可乐定、度洛西汀和阿米替林。

免疫检查点抑制剂

在一些实施方案中，组合物还可包含一种或多种免疫检查点抑制剂或可与一种或多种免疫检查点抑制剂组合使用。任何本文所描述的或本领域公知的示例性止痛剂可被包含在本文所描述的组合物中。免疫检查点抑制剂的非限定性实例包括：程序性细胞死亡蛋白1(PD1)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、T细胞膜蛋白3(TIM3)、CD160、或腺苷A2a受体(A2aR)的拮抗剂(例如，拮抗性抗体抗体)，和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)、可诱导T细胞共刺激分子(ICOS或CD278)、OX40(CD134)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、CD40、淋巴毒素α(LTα)、或LIGHT(淋巴毒素样，表现可诱导表达，并与单纯疱疹病毒糖蛋白D竞争HVEM，所述HVEM为T淋巴细胞表达的受体)的激动剂(例如，激动性抗体)。在特定实施方案中，免疫检查点抑制剂为PD-1的拮抗剂(例如，PD-1的拮抗性抗体)。

抗LILRB2抗体的生产方法

本公开的抗LILRB2抗体(或抗体的抗原结合结构域或其功能片段)可在细菌或真核细胞中产生。为了产生目标多肽，构建了编码该多肽的多核苷酸，将其导入表达载体，然后在合适的宿主细胞中表达。采用标准分子生物学技术生产重组表达载体、转染宿主细胞、筛选转化子、培养宿主细胞、回收抗体。

如果要在细菌细胞(例如，大肠杆菌(E.coli))中表达抗体，则表达载体应具有允许在细菌细胞中扩增该载体的特征。此外，当将例如JM109、DH5α、HB101或XL1-Blue等大肠杆菌用作宿主时，载体必须具有启动子，例如可允许在大肠杆菌中有效表达的lacZ启动子(Ward等人341:544-546(1989)、araB启动子(Better等人，Science,240:1041-1043(1988))、或T7启动子。例如，此类载体的实例包括例如M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script、pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress system”(QIAGEN)、pEGFP和pET(当使用此表达载体时，宿主优选为表达T7 RNA聚合酶的BL21)。表达载体可包含用于抗体分泌的信号序列。对于产生进入大肠杆菌的周质，pelB信号序列(Lei等人，J.Bacteriol.,169:4379(1987))可用作抗体分泌用信号序列。对于细菌表达，可采用氯化钙法或电穿孔法将表达载体导入细菌细胞。

如果要在CHO、COS、293、293T和NIH3T3细胞等动物细胞中表达抗体，则表达载体包括在这些细胞中表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan等人，Nature,277:108(1979))、MMLV-LTR启动子，EF1α启动子(Mizushima等人，Nucleic Acids Res.,18:5322(1990))、或CMV启动子。除了编码免疫球蛋白或其结构域的核酸序列之外，重组表达载体还可以携带其他序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制的起点)和可选择的标记基因。可选择的标记基因有助于选择已导入载体的宿主细胞(参见例如美国专利Nos.4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，典型的可选择的标记基因使已引入有载体的宿主细胞对药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤产生耐药性。具有可选择的标记的载体的示例包括pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。

在一个实施方案中，在哺乳动物细胞中产生抗体。表达多肽的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220，与DHFR可选择的标记一起使用，如Kaufman和Sharp(1982)Mol.Biol.159:601 621)中所述)、人胚肾293细胞(例如，293、293E、293T)、COS细胞、NIH3T3细胞、淋巴细胞系如NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞、以及来自转基因动物如转基因哺乳动物的细胞。例如，该细胞是乳腺上皮细胞。

本公开的抗体可以从宿主细胞的内部或外部(例如，培养基)分离出来，并且被纯化为实质上纯且均一的抗体。通常用于多肽的分离和纯化方法可用于本文所述的抗体的分离和纯化，但不限于任何特定方法。抗体可以通过适当的选择和结合以下来分离和纯化：例如柱层析、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂萃取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、透析和重结晶。层析包括亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析和吸附层析(Strategies for Protein Purification and Characterization:ALaboratory Course Manual.Daniel R.Marshak等人编辑，Cold Spring HarborLaboratory Press,1996)。采用例如HPLC和FPLC等液相色谱仪进行层析。用于亲和层析的柱包括蛋白A柱和蛋白G柱。使用蛋白A柱的柱的实例包括Hyper D、POROS和Sepharose FF(GE Healthcare Biosciences)。本公开还包括使用这些纯化方法高度纯化的抗体。

本公开还提供了编码本文所公开的抗LILRB2抗体或其抗原结合分子的核酸分子或核酸分子组。在一个实施方案中，本发明包括编码多肽链的核酸分子，其包括如本文所述的抗LILR3抗体的轻链或其抗原结合分子。在一个实施方案中，本发明包括编码多肽链的核酸分子，其包括如本文所述的抗LILR3抗体的重链或其抗原结合分子。

还提供了一种载体或载体组，该载体或载体组包括该核酸分子或该核酸分子组或其互补体，以及包含该载体的宿主细胞。

本公开还提供了一种生产本文所公开的LILRB2或其抗原结合分子或嵌合分子的方法，这种方法包括培养本所文公开的宿主细胞并从培养基中回收抗体、其抗原结合分子或嵌合分子。

多种方法可用于重组生产本文所公开的LILRB2抗体或其抗原结合分子、或本文所公开的嵌合分子。应理解，由于密码子的简并性，各种核酸序列将编码多肽的氨基酸序列。所需的多核苷酸可以通过从头固相DNA合成或通过PCR突变早先生产的多核苷酸来产生。

对于重组生产，将编码多肽(例如，本文所公开的LILRB2抗体或其抗原结合分子、或本文所公开的任何嵌合分子)的多核苷酸序列插入适当的表达载体中，即，包含所插入的编码序列的转录和翻译必需元件的载体，或在RNA病毒载体的情况下，插入复制和翻译必需元件。

编码多肽(例如，本文所公开的LILRB2抗体或其抗原性结合分子、或本文所公开的任何嵌合分子)的核酸以适当的阅读框插入载体。然后将该表达载体转染至其将表达所述多肽的靶细胞中。本领域已知的转染技术包括但不限于磷酸钙沉淀(Wigler等人，1978,Cell 14:725)和电穿孔(Neumann等人，1982,EMBO J.1:841)。各种宿主表达载体系统可用于在真核细胞中表达本文所述的多肽(例如，本文所公开的LILRB2抗体或其抗原结合分子、或本文所公开的任何嵌合分子)。在一个实施方案中，真核细胞是动物细胞，包括哺乳动物细胞(例如，293细胞、PerC6细胞、CHO细胞、BHK细胞、Cos细胞、HeLa细胞)。当所述多肽在真核细胞中表达时，编码所述多肽(例如，本文所公开的LILRB2抗体或其抗原结合分子、或本文所公开的任何嵌合分子)的DNA也可编码信号序列，所述信号序列允许所述多肽分泌。本领域技术人员将理解，当翻译多肽时，信号序列被细胞裂解以形成成熟的嵌合分子。各种信号序列在本领域是已知的并且是熟练技术人员所习知的。或者，如果信号序列不包括在内，则可以通过裂解细胞来回收多肽(例如，本文所公开的LILRB3抗体或其抗原结合分子，或本文所公开的任何嵌合分子)。

药物组合物

本公开还提供了包含以下的一种或多种的药物组合物：(i)本文所公开的LILRB2抗体或其抗原结合分子；

(ii)如本文所公开的编码LILRB2抗体或抗原结合分子的核酸分子或核酸分子组；或(iii)本文所公开的一种或多种载体，以及药学上可接受的载体。

本文所述的抗LILRB2抗体或其片段可配制为施用至受试者的药物组合物，例如，用于治疗本文所述的病症。通常，药物组合物包括药学上可接受的运载体。如本文所用，“药学上可接受的运载体”包括任何和所有在生理上相容的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。组合物可包括药学上可接受的盐，例如酸加成盐或碱加成盐(参见，例如Berge,S.M.,等人，(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。

药物制剂是一种公认的技术，并进一步记载于例如Gennaro(编辑),Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版，Lippincott,Williams&Wilkins(2000)(ISBN:0683306472)；Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,第7版，Lippincott Williams&Wilkins Publishers(1999)(ISBN:0683305727)；和Kibbe(编辑),Handbook of Pharmaceutical Excipients American PharmaceuticalAssociation,第3版(2000)(ISBN:091733096X)。

药物组合物可为多种形式。这些包括，例如，液体、半固体和固体剂型，例如，液体溶液(例如，可注射和可输注的溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉末剂、脂质体和栓剂。优选的形式可以取决于预期的施用和治疗应用方式。用于本文所述的试剂的典型的组合物为可注射或可输注的溶液的形式。

在一个实施方案中，本文所述的抗体用例如柠檬酸钠、七水磷酸二氢钠、磷酸二氢钠、等赋形剂材料和稳定剂配制。例如，可在缓冲溶液中以合适的浓度提供并可储存在2-8℃下。在一些其他实施方案中，组合物的pH在约5.5至7.5之间(例如，5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5)。

药物组合物还可包括在配制时减少抗体聚集的试剂。聚集减少剂的实例包括选自由甲硫氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸组成的组的一种或多种氨基酸。可将这些氨基酸添加至制剂中，使其浓度为约0.5mM至约145mM(例如，0.5mM、1mM、2mM、5mM、10mM、25mM、50mM、100mM)。药物组合物还可包括糖(例如，蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇或木糖醇)和/或强力改性剂(tonicity modifier)(例如，氯化钠、甘露醇或山梨醇)和/或表面活性剂(例如，聚山梨酯-20或聚山梨酯-80)。

该组合物可配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适于在高浓度下稳定储存的有序结构。无菌注射溶液可通过在适当溶剂中混入所需量的本文所述的试剂和上述一种成分或成分的组合(根据需要)，然后过滤灭菌来制备。通常，分散液是通过将本文所述的试剂混入至含有基本的分散液介质和来自上文列举的那些所需的其他成分的无菌载体中来制备的。在制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生本文所述的试剂以及其先前无菌过滤的溶液中的任何额外的所需成分的粉末。例如，通过使用例如卵磷脂等涂层、在分散情况下保持所需的粒度以及使用表面活性剂，可以保持溶液的适当流动性。通过在组合物中加入延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶，可以延长注射组合物的吸收。

在某些实施方案中，抗体可用运载体制备，所述运载体可保护化合物免受快速释放，例如受控释放制剂，包括植入物和微胶囊化递送系统。可生物降解的、与生物相容的聚合物，如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚酯和聚乳酸。许多制备此类制剂的方法是专利的或普遍已知的。参见，例如Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems,J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker,Inc.,New York(1978)。

在一个实施方案中，药物制剂包含浓度约为0.005mg/mL至500mg/mL的抗体(例如，0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、250mg/mL、300mg/mL、350mg/mL、400mg/mL、450mg/mL、500mg/mL)，与药学上可接受的运载体一起配制。在一些实施方案中，抗体是在无菌蒸馏水或磷酸盐缓冲盐水中配制的。药物制剂的pH值可在5.5至7.5之间(例如，5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.3、7.4、7.5)。

药物组合物可包括“治疗有效量”的本文所述的试剂。这种有效量可以根据施用试剂的作用或如果使用了多于一种的试剂则为试剂的组合作用来确定。治疗有效量的试剂也可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素而变化，以及化合物在个体中引起期望反应的能力，例如至少一种病症参数的改善或至少一种病症的症状的改善。治疗有效量也是其中组合物的任何毒性或有害的作用被治疗有益作用超过的量。

施用

抗体或其抗原结合片段、或编码抗体或其抗原结合片段的核酸，可通过各种方法施用至受试者，例如有需要的受试者，例如人或动物受试者。对于许多应用，施用途径是以下的一种：静脉内注射或肠胃外输注(IV)、皮下注射(SC)、腹腔注射(IP)、或肌内注射、或肿瘤内注射(IT)。还可以使用其他的肠胃外施用模式。此类模式的实例包括：动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、经皮、皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射。

在一个实施方案中，本发明的抗体的施用途径为肠胃外。本文所用的术语肠胃外包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道施用。优选肠胃外施用的静脉形式。虽然所有这些施用形式显然被认为是在本发明的范围内，但施用形式将是一种注射溶液，特别是静脉或动脉内注射或滴注。通常，合适的注射用药物组合物可包括缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨酯)、任选的稳定剂(例如，人白蛋白)等。然而，在与本文的教导相容的其他方法中，多肽可直接递送至不利细胞群体的部位，从而增加病损组织于治疗剂的暴露。

