具体实施方式

本发明涉及一种用于治疗个体中的三阴性乳腺癌(TNBC)，和/或在患有表达HER2/neu的TNBC的个体中诱导针对HER2/neu的免疫应答的方法，所述方法包括向个体给予：(a)有效量的曲妥珠单抗或其衍生物；和(b)有效量的nelipepimut-S或其变体。在一些实施方案中，间隔给予曲妥珠单抗或其衍生物以及nelipepimut-S或其变体，并且在曲妥珠单抗或其衍生物的给药开始后，再开始nelipepimut-S或其变体的给药。例如，所述方法包括开始准备阶段，其包括将一定剂量的曲妥珠单抗或其衍生物进行定期给药，而没有nelipepimut-S或变体；随后是联合阶段，其包括将一定剂量的曲妥珠单抗或其衍生物和nelipepimut-S或变体进行定期给药。在一些实施方案中，在完成曲妥珠单抗或衍生物的第三、第四或第五次给药后，开始进行nelipepimut-S或变体的给药。在一些实施方案中，以8mg/kg的初始负荷剂量和每3周(q3wk)6mg/kg的维持剂量给予曲妥珠单抗或其衍生物，并且其中给予剂量为1,000mcg的nelipepimut-S或变体。

在一些实施方案中，准备阶段包括进行曲妥珠单抗或其衍生物给药的频率和持续时间(在用nelipepimut-S接种之前)，其在主要组织相容性复合体(MHC)I型的情况下，足以增加各种HER2蛋白肽片段(包括具有与nelipepimut-S或其变体相同的氨基酸序列的肽，即疫苗的抗原靶点)在乳腺癌细胞膜(与人白细胞抗原[HLA]分子结合)上对宿主(患者)免疫系统的呈递。一旦这种曲妥珠单抗诱导的或衍生物诱导的HER2抗原呈递在患者的乳腺癌细胞上显著增加，随后的nelipepimut-S或其变体的给药(通过患者中抗原呈递细胞的激活和免疫突触上天然CD8+ T淋巴细胞的参与)导致在患者乳腺癌细胞上针对该抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的诱导、激活和增殖。这导致免疫介导的杀死患者中表达HER2的乳腺癌细胞。因此，通过使用具有这两种药物的给药顺序或时间表(首先给予曲妥珠单抗或其衍生物，随后是nelipepimut-S或其变体)的准备阶段，可以确保这两种药物为最佳协同作用，即，其中曲妥珠单抗或衍生物的预处理促进抗原性和免疫原性，从而作为nelipepimut-S或其变体在个体中的免疫介导作用的药效增强剂起作用。

图2所示的和本文材料与方法以及实施例中记载的研究设计中的联合治疗组(其联合使用NeuVax^TM疫苗(NPS+GM-CSF)和曲妥珠单抗(TZ))，代表用于治疗三阴性乳腺癌和/或在患有三阴性乳腺癌的个体中诱导针对HER2/neu的免疫应答的本发明的方法的一个实施方案。可以测定其他剂量、剂量频率和治疗的持续时间。例如，本质上为混合淋巴细胞反应(MLR)的离体测定可用于测定曲妥珠单抗或其衍生物(足够给定患者或一组患者的启动阶段)的其他剂量、频率和持续时间。包含抗原特异性T淋巴细胞的外周血单个核细胞(PBMC)可以在存在不同浓度曲妥珠单抗的孵育培养基中，与表达HER2的乳腺癌细胞系共同孵育。实验中使用的体外曲妥珠单抗剂量与通过活化的CTL裂解乳腺癌细胞之间存在剂量关系。这些测定的体外方法在Gall VA等人,Cancer Res.,2017 Oct 1；77(19):5374-5383的“方法”部分，以及Mittendorf EA,等人,Ann Surg Oncol.,2006 Aug；13(8):1085-98中记载，其全部内容通过引用的方式并入本文。这些测试假设PBMC来自已接种的患者，其在仅进行NeuVax疫苗治疗(即单药疗法)的患者的临床试验中已接受约3或4次初始接种，其与早期免疫阶段(对应于疫苗接种后6至8周)相当。