用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或无菌非水溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、例如橄榄油等植物油和例如油酸乙酯等可注射有机酯。水性运载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。药学上可接受的运载体包括，但不限于，0.01-0.1M、优选0.05M的磷酸盐缓冲液或0.8％生理盐水。其他常见的肠胃外运载体包括磷酸钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏、或固定油。静脉内运载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖的电解质补充剂等。也可存在防腐剂和其他附加试剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

更具体地说，适于注射用的药物组合物包括无菌水溶液(其中可溶于水)或分散液和用于即时制备无菌注射用溶液或分散液的无菌粉末。在这种情况下，组合物必须是无菌的，并且应该是流体的，以致于存在容易的可注射性。它应在制造和储存条件下保持稳定，并优选防止微生物如细菌和真菌的污染作用。运载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。例如，通过使用卵磷脂等涂层、在分散情况下保持所需的粒度以及使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。

可以通过各种抗细菌和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞等，来实现对微生物作用的预防。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇，如甘露醇、山梨醇、或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长注射组合物的吸收。

在任何情况下，无菌注射溶液均可通过在适当的溶剂中混入所需量的活性化合物(例如，单独的多肽或与其他活性剂组合的多肽)，并根据需要与其中列举的一种或多种成分组合，然后过滤灭菌来制备。通常，分散液是通过将活性化合物混入无菌运载体中来制备的，该运载体含有基本的分散液介质和所需的来自上文列举的其他成分。在制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分的粉末以及其先前无菌过滤的溶液中的任何额外的所需成分。对注射制剂进行处理，装入安瓿、袋、瓶、注射器或小瓶等容器中，并按照本领域已知的方法在无菌条件下密封。此外，制剂可以包装和以试剂盒的形式销售。这类制造品优选具有标签或包装说明书，表明相关的组合物可用于治疗患有或易发生凝血障碍的受试者。

本公开的组合物的用于治疗病况的有效剂量，取决于许多不同因素，包括施用手段、靶点、患者的生理状态、患者是人或动物、施用的其他药物、以及治疗是预防性的或治疗性的。通常，患者是人，但非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物也可以治疗。治疗剂量可以使用本领域技术人员已知的常规方法进行滴定，以优化安全性和有效性。

抗LILRB2抗体或其片段的施用途径和/或模式也可例如通过监测受试者根据个体情况而定。

抗体或其片段可以固定剂量或以毫克/千克剂量施用。剂量也可选择以减少或避免产生针对抗LILRB2抗体或其片段的抗体。调整剂量方案以提供期望的应答，例如治疗应答或组合治疗效果。通常，可以使用抗体或其片段的剂量(以及任选的第二种试剂)，以向受试者提供生物可利用量的试剂。例如，可以施用0.1-100mg/kg、0.5-100mg/kg、1mg/kg-100mg/kg、0.5-20mg/kg、0.1-10mg/kg、或1-10mg/kg的范围的剂量。还可以使用其他剂量。在某些实施方案中，向需要抗体或其片段治疗的受试者施用约1mg/kg至约30mg/kg之间的剂量的抗体或其片段。在一些实施方案中，向需要抗LILRB2抗体或其片段治疗的受试者施用1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、7mg/kg 10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、28mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、或50mg/kg的剂量的抗体或其片段。在特定实施方案中，以1mg/kg至3mg/kg的剂量皮下施用抗体或其片段。在另一实施方案中，以4mg/kg至30mg/kg之间的剂量静脉施用抗体或其片段。

组合物可包括约1mg/mL至100mg/ml或约10mg/mL至100mg/ml或约50至250mg/mL或约100至150mg/ml或约100至250mg/ml的抗体或其片段。

本文所用的剂量单位形式或“固定剂量”是指适合待进行治疗的受试者的单一剂量的物理离散单位；每一单位含有一定量的抗体或其片段，其计算成产生与所需的药物运载体相关并任选地与另一种药物相关的所需治疗效果。可施用一个或多个剂量。可选地，或另外地，抗体或其片段可以通过连续输注施用。

抗体或其片段的剂量可例如在一段时间内(一个疗程)以周期性间隔施用，足以包括至少2剂、3剂、5剂、10剂或更多剂，例如，每日一次或两次，或每周约一至四次，或优选每周地、每两周地(每两周一次)、每三周地、每月地，例如，约1至12周，优选2至8周之间，更优选3至7周之间，甚至更优选4、5或6周。可影响有效治疗受试者所需的剂量和时间的因素包括：疾病或病症的阶段或严重程度、制剂、递送途径、以前的治疗、受试者的一般健康和/或年龄以及现有的其他疾病。此外，用治疗有效量的化合物向受试者进行治疗可包括单一治疗，或优选地，可包括一系列治疗。

如果受试者有发生本文所述的疾病的风险，抗体或其片段可在疾病完全发作前施用，例如作为预防措施。此类预防性治疗的持续时间可以是单剂量的抗体或其片段，或者治疗可为持续的(例如，多剂量)。例如，患有该病的人或有此病倾向的人可以用抗体或其片段治疗数天、数周、数月甚至数年，以防止病症的发生或暴发。

在某些实施方案中，抗体或其片段以约1mg/mL至约500mg/mL(例如，1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL，200mg/mL、225mg/mL、250mg/mL、275mg/mL、300mg/mL、325mg/mL、350mg/mL、400mg/mL、450mg/mL)的浓度皮下施用。在一个实施方案中，抗LILRB2抗体或其片段以50mg/mL的浓度皮下施用。在另一个实施方案中，抗体或其片段以约1mg/mL至约500mg/mL的浓度静脉内施用。在一个实施方案中，抗体或其片段以50mg/mL的浓度静脉内施用。

抗LILRB2抗体或其片段可单独或与(即，通过联合施用或序贯施用)其他可用于治疗本文所述的癌症或免疫疾病的治疗剂联合施用至患者，可以是期望的。此类治疗剂可以是化学或生物性质的。术语"生物"或"生物剂"是指旨在用作治疗的由生物体和/或其产品制成的任何药学上的活性剂。在一个实施方案中，附加治疗蛋白被包含在本发明的药物组合物中。

上述范围中的中间剂量也意欲在本发明的范围内。受试者可以每天、隔天、每周或根据经验分析确定的任何其他时间表施用此类剂量。示例性治疗需要多剂量施用，持续时间为例如至少6个月。在一些方法中，两种以上的多肽可以同时施用，在这种情况下，每种多肽的施用剂量在所指示的范围内。

本发明的多肽可多次施用。单次剂量之间的时间间隔可以是每日、每周、每月或每年。通过测量患者的修饰多肽或抗原的血液水平，时间间隔也可以是不规则的。可选地，多肽可以作为一种缓释制剂施用，在这种情况下，需要较少频繁的施用。剂量和频率随患者的多肽半衰期而变化。

施用的剂量和频率可根据治疗是预防性的或治疗性的而有所不同。在预防性应用中，将包含本发明的多肽或其混合物(crocktail)的组合物施用至尚未处于疾病状态的患者以增强患者的抵抗力或最小化疾病的影响。这样的量被定义为“预防性有效剂量”。在较长的时间内，以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量是。有些患者的余生将继续接受治疗。

使用方法

本公开的抗体或其抗原结合片段可用于治疗患有疾病或病况的受试者(例如，人)的方法。疾病或病况可包括但不限于，癌症、或促进用于抗病毒免疫应答或抑制慢性感染的促炎免疫应答。

例如，本发明包括使用抗LILRB2，包括具有抗LILRB2活性的拮抗剂或激动剂。本发明包括向受试者(例如，哺乳动物，例如，人)施用抗LILRB2抗体或其片段，并考虑人类和兽医治疗用途。说明性的兽医受试者包括哺乳动物受试者，例如农场动物和家畜。

本文提供了刺激哺乳动物(例如，人)中促炎免疫应答的方法，其包括向哺乳动物施用治疗有效量的如本文所述的抗LILRB2抗体或其片段。

在一些实施方案中，哺乳动物中促炎免疫应答的增加可检测为哺乳动物的一种或多种促炎蛋白水平的增加(例如，C反应蛋白、IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-23、IL-17、和基质金属蛋白酶中的一种或多种的增加)或哺乳动物中效应T细胞(Teff)的数量的增加(例如，与处理前哺乳动物中一种或多种促炎蛋白的水平和/或哺乳动物中效应T细胞的水平相比，或与对照健康哺乳动物中存在的一种或多种促炎蛋白的水平和/或效应T细胞的水平相比)。

本文提供哺乳动物(例如，人)治疗方法，其包括向哺乳动物施用治疗有效量的如本文所述的抗LILRB2抗体或其抗原结合片段(或包括抗体或其抗原结合片段的药物组合物)。

在一些实施方案中，哺乳动物(例如，人)先前被诊断为患有癌症(例如，本文所述的任何不同类型的癌症)。癌症的非限制性实例包括：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、胆管癌、骨癌、脑癌、宫颈癌、心脏肿瘤、食管癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、头颈部癌、心脏癌、肝癌、喉癌、白血病、唇癌和口腔癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、口癌、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、阴茎癌、垂体肿瘤、视网膜母细胞瘤、肉瘤、皮肤癌、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、尿道癌，子宫癌、阴道癌和外阴癌。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤、白血病、或乳腺癌。患有癌症的哺乳动物可出现以下一种或多种症状：疲乏、皮肤下可感觉到的肿块或增厚、体重变化、皮肤变化(例如，发黄、皮肤变暗或发红、不能愈合的疮或现有的痣变化)、肠道或膀胱习惯的变化、持续咳嗽、吞咽困难、声音嘶哑、进食后持续的消化不良或不适，持续的、无法解释的肌肉或关节疼痛，以及无法解释的和持续的发热或盗汗。哺乳动物所经历的特定症状将取决于特定类型的癌症。哺乳动物可基于观察哺乳动物中的一种或多种癌症症状(例如，本文所述或本领域已知的任何癌症症状)而被诊断为患有癌症。哺乳动物也可基于成像(例如，磁共振成像、计算机断层扫描和/或X射线)和/或组织活检结果被诊断为癌症。哺乳动物也可基于使用分子诊断试验(例如，基于前列腺癌特异性抗原的检测，或乳腺癌易感2蛋白、乳腺癌易感1蛋白或肿瘤抑制蛋白(例如，p53)的突变)被诊断为患有癌症。本领域已知其他诊断哺乳动物患有癌症的方法。癌症的治疗的有效性可通过哺乳动物中癌症症状(例如，本文所述或本领域已知的任何癌症症状)的数量减少和/或哺乳动物中一种或多种癌症症状(例如，本文所述或本领域已知的任何症状)的频率和/或严重程度的减少来检测。哺乳动物中癌症的有效治疗也可通过哺乳动物中的肿瘤生长速率的下降来评价(例如，与治疗施用前哺乳动物中的肿瘤生长速率相比，或与未施用治疗或施用不同治疗的患有相同类型癌症的对照哺乳动物相比)。哺乳动物中癌症的有效治疗也可以通过哺乳动物癌症缓解时间的延长来观察(例如，与未施用治疗或施用不同治疗的患有相同类型癌症的对照哺乳动物相比)。

哺乳动物可以是女性或男性，也可以是成年或少年(例如，婴儿)。哺乳动物可以先前已接受过化学治疗剂和/或止痛剂治疗和/或对化学治疗剂和/或止痛剂反应不佳。哺乳动物可以患有非转移性癌症。在一些实施方案中，哺乳动物可以患有转移性癌症。如果哺乳动物是成人，哺乳动物可以是，例如18至20岁或至少或约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95岁，或至少或约100岁。

还提供了治疗哺乳动物(例如，人)中癌症的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的如本文所述的抗LILRB2抗体或其抗原结合片段(或包括抗体或其片段的药物组合物)。

本文还提供治疗有需要的哺乳动物(例如，人)中癌症的方法，其包括向所述哺乳动物施用本文所述的抗体或其抗原结合片段(或包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物)和PD-1或PD-L1抑制剂。

在一些实施方案中，本文所述的治疗癌症的方法还包括向所述哺乳动物施用化学治疗剂或止痛剂。在一些实施方案中，本文所述的治疗癌症的方法还包括向所述哺乳动物施用免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，本文所述的治疗癌症的方法还包括向所述哺乳动物施用选自由以下组成的组的一种或多种附加试剂：髓源性抑制细胞、动员剂、c-junN-末端激酶抑制剂、抗炎剂、和免疫抑制剂。

本文还提供治疗有需要的哺乳动物(例如，人)中感染的方法，其包括向所述哺乳动物施用本文所述的抗体或其抗原结合片段(或包含抗体或其片段的药物组合物)。在一些实施方案中，所述感染是细菌感染。

本文还提供降低有需要的哺乳动物(例如，人)中促炎免疫应答的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的本文所述的抗体或其抗原结合片段(或包含抗体或其片段的药物组合物)。在一些实施方案中，所述哺乳动物被诊断患有炎症、自身免疫性疾病、或移植排斥。在一些实施方案中，所述哺乳动物被选择用于器官或组织移植。

本文还提供治疗有需要的哺乳动物(例如，人)中炎症、自身免疫性疾病、或移植排斥的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的本文所述的抗体或其抗原结合片段(或包含抗体或其片段的药物组合物)。在一些实施方案中，所述哺乳动物被诊断患有炎症、自身免疫性疾病、或移植排斥。在一些实施方案中，所述哺乳动物被选择用于器官或组织移植。

本文还提供治疗有需要的哺乳动物中癌症的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的本文所述的CAR(或包含或编码本文所描述的CAR的细胞或包含所述细胞的药物组合物)或包含所述CAR的药物组合物。在一个实施方案中，所述癌症为淋巴瘤、白血病、结肠癌、或乳腺癌。在一个实施方案中，所述哺乳动物为人。

在另一方面，本文提供治疗有需要的哺乳动物中哮喘的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的本文所述的CAR(或包含或编码本文所述的CAR的细胞或包含所述细胞的药物组合物)或包含所述CAR的药物组合物。在一个实施方案中，所述哺乳动物为人。

在另一方面，本文提供治疗有需要的哺乳动物中感染的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的本文所述的CAR(或包含或编码本文所述的CAR的细胞或包含所述细胞的药物组合物)或包含所述CAR的药物组合物。在一个实施方案中，所述哺乳动物为人。

在另一方面，本文提供治疗有需要的哺乳动物中炎症、自身免疫性疾病、或移植排斥的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的本文所述的CAR(或包含或编码本文所描述的CAR的细胞或包含所述细胞的药物组合物)或包含所述CAR的药物组合物。在一个实施方案中，所述哺乳动物为人。

治疗用装置和试剂盒

包括本文所述的抗LILRB2抗体或其片段的药物组合物可与医疗装置一起施用。所述装置可设计为具有例如便携性、室温储存和易用性等特点，使得其可在紧急情况下使用，例如由未受过训练的受试者或由现场急救人员从医疗设施和其他医疗设备中取出。所述装置可包括，例如，一个或多个壳体用于储存含有抗LILRB2抗体或其片段的药物制剂，并可配制成递送一个或多个单位剂量的抗体或其片段。所述装置还可配置成施用第二试剂，例如化学治疗剂，作为也包括抗LILRB2抗体或其片段的单一药物组合物、或作为两种单独的药物组合物。

抗LILRB2抗体或其片段可在试剂盒中提供。在一个实施方案中，所述试剂盒包括(a)含有包含本文所述的抗LILRB2抗体或其片段的组合物的容器，和任选地(b)信息材料。信息材料可以是描述性的、指导性的、营销的或与本文所述的方法和/或为治疗目的使用试剂相关的其他材料。

在一个实施方案中，所述试剂盒还包括用于治疗本文所述的病症的第二试剂。例如，所述试剂盒包括包含抗LILRB2抗体或其片段的组合物的第一容器和包含第二试剂的第二容器。

试剂盒的信息材料的形式不受限制。在一个实施方案中，所述信息材料可包括关于所述化合物的生产、所述化合物的分子量、浓度、到期日期、批次或生产地点信息等的信息。在一个实施方案中，信息材料涉及施用抗LILRB2抗体或其片段的方法，例如，以合适的剂量、剂型或施用模式(例如，本文所述的剂量、剂型或施用模式)施用，以治疗患有或处于本文所述的疾病风险的受试者。信息可以各种格式提供，包括印刷文本、计算机可读材料、视频记录或音频记录，或对实质性材料提供例如在因特网上的链接或地址的信息。

除了抗LILRB2抗体或其片段以外，试剂盒中的组合物还可包括其他成分，如溶剂或缓冲液、稳定剂、或防腐剂。抗LILRB2抗体或其片段可以任何形式提供，例如液体、干燥或冻干形式，优选实质上纯和/或无菌的。当试剂以液体溶液提供时，液体溶液优选为水溶液。在某些实施方案中，液体溶液中的抗LILRB2抗体或其片段的浓度为约25mg/mL至约250mg/mL(例如，40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、75mg/mL、85mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL和200mg/mL)。当抗LILRB2抗体或其片段作为冻干产品提供时，抗LILRB2抗体或其片段为约75mg/小瓶至约200mg/小瓶(例如，100mg/小瓶、108.5mg/小瓶、125mg/小瓶、150mg/小瓶)。冻干粉末通常通过添加合适的溶剂来复溶。例如无菌水或缓冲液(例如PBS)等溶剂可以任选地提供在试剂盒中。

试剂盒可包括用于组合物或包含试剂的组合物的一个或多个容器。在一些实施方案中，试剂盒包含用于组合物和信息材料的单独容器、隔板或隔室。例如，组合物可被包含在瓶子、小瓶、或注射器中，信息材料可被包含在塑料套管或包装中。在其他实施方案中，试剂盒的单独的元件被包含在单个的、不被分割的容器中。例如，组合物被包含在信息材料以标签形式附在其上的瓶子、小瓶或注射器中。在一些实施方案中，试剂盒包括多个(例如，一盒)单独的容器，每个容器包含一个或多个单位剂型(例如，本文所述的剂型)的试剂。容器可包括组合单位剂量，例如，如以期望的比率包括抗LILRB2抗体或其片段和第二种试剂二者的单位。例如，试剂盒包括多个注射器、安瓿、铝箔包装、泡罩包装或医疗器械，例如，各自包含单个组合单位剂量。试剂盒的容器可以是气密的、防水的(例如，不透湿或不透蒸发的)和/或不透光的。

该试剂盒任选地包括适于施用该组合物的装置，例如注射器或其它合适的递送装置。该装置可以预先装有一个或两个试剂，或者可以是空的，但适合装载。

实施例

本发明在以下实施例中进一步描述，其不限制权利要求中所描述的本发明的范围。

如下所述生产(实施例1和9)和表征(实施例2-9)特异性结合至LILRB2的单克隆抗体。抗LILRB2抗体表现促炎或抗炎应答并通过调节LILRB2信号传导来调节T细胞介导免疫。此外，以下描述的抗LILRB2抗体介导对表达LILRB2的肿瘤细胞的抗肿瘤应答。

实施例1

如下所述产生特异性结合至LILRB2的单克隆抗体。抗LILRB2抗体可表现促炎或抗炎应答并通过调节LILRB2信号传导来调节T细胞介导免疫。此外，抗LILRB2抗体可以介导对表达LILRB2的肿瘤细胞的抗肿瘤应答。

抗LILRB2抗体的产生和纯化

在ClonaCell-HY Medium A(StemCell Technologies)中培养产生自克隆性杂交瘤细胞的单克隆抗体，然后使用Hybridoma-SFM(ThermoFisher Scientific)适应无血清条件。将杂交瘤细胞在50mL的Hybridoma SFM中扩增2周或直至培养基被耗尽。离心收集含抗体的上清液，然后进行无菌0.22微米过滤。使用标称分子量限为100kDa(Millipore)的Amicon Ultra-15离心过滤浓缩器浓缩抗体。然后根据制造商的说明使用Nab蛋白A/G Spin试剂盒(Thermo Fisher Scientific)纯化浓缩的抗体。使用Zeba旋转柱(Thermo FisherScientific)脱盐纯化的抗体。

杂交瘤IgL和IgH链测序

使用Trizol抽提法从杂交瘤克隆中提取RNA。根据制造商的指示、使用OneStepRT-PCR试剂盒(Qiagen)从纯化的RNA合成cDNA。使用简并引物对Ig重链和轻链进行PCR。随后测序(GeneWiz)扩增的PCR产物，并使用国际免疫遗传学信息系统的IMGT/V-QUEST进行验证。

杂交瘤测序

使用小鼠κ和重链Ig基因侧翼的简并引物，对指定克隆确定重链和轻链基因及互补决定区(CDR)序列。使用RT-PCR法将分离自早期传代杂交瘤细胞的总RNA转化为cDNA，然后对重链和轻链基因进行PCR扩增。PCR产物经Sanger测序后与数据库中已知的等位基因框架进行Ig-BLAST比较。生产性抗体序列列于表1、2、5和6中，显示最接近对齐的小鼠等位基因和CDR1-3。所选抗LILRB2抗体(鼠)的CDR氨基酸序列提供于表1、2、和5。CDR基于Kabat编号系统。表6示出用于所选抗LILRB2抗体(鼠)的最接近对齐的小鼠等位基因和CDR1-3。

在低剂量LPS刺激下，抗LILRB2拮抗剂促进TNFα分泌，而抗LILRB2激动剂促进自总外周血单核细胞(PBMC)的IL-10分泌。本发明人在炎症条件下筛选了具有总PBMC生物学功能的几种单克隆抗体(mAb)。具有拮抗功能特征的mAb可进一步促进低剂量LPS刺激下从总PBMC的TNFα产生，但不影响IL-10的分泌，意味着它们在治疗癌症或感染性疾病中是有效的。另一方面，激动性克隆可以增加IL-10的产生(图1)，用于治疗自身免疫性疾病、炎症或移植排斥。诱导TNFα分泌的那些克隆被认为是拮抗剂，而诱导IL-10的那些被认为是激动剂。拮抗性抗LILRB-1抗体描述于表1中。激动性抗LILRB-1抗体描述于表2中。

本领域技术人员将理解，抗体的名称(例如，5G5)及其杂交瘤克隆名称(例如，P_5G5)可交换使用并且意指具有彼此相同的序列的抗体。例如，5G5和P_5G5可交换使用来意指分别具有SEQ ID NOs:225、230、和244的HCDR1-3、和分别具有SEQ ID NOs:24、202、和216的LCDR1-3的抗体。

实施例2

抗LILRB2抗体体外调节TNFα分泌。

用抗LILRB2纯化抗体(5μg/ml)、或同种型对照过夜培养获得自健康供体的总外周血单克隆细胞(PBMC)16小时、然后用LPS(50ng/ml)刺激24小时。收集上清液并通过ELISA测定TNFα浓度(图1)。同种型处理用作对照。抗LILRB mAb通过TNFα释放中的相对倍数变化，按抑制TNFα释放的克隆至增强TNFα分泌的克隆的顺序排列(图1A)。图1B示出TNFα释放的原始数据。图1C示出来自图1B的TNFα水平的总体差异。

表3和表4中提供实施例2的原始数据。

实施例3

抗LILRB2抗体体外调节IL-10的产生。

用抗LILRB2纯化抗体(5μg/ml)、或同种型对照过夜培养获得自健康供体的总外周血单克隆细胞(PBMC)16小时、然后用脂多糖(LPS)(50ng/ml)刺激24小时。收集上清液并通过ELISA测定IL-10浓度(图2)。同种型处理用作对照。抗LILRB mAb通过IL-10释放中的相对倍数变化，按抑制IL-10释放的克隆至增强IL-10分泌的克隆的顺序排列(图2A)。图2B示出IL-10释放的原始数据。图2C示出来自图1B的IL-10水平的总体差异。

表3和表4中提供实施例3的原始数据。

抗LILRB2对M1/M2分化的作用

图2D示出对LILRB2抗体对来自多个肺癌患者的肿瘤相关巨噬细胞的M1/M2标记物的作用的流式细胞术分析。分离肿瘤浸润淋巴细胞并在IFNγ的存在下用LILRB2拮抗性抗体(P_5G5)处理2天。收获试验细胞用于细胞术分析(图2D，上部)；对多个患者的统计学分析示于图2D，下部。

图2E示出对LILRB2抗体对多个健康供体中的M1/M2标记物的作用的流式细胞术分析。在GM-CSF 100ng/ml和激动性抗LILRB2 Ab(12H6,5μg/ml)的存在下，从分选自健康供体的CD33⁺髓系细胞分化M1型巨噬细胞6天，并用IFNγ(25ng/ml)和LPS(25ng/ml)分化最后24小时。收获试验细胞用于细胞术分析(图2E，上部)；对多个健康供体的统计学分析示于图2E，下部。