以下简要描述离体MLR的要素：

(1)HER2低表达的乳腺癌细胞系(包括TNBC表型乳腺癌细胞系)；

(2)细胞培养基中曲妥珠单抗或其衍生物的溶液(不同浓度的曲妥珠单抗)；和

(3)PBMC(本质上为来自接种NPS或变体的患者的T淋巴细胞)。

将不同体外浓度/剂量的(1)+(2)共同孵育。然后，以T淋巴细胞的不同丰度水平添加(3)。这将对应于/模拟曲妥珠单抗或其衍生物，随后为NPS或其变体的临床给药顺序。

另一种选择为进行：(1)+(3)，随后(2)。这将对应于/模拟NPS或其变体，随后为曲妥珠单抗或其衍生物的临床给药顺序。

另一种选择为进行：同时(1)+(2)+(3)，然后(2)。这将对应于/模拟NPS或其变体和曲妥珠单抗或其衍生物的同时共同给药。

在本发明的方法的一些实施方案中，TNBC具有IHC1+或2+的HER2表达。

在本发明的方法的一些实施方案中，个体为HLA-A2阳性、HLA-A3阳性、HLA-A24阳性或HLA-A26阳性。

在本发明的方法的一些实施方案中，个体为HLA-A24阳性。如实施例2中所述，尽管E75和该HLA型之间的预测结合潜力最低，但HLA-A24+TNBC患者在无病生存率方面具有显著改善。实际上，对于TNBC队列和ITT人群(不论激素受体状态，后者均为HER2 IHC 1+/2+)，NPS加曲妥珠单抗联合用药所见过的最强临床效果是在HLA-A24+患者中。在生活在亚洲/太平洋盆地地区的人群中，HLA-A24为表达最严重的HLA型。

在本发明的方法的一些实施方案中，个体在接受针对TNBC的治疗(例如护理治疗标准(例如，手术、化学疗法、放射治疗或上述两种或多种的组合))后，在所述给药时为临床上无疾病(癌症)的。在一些实施方案中，在完成护理治疗标准后三周至十二周之间开始曲妥珠单抗或其衍生物的给药。TNBC可以为结节阳性或结节阴性。在一些实施例中，在所述给药时，TNBC为结节阴性(例如，AJCC N0或N0(i+))。

在其他实施方案中，在所述给药时，所述个体并非无癌症。

在一些实施方案中，给予曲妥珠单抗。在一些实施方案中，给予曲妥珠单抗的衍生物。可以通过任何有效方法将曲妥珠单抗或其衍生物给予至个体。在一些实施方案中，静脉内给予曲妥珠单抗或其衍生物。

可以通过任何有效方法和途径将nelipepimut-S或其变体给予至个体。可以以肽的形式或以编码该肽的核酸以用于随后表达(例如在抗原呈递细胞(APC)中)的形式给予nelipepimut-S或其变体。如果给予编码nelipepimut-S或其变体的核酸，所述核酸可以以裸DNA或RNA的形式给予，或以病毒或非病毒载体的形式给予。在一些实施方案中，将nelipepimut-S或其变体(肽或核酸)皮内给予至个体。

可以通过多种方法实现编码NPS或其变体的遗传序列的导入。所述方法可以包括向个体给予包含编码NPS或其变体的核苷酸序列的载体(Tindle,R.W.等人,Virology,1994,200:54)。在另一个实施方案中，所述方法包括向受试者给予编码NPS或其变体的裸核酸(DNA或RNA)，或在另一个实施方案中，给予该类肽的两种或多种肽(Nabel等人,PNAS-USA,1990,90:11307)。在另一个实施方案中，使用基于多表位、类似物的癌症疫苗。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

核酸(DNA或RNA)可以通过本领域已知的任何方式给予至个体，包括皮内、肠胃外或静脉内给药，或者在另一个实施方案中，通过基因枪施用。在另一个实施方案中，以组合物给予核酸，这在其他实施方案中对应于本文列出的任何实施方案。DNA或RNA可作为裸核酸给予至个体或由载体携带。

在另一个实施方案中，根据本发明的方法使用的载体可以包括在个体体内促进或允许肽(例如，NPS肽或其变体)的表达的任何载体。术语“载体”用于指可用于将编码序列信息(例如，编码NPS肽或其变体的核酸序列)转移至细胞或个体的任何分子(例如，核酸、质粒、病毒、颗粒)。用于几种癌症的核酸疫苗已经进入临床试验(Wahren B等人,“DNAVaccines:Recent Developments and the Future,”Vaccines,2014,2:785-796；FiorettiD.等人,“DNA Vaccines:Developing New Strategies Against Cancer,Journal ofBiomedicine and Biotechnology,2010,2010(938):174378)。

在一个实施方案中，载体为病毒载体。在另一个实施方案中，载体为非病毒载体。在一个实施方案中，所述非病毒载体为核酸载体，例如质粒DNA或mRNA载体(参见，例如，Weide B.等人，“Plasmid DNA-and messenger RNA-based Anti-Cancer Vaccination,”Immunol Lett,2008,115(1):33-42)；Kim H.等人,“Self-Assembled Messenger RNANanoparticles(mRNA-NPs)for Efficient Gene Expression,”Sci Rep,2015,5:12737)；Ulmer J.B.等人,“RNA-based Vaccines”,Vaccine,2012,30:4414-4418)。在另一个实施方案中，“载体”包括减毒的病毒(例如牛痘或禽痘，例如在美国专利No.4,722,848中记载的，其通过引用并入本文)。在另一个实施方案中，载体为BCG(Bacille Calmette Guerin)，例如在Stover等人,Nature,1991,351:456-460中记载的。

根据本文的描述，对于NPS肽或变体肽的治疗性给药或免疫有用的其他载体(例如伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)载体等)，对于本领域技术人员将是显然的。可用于向受试者体内和体外细胞施用核酸分子的载体的非限制性实例包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒(例如莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV))、慢病毒、痘病毒(例如，牛痘病毒、改良的牛痘安卡拉(MVA)、疱疹病毒(例如巨细胞病毒)、仙台病毒、病毒样颗粒(VLP)、质粒、阳离子脂质、脂质体和纳米颗粒。

“编码序列”为转录成mRNA和/或翻译成多肽的核酸序列。编码序列的边界由在5'-末端的翻译起始密码子和在3'-末端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于mRNA、cDNA和重组多核苷酸序列。变体或类似物可通过删除编码序列的一部分、通过插入序列和/或通过在序列内取代一个或多个核苷酸来制备。修饰核酸序列的技术(例如定点诱变)为本领域技术人员所熟知(参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第二版,1989；DNA Cloning,第I和II卷,D.N.Glover编辑,1985)。任选地，利用这些多核苷酸的本发明的核酸序列以及本发明的组合物和方法可以包括非编码序列。

本文所用术语“可操作地连接”指侧翼控制序列(flanking control sequence)的排列，其中配置或组装如此描述的侧翼序列以使其行使其通常的功能。因此，可操作地连接至编码序列的侧翼控制序列可以能够在与控制序列相容的条件下实现编码序列的复制、转录和/或翻译。例如，当启动子能够指导该编码序列的转录时，该编码序列可操作地连接至该启动子。侧翼序列不需要与编码序列邻接，只要它能正确起作用。因此，例如，在启动子序列和编码序列之间可以存在介入的未翻译但被转录的序列，并且仍然可以认为该启动子序列与该编码序列“可操作地连接”。编码肽(例如，NPS肽或变体NPS肽)的每个核酸序列通常将具有其自己的可操作地连接的启动子序列。

在另一个实施方案中，如本文所述，载体还编码免疫调节化合物。在另一个实施方案中，在将编码NPS肽或变体肽的载体给药至个体的同时、之前或之后，向个体给予编码该免疫调节化合物的其他载体。

任选地，可以以融合多肽的形式给予nelipepimut-S或其变体，其中将nelipepimut-S或变异体直接或间接地融合至另一个nelipepimut-S或变体氨基酸序列，或不同肽的氨基酸序列。任选地，可以以包含编码多个拷贝的nelipepimut-S或变体氨基酸序列(作为多聚体)的核酸的基因构建体的形式给予编码nelipepimut-S或其变体的核酸。任选地，基因构建体可以包括编码其他肽的其他核酸。