图2F示出拮抗性和激动性LILRB2抗体对来自多个健康供体的OKT3刺激的PBMC的质谱细胞术分析。PBMC获得自健康供体并用纯化LILRB2拮抗性(C_1H3)和激动性(C_8B5)抗体(5μg/ml)或同种型对照过夜处理16小时、然后用OKT3(0.01μg/ml)刺激3天。收获试验细胞用于细胞术分析(参见图2F中的热图，左部和迪士尼图，右部)。图2F，左部表示示出免疫细胞子集(PBMC、CD4和CD8 T细胞)中指定标记物的表达的热图。图2F，右部表示示出由我们的38-抗体板分析并由标记物染色的1x10⁶个PBMC、CD4和CD8 T细胞的子集的数据基于IgG对照归一化表达的t-SNE图。

实施例4

抗LILRB2抗体体外调节T细胞增殖和IFNγ分泌。

用LILRB2拮抗性抗体过夜(16小时)培养PBMC并用低剂量(0.01μg/ml)的抗CD3(OKT3)刺激3天。在处理3天后，在培养的最后8小时添加[³H]-胸苷、然后在闪烁计数器上测量。图3A示出T细胞增殖(CPM)。自图3A的样品收集上清液并通过ELISA测定IFN-γ浓度(图3B)。同种型处理用作对照。图3C-3D表示来自培养的人PBMC(应答物)的流式细胞数据，所述PBMC由CFSE标记、并在IgG同种型对照或指定的LILRB2抗体(5μg/ml)的存在下由辐射的(30Gy)不相关供体PBMC(刺激物)刺激。应答物/刺激物的比为1/2。在共培养5天后，通过流式细胞术分析存活的CD4 T细胞(左部)和CD8 T细胞(右部)。代表性流式图显示为CFSE稀释和分裂细胞百分比。

抗LILRB2抗体体外调节IFNγ释放。

用LILRB2拮抗性抗体过夜(16小时)培养PBMC并用低剂量(0.01μg/ml)的抗CD3(OKT3)刺激3天。自图3A的样品收集上清液并通过ELISA测定IFN-γ浓度(图3B)。同种型处理用作对照。

抗LILRB2抗体体外抑制同种异体T细胞增殖。

用LILRB2激动性抗体过夜(16小时)培养CFSE标记的PBMC，并用低剂量(0.01μg/ml)的抗CD3(OKT3)刺激3天(图3C)。在培养3天后，通过流式细胞术分析存活的CD4 T细胞(图3C，左部)和CD8 T细胞(图3C，中部)。代表性流式图显示为CD4和CD8 T细胞的CFSE稀释(图3C，左部和中部)和增殖指数(图3C，右中部用于CD4细胞，右下部用于CD8细胞)。收获上清液用于图3C右上部示出的IFNγ检测。

OKT3介导的T细胞增殖和IFNγ分泌被激动性克隆强烈抑制，然而拮抗性克隆增强IFNγ生产和增殖或对不同健康供体无作用(图3A-3B)。此外，LILRB2激动性抗体介导混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制(图3D)。

抗LILRB2可抑制多种癌症类型的癌细胞的增殖。

本发明人进一步试验了LILRB2 mAb对髓系白血病细胞增殖的影响。拮抗性克隆抑制U937和HL60细胞的增殖活性。

实施例5

抗LILRB2抗体抑制白血病细胞的增殖

用对照Ig或抗LILRB2 mAb(5微克)处理LILRB2转导的U937白血病细胞42天。通过[³H]-胸苷掺入法评价U937细胞增殖。在培养的最后8小时用[³H]-胸苷脉冲细胞。图4A示出LILRB2+THP-1细胞(CPM)的增殖。

LILRB2拮抗性克隆在乳腺癌细胞上的增殖

用抗LILRB2抗体(5μg/ml)或同种型对照处理LILRB2转导的人乳腺癌细胞(MCF7)4天。通过[³H]-胸苷掺入法评价LILRB2+MCF7细胞增殖。在培养的最后8小时用[³H]-胸苷脉冲细胞。图4B示出LILRB2+MCF7细胞(CPM)的增殖。

实施例6

LILRB2拮抗剂抑制LILRB2+MDAMB231乳腺癌细胞的迁移能力

通过划痕试验(图5A)和transwell试验(图5B)，LILRB2⁺MDAMB231乳腺癌细胞的迁移能力被5微克/ml浓度下的拮抗性克隆C_5C12实质上抑制。

实施例7

拮抗性抗LILRB2抗体增强疫苗佐剂效应(CpG)和细菌调理作用/吞噬作用

用IgG对照或LILRB2拮抗性抗体(P_5G5)(150μg/小鼠)静脉内注射MISTRG小鼠两天，然后用5nmol腹膜内激发。2小时后，从试验小鼠收集血清并对TNFα水平进行ELISA分析(图6A，左部)。

用LILRB2拮抗性抗体(P_5G5)或对照Ig(150μg/小鼠)腹膜内注射人源化MISTRG小鼠48小时。分离外周血细胞并在37℃下以2×10⁸个大肠杆菌每1×10⁷个外周血细胞的比用表达GFP的大肠杆菌培养4小时。收获细胞并用PBS洗涤并通过对存活的CD45⁺CD33⁺群体设门进行分析。结果显示拮抗性LILRB2抗体(P_5G5)强烈增强对CpG激发的系统性应答并增强巨噬细胞的吞噬活性(图6A，右部)。

LILRB2拮抗剂体内抑制癌细胞的生长

本发明人还评价了异种移植小鼠模型中抗LILRB2 mAb对LILRB2转导的THP-1白血病细胞的抗肿瘤作用。我们试验了具有或不具有抗PDL1抗体处理的抗LILRB2 mAb(克隆P_5G5)的抗肿瘤作用，并且发现拮抗性克隆P_5G5体内协同抗PDL1的抗肿瘤作用(图6B)。此外，当与抗PD-1组合时，LILRB2拮抗性抗体(P_5G5)的抗肿瘤作用抑制HLA-A2匹配的人源化NCG小鼠模型中的荧光素酶-表达的-A549(Luciferase-expressed-A549)的肿瘤生长(图6C)。这些数据表明LILRB2拮抗性抗体可促进骨髓分化并抑制肿瘤生长(图6C)。

实施例8

抗LILRB2抗体对人PBMC增殖的共刺激作用

在1μg/ml抗PD-1抗体、1μg/ml的4-1BBL、100ng/ml的OX40L、或1μg/ml的GITRL的存在下，用抗LILRB2 Ab(5μg/ml)过夜培养(16小时)并刺激来自健康供体的1x10⁵个总PBMC，其后用低剂量的抗CD3(OKT3，0.01μg/ml)培养并刺激3天(图7A)。在3天的处理后，通过[³H]-胸苷掺入法评价T细胞增殖。在培养的最后8小时添加胸苷，接着在闪烁计数器上测定。图7B示出对T细胞增殖(CPM)的作用。收获上清液用于图7C示出的干扰素γ生产的检测。

实施例9：阻断免疫抑制性受体Lilrb2重编程肿瘤相关髓系细胞并促进抗肿瘤免疫

介绍

巨噬细胞不仅在感染期间介导炎症，并且还在炎症消退期间抑制免疫(1)并促进肿瘤微环境内的免疫逃逸(2)。巨噬细胞表型的功能可塑性大大受到周围环境的影响。病毒和细菌激活toll样受体信号传导来驱动NFκB并有利于iNOS、TNFα、和IL12的巨噬细胞释放来支持Th1免疫，同时Th1相关IFNγ激活STAT1来支持效应物T细胞应答。相反地，分泌自肿瘤细胞的体液细胞因子IL4/IL13和IL10刺激巨噬细胞来释放IL10、TGFβ、和精氨酸酶1。STAT6、STAT3、和基质蛋白酶的同时激活进一步支持组织重构和Th2免疫(3)。是否、和如何靶向成熟途径来控制髓系细胞分化的可塑性，和巨噬细胞表型保持用于目前癌症免疫疗法的激发任务。

在髓系受体中，成对免疫球蛋白样受体B(PIR-B)是人白细胞免疫球蛋白样受体B(LILRB)家族(也被称为ILT、LIR、和CD85)的单独小鼠受体直向同源物(4、5)。在B细胞中，Pirb缺陷导致增加的BCR信号传导和极度活跃(6)。Pirb缺陷巨噬细胞类似地具有增加的促炎细胞因子释放并使自身免疫性疾病恶化(7)。PIR-B通过顺式和反式结合MHC I来内环境稳定地抑制免疫激活(8、9)。SHP1/2磷酸酶结构性地结合至PIR-B的胞浆结构域并推测在稳态下具有调节作用(10、11)。我们先前的研究表明，PIR-B是维持肿瘤浸润髓源性抑制细胞(MDSC)的M2样表型的关键调节子(12)。TLR和IFNγ信号传导在Pirb缺陷MDSC中被放大，同时IL4/IL13和IL10被抑制。具有Pirb缺陷的小鼠具有降低的肿瘤负担、增强的抗肿瘤应答、降低的Treg激活、和类似M1样经典激活的浸润巨噬细胞谱(12)。类似于小鼠PIR-B，人LILRB携带基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，其可减弱由携带基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的受体的交联依赖性激活产生的信号级联(13)。然而，主要因为人和小鼠之间缺乏保守性，很少知晓LILRB是如何调节人髓系细胞和巨噬细胞激活的，人中具有多个LILRB家族成员而不是一个PIR-B。

Lilrb1-5的表达在髓系细胞群体中富集并且似乎是灵长类动物-特异性的(14-16)。LILRB3和LILRB4是孤儿受体(17，18)，LILRB5据报告结合HLA-B27的无β2m的重链(19)。LILRB1和LILRB2是最好表征的受体，二者以低结合亲和性(对于LILRB2，Kd＝14～45μM)结合经典和非经典HLA I类(17，20)以及结合血管生成素样蛋白家族(21)的成员(22)。此外，LILRB1和LILRB2可与CD8竞争HLA-I结合以潜在调节CD8⁺T细胞应答(22)。通过HLA-B变体的病毒表达的LILRB2激活可促进髓系细胞耐性和下调树突状细胞(DC)的成熟和共刺激分子表达(23)。多个研究显示，HLA-G-LILRB1/2结合增加IL4和IL13、抑制促炎细胞因子释放、并促进IL10和TGFβ调节细胞因子的分泌(24)。DC上低水平的LILRB表达与增强的抗原呈递细胞功能相关(25)。LILRB2激动作用显示阻断DC Ca²⁺-通量(17)并在DC的耐受作用中起到重要作用(26)。因此，我们假设通过拮抗细胞表面受体介导的激活来靶向LILRB2可潜在改变具有免疫抑制活性的髓系细胞(即MDSC或肿瘤相关巨噬细胞(TAM))的功能趋于经典激活的炎症巨噬细胞表型。

目前的研究被设计成调查LILRB2是否是用于调控髓系细胞功能的有效且充分的靶标。我们产生LILRB2特异性单克隆抗体并发现，LILRB2拮抗作用的子集应答于MCSF改变巨噬细胞的AKT依赖性成熟，并应答于LPS/IFNγ刺激增强NFκB和STAT1激活。LILRB2拮抗作用还赋予巨噬细胞对由IL4的体液细胞因子依赖性STAT6激活的抵抗性，减轻巨噬细胞对T细胞增殖的抑制作用，并重编程来自A549肺肿瘤模型和原代人非小细胞肺癌(NSCLC)的人巨噬细胞。此外，当与抗PDL1共同使用时，LILRB2阻断改变肿瘤微环境并促进抗肿瘤免疫。

我们的发现建议，人LILRB2是用于髓系细胞成熟的关键内环境稳定表面调节子，具有极大治疗价值，作为特异性地针对髓系细胞功能确定的有希望的髓系免疫检查点靶标。LILRB2的阻断可被用于重编程TAM以通过调节肿瘤微环境改善癌症免疫疗法的治疗结果。

结果

LILRB2抗体的子集增强人单核细胞的激活

为了调查LILRB2对人巨噬细胞的生物学重要性，我们通过用编码Lilrb2cDNA的质粒免疫小鼠、然后用LILRB2囊泡(vesicle)或蛋白加强免疫来开发抗LILRB2抗体。我们通过流式细胞术、接着基于外周血单核细胞(PBMC)的功能性检验来对杂交瘤上清液扫描LILRB结合，来评价克隆是否可放大单核细胞激活。在多个PBMC供体之间存在LPS的情况下，几个抗体克隆可增强CD86和TNFα水平(图9A，图9B)。由于LILRB家族的成员共享高度的同源性，我们通过产生由各个受体的胞外结构域稳定转导的细胞系来试验潜在交叉反应性(图16A)。由于该受体与LILRB2胞外结构域共享约80％的同源性，也包括与LILRA1的交叉反应性。FACS染色表明，LILRB2抗体不与相关家族成员交叉反应(图9C)。PBMC的染色还受限于CD33⁺髓系子集，特别地染色CD14⁺CD16^hi和CD14⁺CD16^lo单核细胞群体(图16B)。我们识别了应答于低剂量的LPS刺激增强单核细胞炎症潜能的LILRB2特异性抗体。然后，我们确定抗LILRB2针对稳定表达LILRB2受体的THP1人单核细胞细胞系的结合亲和性(图9D)。生物膜层干涉技术是在固定化探针上测定分子相互作用中的变化的光学技术。使用该方法，我们测定了滴定浓度下的固定化抗LILRB2与LILRB2-His单体的连接和解离(图9E)。复合物的解离在所有试验的LILRB2-His浓度下为最小，亲和性在1.8-3.8nM的范围内计算并且比内源HLA配体结合(Kd＝14～45μM(22))强约1000倍。

LILRB2拮抗作用改变巨噬细胞的MCSF依赖性成熟

由于LILRB2拮抗剂应答于LPS放大单核细胞激活，我们调查了LILRB2阻断如何影响巨噬细胞成熟。人单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)中的研究说明炎症诱因导致的不同成熟表型(27，28)。我们通过用M-CSF处理来自健康供体的PBMC的CD33⁺单核细胞5-7天来产生不成熟巨噬细胞M(-)。虽然在对照Ig的存在下培养的巨噬细胞出现伸长且松散的粘附，但在抗LILRB2的存在下培养的单核细胞出现更圆且紧密的粘附(图10A)。其他人已报告MCSF和IL10对纺锤状形态的积极效果和MCSF来源的人巨噬细胞的体外功能(29，30)。这些观察提示LILRB2拮抗作用可能干扰典型MCSF依赖性成熟。我们观察到，在所有试验的人供体中，应答于抗LILRB2，CD14和CD163二者的表达减少(图10B，图10C)。CD14已显示由MCSF(27)和CD163上调，和CD14是其细胞表面表达与抗炎应答相关的清道夫受体并且是各种癌症的不良预后的指标(31，32)。CD163在M-CSF、IL6、IL10的存在下和应答于糖皮质激素也被增强(33)。为了确定巨噬细胞是否对LPS刺激表现出与单核细胞所表现的一样的差异反应，我们用LPS过夜刺激不成熟巨噬细胞并测定TNFα和IL10细胞因子水平(图10D)。在多个供体中，我们始终观察到增加的TNFα和抑制的IL10分泌。在LPS刺激前在巨噬细胞培养中不能观察到可检测的TNFα(数据未示出)表明TNFα的增加对抗体功能性活性为特异性的。

IRF5由I型干扰素诱导并促进由IRF4抑制的炎症巨噬细胞极化(34)。IRF4与由IL4诱导的替代性巨噬细胞成熟相关，并且负调节TLR信号传导和促炎细胞因子(35，36)。IRF3由TLR信号传导激活并诱导I型干扰素-STAT1信号级联(37)，然而IRF7被报道参与炎性小胶质细胞极化开关(38)。我们观察到，在不成熟巨噬细胞的分化期间，抗LILRB2上调IRF3、5、和7，但下调IRF4(图10E)，表明抗LILRB2潜在地有利于经典的和炎症巨噬细胞极化。为了排除LILRB抗体纯化中的任何污染内毒素，我们确保在抗体批次中，内毒素水平小于0.005EU每μg。

为了探索抗LILRB2对巨噬细胞成熟途径的影响，我们从MCSF培养的M(-)产生成熟巨噬细胞、接着用LPS或IL4刺激24小时来分别产生M(LPS)和M(IL4)。与M(-)和M(IL4)相比，M(LPS)具有显著增加的PD-L1表达，与文献报道的应答于TLR激动剂的PD-L1上调相符(39)。令人惊讶地，我们发现抗LILRB2处理的M(LPS)显著抑制PD-L1的诱导表达(图10F、图10G)。PD-L1在M(IL4)上的表达是可忽略的。这些数据表明，LILRB2拮抗作用可帮助防止炎症环境中的效应物T细胞的PD-L1依赖性抑制。然后，我们调查了抗LILRB2如何能够应答于体液细胞因子IL4影响巨噬细胞成熟。我们关注巨噬细胞DC-SIGN(CD209)，因为其表达是部分地IL4依赖性的(32)，并且其已被报道是M(IL4)巨噬细胞成熟和免疫耐受性的被广泛接受的标记物(27，40)。我们发现，DC-SIGN在MCSF来源的M(-)和M(LPS)中以低水平被诱导，如在调控环境中先前报道的一样(41)。应答于IL4刺激，M(IL4)表达高水平的DC-SIGN。M(IL4)在抗LILRB2的存在下成熟并且显示显著较少的DC-SIGN表达的诱导，并且DC-SIGN的基础表达在M(LPS)中被发现(图10H、图10I)。总体来说，来自体外巨噬细胞培养的结果支持LILRB2拮抗作用使成熟变得敏感，有利于经典激活的表型。

LILRB2拮抗作用有利于NFκB/STAT1的激活和由IL4抑制STAT6激活

描述巨噬细胞成熟为M1样(经典激活)与M2样(替代激活)的组极大地分别表征与NFκB/STAT1激活和STAT6激活相关的炎症表型(3)。因此，我们评价了信号模式是否由LILRB2拮抗作用调节。应答于LPS刺激，抗LILRB2处理的细胞表现增加的NFκB、ERK1/2、和p38激活(图11A)。我们发现应答于IFNγ的NFκB、ERK1/2、和p38磷酸化以及STAT1磷酸化中类似的增加(图11B)。由于在LILRB2拮抗作用的存在下的降低的巨噬细胞DC-SIGN表达，我们还确定IL4相关信号传导是否被抑制。应答于IL4处理，抗LILRB2处理的细胞显示STAT6磷酸化的强力抑制(图11C)，伴随有增加的SOCS3而SOCS1表达中无显著改变(图11D)。除了炎性细胞因子，M-CSF驱动依赖于PI3K/AKT激活的巨噬细胞的增殖和存活(42，43)，敲除模型表明AKT在确定成熟表型中的重要作用(44)。我们始终观察到抗LILRB2处理的巨噬细胞中的AKT激活的减少水平，尽管存在外源MCSF(图11E)。总体来说，我们的数据表明LILRB2阻断通过抑制MCSF的PI3K/AKT途径下游来增加对炎症信号级联的敏感性。

LILRB受体已显示在巨噬细胞群体中构成性募集并激活SHP1(16)。免疫共沉淀实验表明，LILRB2相关SHP1磷酸化在抗LILRB2处理的巨噬细胞中减弱(图11F)。因此，LILRB2的SHP1激活下游的破坏可解释信号级联的增加的敏化。

LILRB2拮抗作用抑制对效应物T细胞的髓系依赖性抑制

由于LILRB2拮抗作用促进Th1适应性免疫的炎症途径支持，我们假设效应物T细胞应答将在抗LILRB2成熟巨噬细胞的存在下改善。巨噬细胞和MDSC已知通过使用各种机制抑制效应物T细胞应答，所述机制包括由吲哚胺2,3-双加氧酶的色氨酸分解代谢、PD-L1/L2表达、和细胞因子依赖性调节T细胞转换。为了试验天然适应性T细胞应答中抗LILRB2成熟巨噬细胞的抑制性，我们进行单向混合淋巴细胞反应(MLR)。3天后，观察到过渡生长的同种抗原特异性T细胞的克隆群体(图17A、图17B)。通过FACS确定CD4和CD8 T细胞的总数。在抗LILRB2的存在下产生的巨噬细胞与IgG处理的巨噬细胞相比，显示恢复的CD4/CD8 T细胞数(图11G)和IFNγ分泌(图11H)，表明抗LILRB2减弱抑制能力。在用低剂量的OKT3刺激的PBMC培养物中，抗LILRB2显著协同PD-1阻断来增强IFNγ的效应物T细胞分泌(图11I)。总而言之，我们表明LILRB2拮抗作用诱导增强适应性Th1效应物T细胞应答的巨噬细胞表型。

LILRB2阻断改变M(IL4)免疫的、迁移的、和囊泡运输的途径

转录组研究可提供对巨噬细胞的成熟和表型改变的更深刻的理解。比较M(LPS)和M(IL4)群体的早期微阵列研究已限定与M1与M2样功能性表型相关的标记物和途径网络(27)。在抗LILRB2背景中使用相同实验条件，我们进行Illumina微阵列分析来确定LILRB2阻断可以如何影响M(LPS)和M(IL4)中的转录网络。M(LPS)和M(IL4)IgG处理的转录组的比较限定了3,926个区别表达的基因(DEG)(图18A、图18B)，所述基因具有在前100和由Mantovani最初描述的那些之间显著重叠(27)。M(LPS)的抗LILRB2相对于IgG处理产生220个DEG，然而M(IL4)中的相同处理产生664个DEG(图12A)。66个DEG中的改变在抗LILRB2处理的M(LPS)和M(IL4)之间为保守的(图12B)。总体来说，这些数据表明LILRB2拮抗作用导致在IL4成熟相对于LPS成熟的条件下实质上更多的转录改变，66个保守的DEG表明LILRB2拮抗剂特异性基因改变独立于细胞因子诱导的成熟。调节免疫功能、脂质/胆固醇内环境稳定、和细胞骨架内环境稳定的基因最为突出。在M(LPS)和M(IL4)二者中，LILRB2阻断上调LILRA3转录物，其为可与其他LILR家族成员进一步竞争的分泌的LILR家族成员。抗LILRB2增加Ccl22、FGR、和Trem2转录以及M1相关Sphk1转录，但降低Siglec1、PLC诱饵信使Plcl2、和补体蛋白C2转录以及M2相关的Klf2转录物。M(LPS)和M(IL4)应答于IgG或抗LILRB2的主成分分析表明，LILRB2阻断产生彼此不同的独特巨噬细胞表型(图12C)。

LILRB2阻断对M(IL4)相对于M(LPS)总体转录具有更显著的影响的发现表明LILRB2在稳态或M2样巨噬细胞相对于M1样巨噬细胞中对于维持免疫平衡更重要。我们使用GOrilla平台(45，46)应用基因本体论分析来提供原始数据的功能性说明。M(LPS)DEG与G偶联蛋白受体信号传导、运输、和其他细胞过程相关。在M(IL4)中，LILRB2阻断显著改变与免疫功能、以及细胞迁移/运动性、脂质代谢作用、细胞凋亡/增殖相关的基因，并且增加酶促重构/活性(图19C、图19D)，然而，在LPS刺激中未注意到与免疫功能的明确关联(图19A，图19B)。应答于抗LILRB2，与免疫功能相关的M(IL4)基因被适当调节(图12D)。令人感兴趣地，涉及增加的适应性免疫和共刺激的CD83、Light、Ripk2、和Tweakr转录物被上调。与先前的报道一致(27，47)，M1相关基因被上调，包括Pfkp、Sphk1、Slc31a2、Serpine1、Hsd11b等(图19E)。鞘氨醇激酶1(Sphk1)与来自高脂饮食和ob/ob小鼠的肥胖脂肪组织巨噬细胞相关(48)。与M1相关基因相比，更多的M2相关基因由抗LILRB2下调，包括Il13rα1、CD302、Fgl2、组织蛋白酶C、CD163L1、Dc-sign(CD209)、Maf、Ccl13、Ccl23、Stab1和Tlr5(图12D)。LILRB2阻断在M(IL4)中抑制MAF，其为巨噬细胞增强子景观(landscape)和M2相关基因表达的重要调节子(49)。其他M2相关基因也被下调，包括Klf2/Klf4、Tgfbr2、Ms4a6a、Alox15等(图19E)。这些分子在M1/M2分化中的生物作用仍有待阐明。应注意，除了增加的Lilra3水平，用抗LILRB2处理的M(IL4)显示Lilrb5和Angptl4转录物的显著抑制。趋化因子转录物水平也被强烈抑制，例如Ccl8、Ccl26、Ccl13、Ccl14、Ccl15、和Ccl23。我们还观察到LILRB2阻断抑制LPS诱导的双特异性PTP(DSP)、Dusp10(MKP-5、JNK和p38途径相关磷酸酶)(50)和Dusp22(JSP-1、JNK途径相关磷酸酶)(51)，其介导炎症应答的负反馈控制。

总之，我们的全转录组分析表明LILRB2阻断导致巨噬细胞成熟中的表型改变，包括免疫、以及代谢、分选、和细胞骨架改变。

LILRB2阻断可改变肿瘤细胞诱导的巨噬细胞成熟并促进抗肿瘤免疫

我们确定了LILRB2阻断是否可在肿瘤来源的因子和肿瘤微环境的存在下改变巨噬细胞表型。一些肿瘤细胞足以促进在依赖于肿瘤细胞来源的IL6的过程中M-CSF由单核细胞的自分泌生产(52)。我们假设肿瘤细胞和人单核细胞的共培养足以产生巨噬细胞。对CD33⁺CD14⁺细胞设门，我们再现以下发现，A549 NSCLC细胞足以产生巨噬细胞，其特征类似于源自M-CSF培养的巨噬细胞(图13A)。我们还观察到，在LILRB2拮抗剂的存在下培养的A549来源的巨噬细胞具有降低的CD14、CD163、CD16和DC-SIGN水平(图13B)，与我们对MCSF原代巨噬细胞培养的观察相一致(图10)。类似于A549 NSCLC细胞，LILRB2拮抗剂对Hs578T乳腺癌细胞衍生的巨噬细胞赋予类似的影响(图20A、图20B)。然后，我们评价了在免疫缺陷NSG-SGM3小鼠中皮下共注射时，A549细胞是否可产生原代人巨噬细胞，和LILRB2阻断是否可类似地体内重编程巨噬细胞(图21)。FACS对人CD45⁺CD33⁺细胞设门限定了来自肿瘤单细胞悬浮液的人髓系细胞(图13C)。免疫标记物的FACS分析显示CD163的特异性减少在总共5个供体的4个中可再现地检测到(图21B)。此外，应答于αLILRB2，其他标记物包括CD14、CD16和PD-L1中的改变在供体之间是可变的。图13D示出来自一个供体的代表性数据，同时来自全部5个供体的对于CD14、HLADR和CD16的组合数据示于图21D。通过使用成对比较分析，在多个小鼠和多个人单核细胞供体中的抗LILRB2处理后，CD14和CD16被显著下调而HLA-DR被上调(图21D)。HLA-A2匹配的人源化NCG小鼠用于体内实验以追踪由LILRB2阻断和抗PD-1处理一起的长期抗肿瘤应答，使用具有表达荧光素的A549(LUC-A549)细胞的A549(HLA-A2⁺)移植瘤模型。结果显示抗LILRB2和抗PD-1组合实质上降低LUC-A549肿瘤负担(图13E)。为了评价抗LILRB2对体内促进人巨噬细胞的M1表型的影响，我们使用植入人CD34⁺脐带血干细胞的MISTRG小鼠产生人源化小鼠模型来研究人巨噬细胞的体内应答。MISTRG小鼠支持异种人造血发育，因为人源化敲入等位基因(M-CSF^h、IL3/GM-CSF^h和TPO^h)对于能够完全概括小鼠中人骨髓发育和功能的先天免疫细胞发育是重要的。在实验组之间观察到类似的人CD33⁺细胞植入率(图21C)。用CpG处理人源化小鼠并测量血清中的TNFα浓度。有趣地，在用抗LILRB2vs.对照Ig处理的小鼠中发现约2倍更高的人TNFα水平(图13F)。使用表达GFP的大肠杆菌试验该人源化小鼠模型中LILRB2对吞噬作用的影响。在与对照Ig处理组相比时，抗LILRB2显著增加表达GFP的大肠杆菌上的CD14⁺CD16^-单核细胞的吞噬活性(图13G)。

总之，我们的数据表明抗LILRB2可体内重编程人巨噬细胞来增强异种移植人肺癌模型中的抗肿瘤应答、对CpG激发的系统应答和人源化MISTRG小鼠中巨噬细胞的吞噬活性。总体结果表明，拮抗性LILRB2抗体可调节巨噬细胞功能至M1相关表型并进一步增强体内的促炎应答。

在携带同基因Lewis肺癌(LLC)的小鼠中，LILRB2阻断可增强抗肿瘤应答和降低MDSC和Treg群体。

由于LILRB2仅在人细胞上表达，不在小鼠细胞上表达，并且表现对小鼠Pirb基因非常低的同源性，我们的抗体不与小鼠系统交互反应。因此，我们采用BAC DNA注射来开发LILRB2转基因小鼠。这些小鼠在外周血中CD11b⁺细胞上高度表达LILRB2/3(图14A)，并且抗LILRB2处理应答于体外LPS刺激增加CD86⁺MHCII⁺群体(图14B、图14C)和TNFα分泌(图14D)。我们评价了LILRB2阻断单独或与抗PD-L1处理组合是否可在Lewis肺癌模型中抑制肿瘤发展并调节肿瘤微环境。PD-L1对肿瘤生长无影响，同时LILRB2阻断显示适中的抗肿瘤作用。PD-L1和LILRB2二者的阻断导致携带LLC肿瘤的小鼠中显著降低的肿瘤尺寸和重量(图14E)。此外，抗LILRB2和抗PD-L1的组合在肿瘤组织中显著降低粒细胞Ly6G+Ly6Cint MDSC群体但增加单核细胞Ly6G-Ly6Chi MDSC(图14F)。当抗LILRB2与抗PD-L1处理组合时，脾脏中的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg群体和肿瘤浸润淋巴细胞二者实质上降低(图14G)。总言之，LILRB2阻断显著降低MDSC和Treg群体并增强体内抗PD-L1处理的治疗功效。

原代肿瘤相关巨噬细胞离体应答LILRB2阻断

然后，我们确定了LILRB2阻断是否可离体重编程分离的原代肿瘤相关巨噬细胞。胶原酶消化的肿瘤组织的单细胞悬浮液用于分离肿瘤浸润淋巴细胞。通过对DAPI-阴性活细胞和人CD45设门，我们可以基于CD33、CD14、和HLA-DR设门识别浸润的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和MDSC(图15A)。对LILRB家族成员染色揭露MDSC和TAM群体中LILRB1、LILRB2、LILRB3、和LILRB4的可变、但普遍存在的表达(图15B，图15C)，同时分离自癌症患者的肿瘤组织或源自健康供体PBMC的树突状细胞表达LILRB2(图23A，图23B)。为了调查肿瘤浸润的髓系群体是否可应答LILRB2阻断，我们在存在或不存在IFNγ或抗LILRB2的情况下用M-CSF离体刺激肿瘤浸润的白血球48小时。来自大多数患者的单核细胞在抗LILRB2的处理下显示增强的TNFα释放(图15D)。细胞表面标记物CD163、DC-SIGN、和CD14的分析显示应答于LILRB2阻断的显著减弱的表达。尽管观察到降低的CD16和PD-L1表达的趋势，其不是统计学上显著的(图15E)。这些实验的持续时间为仅48小时并且包括在肿瘤中发现总白血球群体。然而，我们的离体数据表明，来自患者活组织检查的肿瘤相关巨噬细胞表达多种LILRB家族成员并且应答于LILRB2拮抗作用。

讨论

我们的研究表明，由特异性单克隆抗体的LILRB2的拮抗作用足以增强单核细胞中的炎症应答并且直接改变下游巨噬细胞成熟表型。我们观察到在LILRB2阻断下被废除的LILRB2的SHP-1下游的组成型激活。在LILRB2拮抗作用的存在下成熟的MCSF单核细胞来源的巨噬细胞显示对LPS和IFNγ刺激增加的敏感性，如增强的STAT1、ERK、和NFκB磷酸化所表明的，但对IL4刺激有耐性，如降低的STAT6磷酸化和DC-SIGN表达与增加的SOCS3所示出的。有趣地，LILRB2阻断其自身增强NFκB和ERK1/2磷酸化并降低AKT磷酸化，意味着单独的LILRB2拮抗作用足以适中地驱动MCSF单核细胞来源的巨噬细胞向M1谱系。然而，LILRB2拮抗作用抑制M2相关和IL4驱动的基因簇，同时促进与M1表型相关的那些。我们提议，LILRB2介导的信号调节模型(图15F)，其中LILRB2阻断可抑制SHP1 1/2磷酸化并导致M1编程，通过由SHP1/DUSP介导的直接或间接去磷酸化作用恢复ERK(53)和p38的激活(Y204处的ERK和Y182处的p38)，导致NFκB的进一步激活。与文献(54)相一致的，SHP1/SHP2募集/激活的下调导致JAK-STAT1信号传导的抑制物的去除，由此增强IFN诱导的信号级联(55)。另一方面，LILRB2拮抗作用通过增加SOCS3抑制STAT6磷酸化，SOCS3已被报道抑制IL4/STAT6信号传导(56)。SOCS3的诱导可起因于通过MAPK/NFκB级联的激活的促炎细胞因子(IL6和IL12)的抗LILRB2介导的释放(57，58)。LILRB2阻断显著抑制AKT的磷酸化，这可能是由于以下的潜在抑制：1)SOCS3(59，60)或，2)PI3激酶γ或SHIP-1–两种分子已被识别为用于免疫刺激和抑制之间的巨噬细胞转换器的关键调节子(61，62)。

我们先前已显示Pirb缺陷MDSC的过继性转移降低肿瘤负担和肺转移。调节巨噬细胞功能代表对癌症免疫疗法的有吸引力的方法，因为大量文献已显示TAM通常是有助于肿瘤免疫侵袭的肿瘤微环境的主要组分(2)。关注巨噬细胞消耗的TAM靶向疗法强调降低小鼠模型中肿瘤负担的临床益处(63)。然而，CSF1R抑制剂可增强促肿瘤粒细胞MDSC的循环水平，而CCL2中和处理的撤销可加速单核细胞重结合至肿瘤(64，65)。因此，在处理中断的情况下在乳腺癌的多个小鼠模型中观察到增强的转移和更差的结果。TAM和M2样巨噬细胞似乎共享功能相似性(66)。重编程TAM的免疫疗法支持适应性抗肿瘤免疫，提供避免与TAM损耗相关的潜在危险的替代策略(67)。LILRB2阻断似乎改变巨噬细胞的肿瘤依赖性成熟，类似于由MDM培养观察到的。此外，我们证明了在异种移植人源化小鼠中应答于LILRB2抗体处理的增强的急性TNFα释放和增加的吞噬细胞能力。来自NSCLC的患者活组织检查显示MDSC和TAM群体的显著浸润。在离体研究中，在LILRB2阻断的存在下，这些原代MDSC/TAM表达高水平的LILRB蛋白并且能够经受巨噬细胞表型转换。LILRB2似乎是收获自患者的原代单核细胞来源的巨噬细胞以及TAM群体中的关键负调节物。我们还观察到，抗LILRB2在免疫活性同基因LILRB转基因小鼠模型中在脾脏和肿瘤组织二者中显著降低Ly6G⁺Ly6C^int粒细胞MDSC。

最重要的，在携带人肺癌细胞A549的PBMC人源化NCG小鼠模型中，LILRB2拮抗作用实质上增强免疫检查点抑制剂抗PD-1的功效(图13E)。我们还证明了，LILRB2阻断在免疫活性同基因Lilrb2/3BAC转基因小鼠模型中的作用(图14E)。重要的是要注意，单独抗PD-L1处理显示在携带LLC肿瘤的免疫活性小鼠中有限的抗肿瘤作用(68，69)。我们发现，LILRB2拮抗作用在来自健康供体的激活的单核细胞中抑制LPS诱导的CD274(PD-L1)表达(图10)，并且LILRB2和PD-L1二者的阻断在LILRB2转基因小鼠中赋予针对LLC肿瘤的强宿主抗肿瘤免疫。伴随地，我们观察到由抗LILRB2和抗PD-L1处理的荷瘤小鼠中粒细胞MDSC和Treg的显著降低。单核细胞MDSC中的意料之外的增加不影响抗PD-L1的功效，表明LILRB2拮抗作用将单核细胞MDSC转换为非抑制性和免疫刺激性表型，类似于在LILRB2阻断的存在下在Pirb缺陷MDSC(12)和巨噬细胞中的那些(图13)。

多个途径已显示涉及M2极化，包括mTOR-脑信号蛋白6D(Sema6D)-过氧化物酶体增生物受体γ(PPARγ)(70)、PI3Kγ-mTOR(62)和TSC-mTOR途径(71，72)。靶向这些途径可潜在地提供免疫肿瘤学中的高治疗价值。我们的转录组数据表明，LILRB2阻断显著地下调涉及M2样成熟的多个基因靶，而与增强的适应性免疫和共刺激相关的基因被上调。我们的研究强调，LILRB2的拮抗作用抑制AKT激活和IL4信号传导二者，其可干涉Sema6D/PI3Kγ/mTOR信号通路。这表明LILRB2的拮抗作用可对逆转肿瘤相关巨噬细胞的免疫抑制功能具有广泛的影响以增强免疫检查点抑制剂的功效。我们的数据提供强力证据，LILRB2拮抗作用可以是在肿瘤微环境中重编程TAM的有前途的方法，从而增强适应性抗肿瘤免疫。

材料和方法

动物

NSG-SGM3(库存编号013062)和MISTRG小鼠(库存编号017712)购自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)(Bar Harbor，ME)。NCG小鼠(库存编号572)购自查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)(Wilmington，MA)。所有动物实验依照西奈山伊坎医学院和休斯敦卫理公会研究所的动物指南进行。

细胞系

通过由携带相应的Lilr-Fc融合基因的质粒转染、然后用GS/MAS系统选择来产生表达Lilrb1-4和Lilra1的2B4细胞，并维持在含有10％胎牛血清(FBS，AtlanticBiologicals,Atlantic,GA)+100nM青霉素/链霉素(Life Technologies)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Corning Cellgro,Manassas,VA)中。作为原单核细胞系的THP-1细胞被培养在补充有10％FBS、0.1mM非必需氨基酸(Gibco)、1mM丙酮酸钠的RPMI 1640(CorningCellgro,Manassas,VA)中。THP-1和人肺泡腺癌A549细胞系购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection)(Manassas,VA)。LILRB2⁺THP-1细胞通过由全长LILRB2质粒逆转录病毒转染来产生。

抗LILRB2杂交瘤的流式细胞术分析和产生

市售的抗LILRB2抗体、克隆42D1和克隆287219分别购自Biolegend(San Diego,CA)和eBioscience(San Diego,CA)。抗LILRB1(克隆GHI/75)、抗LILRB3(克隆MKT5.1)和抗LILRB4(克隆ZM4.1)抗体购自Biolegend。抗LILRA1(克隆586326)抗体购自NovusBiologicals(Littleton,CO)。人抗CD4-FITC(克隆RPA-T4)、抗CD8-PE(克隆HIT8a)、抗CD16-FITC(克隆CB16)、抗DC-SIGN-PE(克隆eB-h209)、抗CD163-APC(克隆GHI/61)、抗PD-L1-PerCP-Cy5.5(克隆MIH1)、抗CD33-PE-Cy7(克隆WM-53)、抗CD14-APC-Cy7(克隆61D3)、抗CD45-PE(克隆2D1)和抗HLA-DR-FITC(克隆LN3)购自eBioscience或Biolegend。小鼠抗CD11b-PerCP(克隆M1/70)、抗CD8a-eFluor 780(克隆53-6.7)、抗CD4-FOXP3(克隆FJK-16S)、抗CD4-FITC(克隆GK1.5)、抗CD25-PE-Cy7(克隆PC61.5)、抗MHCII-PE-Cy7(克隆M5/114.15.2)、抗Ly6G-APC-Cy7(克隆1A8)和抗CD25-PE-Cy7(克隆PC61.5)购自eBioscience或Biolegend。抗Ly6C-FITC(克隆AL-21)和抗小鼠精氨酸酶1-APC(克隆IC5868F)分别购自BDBiosciences(Franklin Lakes,NJ)和R&DSystems(Minneapolis,MN)。

我们通过用Lilrb2 DNA免疫、然后用LILRB2囊泡或蛋白加强免疫一次来产生抗LILRB2抗体。过度生长的融合杂交瘤克隆体外扩增并且在标记有山羊多克隆抗小鼠IgG二抗(Biolegend)的2B4 LILRB2表达细胞上使用FACS筛选上清液。2B4细胞是来自日本大阪大学微生物疾病研究所(Research Institute for Microbial Diseases)的Hisashi Arase博士的慷慨馈赠的礼物。

对于抗LILRB2抗体的功能性筛选，用2μl的含有抗体的上清液培养PBMC 48小时。在细胞培养的最后4小时添加LPS(50ng/ml，Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和GolgiPlug(BDBiosciences)。根据制造商的说明书(GolgiPlug Kit,BD Biosciences)，对于表面CD86(抗CD86-Alexa Fluor 488，克隆IT2.2，Biolegend)和细胞内TNFα(抗TNFα-PE-Cy7，克隆MAB11，Biolegend)收获细胞。在流式细胞术分析中，通过DAPI(Sigma-Aldrich)染色排除死亡细胞。

用抗体1H3进行体外研究；用抗体5G5进行体内研究。

生物膜层干涉结合检验

在Octet Red系统(Fortebio,Menlo Park,CA,USA)上使用生物膜层干涉法进行LILRB2-His(Sino Biologicals,Wayne,PA)和抗LILRB2抗体之间的实时结合检验。该系统监测反射自纤维光学传感器的表面的光干涉来测定结合至传感器表面的分子的厚度。抗LILRB2抗体(10μg/mL)偶联至动力学分级蛋白质G/小鼠IgG高结合生物传感器(kineticsgrade Protein G/小鼠IgG high binding biosensors)(Fortebio)。涂布有抗LILRB2抗体的传感器被允许以升高浓度的结合至具有0.1％(v/v)Tween-20和10％DMSO的PBS中的LILRB2-His。使用Octet Red软件包计算结合动力学，其确定观察到的结合曲线的最佳适应并计算结合速率常数。通过在具有0.1％Tween-20和10％DMSO的PBS中培养传感器来解离LILRB2-His。确定最佳适应解离曲线，并计算解离速率常数。通过用动力学解离速率常数除以动力学结合速率常数来计算结合亲和性(kD)。

抗体纯化和内毒素试验

在ClonaCell-HY Medium A(StemCell Technologies)中培养克隆杂交瘤细胞、然后改为使用Hybridoma-SFM(ThermoFisher Scientific)的无血清条件。在50mL的Hybridoma SFM中扩展杂交瘤细胞2周或直至耗尽培养基。通过离心(800g，10分钟)收获含抗体的上清液，并使用具有100kDa标称分子量限(nominal molecular weight limit)的Amicon Ultra-15离心过滤器浓缩器浓缩。然后，根据制造商的说明使用Nab Protein A/GSpin Kit(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)纯化浓缩的上清液。使用Zeba^TM旋转脱盐柱7K MWCO(Thermo Fisher Scientific)脱盐纯化的抗体。根据需要，通过离心过滤器(Thermo Fisher Scientific)进一步浓缩纯化的抗体。根据制造商的方案，通过Pierce^TMLAL显色内毒素定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific)确定纯化的抗体中的内毒素水平。

人单核细胞来源的巨噬细胞的产生和分化

来自健康供体的血沉棕黄层购自纽约血液中心(New York Blood Center)。通过使用LymphoPrep(干细胞#07851)分离PBMC。使用CD33⁺磁珠(Miltenyi Biotech,Cat.No.130-045-501)自健康PBMC供体纯化CD33⁺单核细胞并在M-CSF(50ng/ml)(PeproTech：300-25)的存在下用IgG或抗LILRB2(1μg/mL)处理5天。在培养5天后，获得不成熟巨噬细胞用于流式分析或进一步用LPS(50ng/ml)或IL4(25ng/ml)刺激16-24小时。收集上清液并通过ELISA(eBioscience)确定TNFα和IL10生产。

NSG-SGM3免疫缺陷小鼠中的A549移植瘤模型3X 10⁶个A549细胞和来自健康供体的CD33⁺髓系细胞被悬浮在50％Matrigel(Corning,Cat:356231)中并皮下共接种至NSG-SGM3小鼠(杰克逊实验室，No:013062)。各个小鼠在右侧和左侧接受两次皮下A549/CD33⁺植入(第0天)。在第6天和第9天静脉内注射抗RB2抗体和相应的Ig对照(150μg/小鼠)。在第12天测量肿瘤并切除用于分析。如前所述纯化肿瘤浸润淋巴细胞用于M1/M2分化的流式细胞术分析。

HLA-A2+PBMC人源化NCG小鼠中表达荧光素酶的A549(LUC-A549)移植瘤模型

在第0天将人荧光素酶A549癌细胞(LUC-A549，来自GenTarget,Inc.)(2x10⁶个细胞)静脉内注射至NCG免疫缺陷小鼠。纯化人HLA-A2⁺PBMC(1x10⁷个细胞)并在第3天和第13天与抗LILRB2一起静脉内注射至试验小鼠。每三天给予一次抗LILRB2和IgG(200μg/小鼠)，总计8次注射。每周给予一次抗PD-1(Nivolumab)(200μg/小鼠)，总计3次注射。其后，使用IVISSpectrum In Vivo Imaging System和Living Image software(Perkin Elmer,Inc.)对LUC-A549荷瘤小鼠监测荧光素酶活性的生物发光图像。成像前，腹膜内施用250μl的荧光素(以15mg/ml；PerkinElmer,Waltham,MA)。其后，通过异氟烷吸入来麻醉小鼠并成像。在肿瘤接种25天后，通过来自肺的生物发光信号(平均辐射亮度[p/s/cm²/sr])定量肿瘤进展。

细菌人工染色体(BAC)转基因小鼠的产生

用于人Lilrb2和Lilrb3基因二者的BAC克隆分离自人BAC文库(BACPAK资源中心)。通过NucleoBond Xtra Midi EF试剂盒纯化BAC DNA。通过对我们感兴趣的基因(Lilrb2)的PCR来确证BAC DNA的识别、然后显微注射至胚胎干(ES)细胞。通过PCR和流式细胞术确证靶等位基因的生殖系传递。

Lilrb2转基因小鼠中的Lewis肺癌(LLC)肿瘤模型

将Lewis肺癌(LLC)肿瘤细胞(4x10⁵个细胞)皮下注射至LILRB2 B6转基因小鼠。当肿瘤达到2mm x 2mm时开始抗体处理。在肿瘤接种后第4天开始抗LILRB2(200μg/小鼠)处理，总计6次注射。在抗LILRB2的第二次注射时开始抗PD-L1(200μg/小鼠)处理，总计5次注射。在第21天切除肿瘤用于分析。纯化脾细胞和肿瘤浸润淋巴细胞用于对MDSC和Treg群体的流式细胞术分析。

表达GFP的大肠杆菌的离体吞噬作用

通过评价人CD33⁺细胞移植来筛选人源化MISTRG小鼠并在人IgG对照和抗LILRB2组之间平均分配。用抗LILRB2 Ab(150μg/小鼠)腹膜内注射试验小鼠48小时。分离外周血细胞并在37℃下以2×10⁸个大肠杆菌每1×10⁷个外周血细胞的比用表达GFP的大肠杆菌培养4小时。每只小鼠进行重复试验。在培养后，用PBS洗涤细胞并通过对存活的CD45+CD33+CD14+群体设门来分析。

CpG激发实验

MISTRG新生儿接受低剂量的辐射(150拉德(rad))，然后如前所述用来自脐带血(StemCell Technologies,Cat.70008)的5X 10⁴个CD34⁺人干细胞肝内注射(73)。8周后，对小鼠检查外周血中CD45⁺和CD33⁺群体的移植。用IgG对照或抗LILRB2抗体(150μg/小鼠)静脉内注射首次接受试验的人源化MISTRG小鼠2天，然后用5nmol CpG(Cat:ODN1668；Invivogen,San Diego,CA)腹膜内激发。2小时后，收集血清并使用ELISA分析TNFα水平。

免疫印迹法和免疫共沉淀

用1μg/ml IgG或抗LILRB2处理LILRB2转导的THP-1细胞，然后用50ng/ml LPS、20ng/ml IFNγ、或20ng/ml IL4急性刺激5、10、30分钟。使用细胞裂解试剂(Sigma-Aldrich)裂解细胞。将蛋白质样品分散在8％十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶并转移至PVDF膜。在4％脱脂乳溶液中封闭膜，用合适的抗体培养，其后用缀合至辣根过氧化物酶的二抗培养。用于p-STAT1、p-ERK1/2、p-p38、p-NF-κBp65、p-STAT6、SOCS1、SOCS3、p-Akt、SHP-1和p-SHP-1的抗体购自Cell Signaling Technology(Beverly,MA)，用于肌动蛋白的抗体购自Santa Cruz Biotechnology(Dallas,TX)。用ECL系统(Thermo Scientific)可视化免疫反应带。对于免疫沉淀，用IgG或抗LILRB2处理LILRB2⁺THP-1细胞24小时并用0.1mMNa₃VO₄(Sigma-Aldrich)处理最后1小时。使用包括1mM Na₃VO₄ and 25mMα-甘油磷酸的细胞裂解缓冲剂裂解细胞。Dynabeads蛋白G(Life Technologies,Carlsbad,CA)用于拉下(pull-down)。拉下样品经受免疫印迹试验并由抗LILRB2、抗SHP-1、和抗p-SHP-1探测。

人多种淋巴细胞反应(MLR)试验

通过在人GM-CSF(50ng/ml)(PeproTech,Rocky Hill,NJ)的存在下培养分选的CD14⁺单核细胞5天、然后用LPS刺激来产生用作刺激物细胞的成熟树突状细胞。如前所述产生IgG或抗LILRB2处理的成熟巨噬细胞。从不相关的健康供体纯化作为应答物细胞的同种异体T细胞并用成熟树突状细胞和滴定比的巨噬细胞共培养72小时(图17A)。在MLR期间，培养物中不存在抗体。对来自MLR的细胞和上清液通过FACS分析CD4和CD8 T细胞数并通过ELISA分析IFNγ分泌。

转录组分析

对来自三个健康供体的IgG或抗LILRB2处理的单核细胞来源的巨噬细胞进行微阵列分析。将RNA杂交至人HT-12v4表达谱微珠芯片(Expression BeadChip)(Illumina)，Illumina HiScan用于扫描。使用Genome Studio(版本2011.1)Gene Expression Module(版本1.9.0)处理原始强度数据，并使用Bioconductor的lumi R包进一步处理。在从BeadStudio导出前，对数据进行背景信号调整，并进行VST转换和分位数归一化。去除无表达的探针。使用limma R包进行差异基因表达分析，并基于≥1.5的倍数变化和具有Benjamini&Hochberg错误发现率校正的<0.05的p值来识别显著差异表达的基因。使用plots R包产生差异表达基因的热图，并基于欧几里得距离进行无监管阶层式分群法。表达值为z分数归一化的，高和低表达分别示为红色和绿色，中等表达为白色。使用R中的prcomp功能进行主成分分析。用于微阵列数据的登录号为GSE117340。

逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)

对由Tri试剂法(Tri Reagent Method)制备的总RNA进行RT-PCR。2μg的RNA用于使用M-MLV逆转录酶(Promega,Madison,WI)和oligo(dT)18(Thermo Scientific)的cDNA分析。以下示出分别用于各个试验基因的5’和3’引物的序列。IRF3，正向：5’AGGTCCACAGTATTCTCCAGG(SEQ ID NO:366)；反向：5’AGGTCCACAGTATTCTCCAGG(SEQ ID NO:367)；IRF4，正向：5’GCTGATCGACCAGATCGACAG(SEQ ID NO:368)；反向：5’CGGTTGTAGTCCTGCTTGC(SEQ ID NO:369)；IRF5，正向：5’GGGCTTCAATGGGTCAACG(SEQ ID NO:370)；反向：5’GCCTTCGGTGTATTTCCCTG(SEQ ID NO:371)；IRF7，正向：5’CCCAGCAGGTAGCATTCCC(SEQ ID NO:372)；反向：5’GCAGCAGTTCCTCCGTGTAG(SEQ ID NO:373)。

来自人肺癌组织的浸润淋巴细胞的分离

包括NSCLC和间皮瘤的11个新鲜肺癌样品获得自西奈山医疗中心的肺和食管外科研究所(Lung and Esophageal Surgery Institute,Mount Sinai Medical Center)。该研究涉及经西奈山伊坎医学院的机构审查委员会(Institutional Review Board of theIcahn School of Medicine at Mount Sinai)批准的人组织并依据联邦和机构指南进行。在37℃下用胶原酶D 2mg/ml(Sigma-Aldrich)消化肿瘤样品30-45分钟。然后通过40μM细胞滤网过滤组织裂解物并以400xg用PBS流水式冲洗5分钟、两次使肿瘤细胞成为丸粒。通过密度梯度介质Lymphoprep(Stemcell Technologies,Cat:07801)分离肺癌或间皮瘤来源的浸润淋巴细胞(TIL)。在存在或不存在50ng/mL IFNγ(PeproTech)的情况下用50ng/mL MCSF(PeproTech)、LPS(Sigma-Aldrich)和1μg/ml的IgG或抗LILRB2培养100K至200K TIL2天。对细胞和上清液分别进行流式细胞术分析和由ELISA分析TNFα/IL10生产。

统计

全部数据表示为平均值±标准差。使用双尾学生t检验来比较数据。成对t检验用于比较来自不同健康供体或癌症患者的相同处理的结果。所有分析使用Prism和SPSS进行。在p<0.05的值下，数据被认为是统计学上显著的。

研究批准

所有动物处理经西奈山医学院的比较医学和外科中心(Center for ComparativeMedicine and Surgery of Mount Sinai School of Medicine)的IACUC和休斯敦卫理工会研究所的比较医学(Comparative Medicine of Houston Methodist ResearchInstitute)的IACUC批准。

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abc

实施例10：抗LILRB2抗体体外调节IFNγ释放并体外抑制同种异体T细胞增殖

图23A-23C是显示在来自健康供体的PBMC的刺激后，OKT3介导的T细胞增殖的图。用LILRB2抗体过夜(16小时)培养PBMC并用低剂量(0.01μg/ml)抗CD3(OKT3)刺激3天。在3天的处理后，在培养的最后8小时添加[³H]-胸苷，然后在闪烁计数器上进行测量。示出基于来自图1A的TNFα的克隆排序。图23A示出T细胞增殖(CPM)中的相对倍数变化。图23B示出T细胞增殖。图23C示出来自图23B的T细胞增殖的总体差异。

图23D-23F是示出来自获得自健康供体的PBMC的IFN-γ生产的图。用LILRB2抗体过夜(16小时)培养PBMC并用低剂量(0.01μg/ml)抗CD3(OKT3)刺激3天。收集上清液并通过ELISA测定IFN-γ生产。示出基于来自图1A的TNFα的克隆排序。图23D示出IFN-γ生产中的相对倍数变化。图23E示出IL-10的分泌。图23F示出来自图23E的IL-10浓度的总体差异。

试验激动性抗体与LILRB家族交叉反应的能力。如图23G中所示，各个试验的抗LILRB2激动剂抗体与LILRA1家族交叉反应。

图23G示出在用抗LILRB2激动剂抗体处理下，T细胞IFN-γ生产的抑制。

图23I示出由抗LILRB2激动剂抗体的MLR反应的抑制。

实施例11：抗LILRB2 CAR T细胞

使用1H3 Fab区产生LILRB2 CAR。

图24示出当由例如THP-1等LILRB2+白血病细胞刺激时，抗LILRB2CAR-T细胞表明特定激活和细胞因子释放。使用抗LILRB2-CAR-T短型载体(图24，上部)，抗LILRB2 CAR-T细胞表现对靶LILRB2蛋白的激活特异性。以范围为1:1至1:10的靶:效应物(T:E)比、将抗LILRB2 CAR-T细胞与表达LILRB2的THP1细胞或亲代THP1细胞共培养24小时。通过使用流式细胞术检测41BB表达来确定CAR-T细胞激活。未转导的T细胞用作对照。图24，下部：抗LILRB2 CAR-T细胞表现对靶LILRB2蛋白的特异性细胞因子释放。在以范围为1:1至1:10的靶:效应物(T:E)比、将抗LILRB2 CAR-T细胞与表达LILRB2的THP1细胞或亲代THP1细胞共培养24小时后，收集上清液。通过ELISA对细胞因子释放评价干扰素γ(IFNγ)。未转导的T细胞用作对照。

图25示出当由LILRB2+白血病细胞刺激时，抗LILRB2 CAR-T细胞表明特定激活和细胞因子释放。使用抗LILRB2-CAR-T长型载体(图25，上部)，抗LILRB2 CAR-T细胞表现对靶LILRB2蛋白的激活特异性。以范围为1:1至1:10的靶:效应物(T:E)比将抗LILRB2 CAR-T细胞与表达LILRB2的THP1细胞或亲代THP1细胞共培养24小时。通过使用流式细胞术检测41BB表达来确定CAR-T细胞激活。未转导的T细胞用作对照。图25，下部示出抗LILRB2 CAR-T细胞表现对靶LILRB2蛋白的特异性细胞因子释放。在以范围为1:1至1:10的靶:效应物(T:E)比将抗LILRB2 CAR-T细胞与表达LILRB2的THP1细胞或亲代THP1细胞共培养24小时后，收集上清液。通过ELISA对细胞因子释放评价干扰素γ(IFNγ)。未转导的T细胞用作对照。

图26示出抗LILRB2 CAR-T细胞表明对靶LILRB2的特异性结合。将短型(图26，上部)和长型(图26，下部)的抗LILRB2 CAR-T细胞与表达LILRB2的THP1细胞、LILRB3表达THP1细胞、或亲代THP1细胞共培养24小时。通过使用流式细胞术检测41BB表达来确定CAR-T细胞激活。未转导的T细胞用作对照。

图27示出抗LILRB2 CAR-T细胞表明对HT29结肠癌细胞中靶LILRB2的特异性结合。将抗LILRB2 CAR-T细胞与LILRB2-、LILRB3表达HT29细胞、或HT29对照细胞共培养24小时。通过使用流式细胞术检测41BB表达上的激活标记物来确定CAR-T细胞激活。由OKT3刺激的CAR-T细胞用作CAR-T细胞激活的阳性对照。未转导的T细胞用作对照。

图28示出抗LILRB2 CAR-T细胞表现针对表达LILRB2的白血病细胞的体外有效细胞毒性。以范围为0.02:1至10:1的效应物:靶、将表达LILRB2的白血病细胞(B2-THP1)与抗LILRB2 CAR-T(左条)或未转导的T细胞(右条)共培养。在7小时的共培养后收集上清液，并通过检测LDH释放来确定细胞毒性。

图29示出用于说明THP1-LILRB2异种移植小鼠模型中抗LILRB2 CAR-T细胞的功效的实验设计。在第0天用表达LILRB2的THP1细胞注射NSG-SGM3小鼠，并在第8、15、22和30天用未转导T细胞(对照)或抗LILRB2 CAR-T细胞处理。每周拍摄生物发光图像。

图30-33示出抗LILRB2 CAR-T细胞降低THP1-LILRB2异种移植小鼠模型中白血病负担。在第0天用表达LILRB2的THP1细胞注射NSG-SGM3小鼠，并在第8、15、22和30天用未转导T细胞(对照)或抗LILRB2 CAR-T细胞处理。每周拍摄生物发光图像(BLI)。图30显示用未转导T细胞(左)或抗LILRB2-CAR-T细胞(右)处理的小鼠的每周BLI；从小鼠背部拍摄图像。图31示出用未转导T细胞(左)或抗LILRB2-CAR-T细胞(右)处理的小鼠的每周BLI；从腹部拍摄图像。

图32示出总通量(p/s)作为时间的函数的图；各个形状表示处理组中单个小鼠。图32表明抗LILRB2 CAR-T细胞(右)与对照T细胞处理的(左)小鼠相比，降低白血病负担。

图33示出总通量(左部)和平均辐射亮度(右部)中白血病负担的定量结果。由抗LILRB2 CAR-T细胞处理的小鼠(正方形)与未转导T细胞处理的小鼠(圆形)相比，显示肿瘤负担的降低。

实施例12：抗LILRB4 CAR-T细胞

产生抗LILRB4 CAR-T细胞。图34示出抗LILRB4 CAR-T细胞表明针对LILRB4蛋白表达人AML细胞的细胞毒性。

实施例13：抗LILRB2 Ab废除CAR-T细胞的MDSC介导的抑制

考虑到抗LILRB2对巨噬细胞成熟的强功能性活性，我们调查了抗LILRB2(具有人IgG4的抗体20D3)是否可以废除CAR-T细胞增殖的MDSC介导的抑制。我们产生了体外培养的单核细胞来源的MDSC，并在靶肿瘤细胞的存在下与CAR-T细胞共培养。MDCS显著抑制由靶肿瘤细胞、即AML(THP-1)(图35A)或Her-2阳性头和颈实体癌(SCC-47)(图35B)诱导的CAR-T细胞增殖。应注意，抗LILRB2抗体废除MDSC介导的抑制，复兴CD4和CD8 T细胞增殖(图35B)并增强对肿瘤细胞以及LILRB2阳性的MDSC的CAR-T细胞介导的杀伤作用(图35A)。结果表明抗LILRB2可克服MDSC介导的抑制并增强CAR-T细胞增殖。

其它实施方案

应当理解的是，虽然已经结合本发明的详细说明对本发明进行了描述，但前述描述旨在说明但不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围定义。其他方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。