优选地，所述治疗包括给药以免疫佐剂(例如GM-CSF)，其可以与nelipepimut-S或其变体在同一或分开的制剂中一起给予。佐剂可以通过任何有效方法给予至个体。在一些实施方案中，皮内给予佐剂。

可以与免疫佐剂或佐剂的组合一起给予NPS或其变体。包含NPS或其变体的免疫原或组合物在本文中可以称为疫苗、肽疫苗等。

佐剂可以为任何种类，例如明矾盐和其他矿物佐剂、细菌产物或细菌衍生的佐剂、张力活性剂(例如皂苷)、水包油(o/w)和油包水(w/o)乳剂、脂质体佐剂，细胞因子(例如，IL-2、GM-CSF、IL-12和IFN-γ)以及α-半乳糖神经酰胺类似物。佐剂的非限制性实例包括Montanide乳液、QS21、弗氏完全或不完全佐剂、磷酸铝、氢氧化铝、卡介苗芽孢杆菌(BCG)和明矾。在一个实施方案中，佐剂为增强针对NPS或其变体的免疫系统的CTL应答的试剂。可以在与NPS或其变体同一组合物中，或在与一种或多种曲妥珠单抗或其衍生物同一组合物中，或在与NPS或其变体以及曲妥珠单抗或其衍生物同一组合物中，或在与NPS或其变体以及曲妥珠单抗或其衍生物分开的组合物中给予佐剂。

在一些实施方案中，佐剂为GM-CSF，并且每天给予剂量为250mcg的GM-CSF。佐剂可以间隔给药，例如每三周(q3wk)。在一些实施方案中，每三周，在完成输注曲妥珠单抗或其衍生物后30-120分钟，皮内给予1,000mcg的nelipepimut-S或其变体和250mcg的GM-CSF。

Nelipepimut-S(NPS)包含由氨基酸序列KIFGSLAFL(SEQ ID NO:1)组成的HER2/neu肽，并在结合至抗原呈递细胞(APC)上的特定HLA分子后刺激特定的CD8+CTL。可以给予NPS和/或NPS的变体至个体。NPS变体具有一个或多个氨基酸取代基。可以用天然存在的氨基酸或经修饰的氨基酸取代NPS的氨基酸。NPS变体肽及其制备在美国专利No.8,802,618中记载，其全部内容通过引用的方式并入本文。在一些实施方案中，NPS变体在SEQ ID No:1的第4位具有α-氨基丁酸、正缬氨酸或正亮氨酸；在SEQ ID NO:1的第7位具有α-氨基丁酸、正缬氨酸或正亮氨酸；或在SEQ ID NO:1的第8位具有异苯丙氨酸。在一些实施方案中，NPS变体选自：K I F Abu S L A F L(SEQ ID NO:2)；K I F Nva S L A F L(SEQ ID NO:3)；K IF Nle S L A F L(SEQ ID NO:4)；K I F G S L Abu F L(SEQ ID NO:5)；K I F G S L NvaF L(SEQ ID NO:6)；K I F G S L Nle F L(SEQ ID NO:7)；和K I F G S L A isoF L(SEQID NO:8)。可以通过本领域已知的方法制备NPS和NPS变体。因此，所述肽可以为合成的、重组产生的或从已知来源纯化的。

曲妥珠单抗为重组IgG1κ，人源化单克隆抗体，其与人表皮生长因子受体蛋白(HER2)的胞外结构域以高亲和力选择性结合。曲妥珠单抗记载于美国专利No.5,821,337中，其全部内容通过引用的方式并入本文。曲妥珠单抗的轻链和重链的氨基酸序列在SEQID NO:9和SEQ ID NO:10中列出。

曲妥珠单抗的轻链的氨基酸序列：

曲妥珠单抗的重链的氨基酸序列：

在本文方法和组合物的多种实施方案的一些实施方案中，给予曲妥珠单抗-anns(Kanjinti^TM，Amgen和Allergan)、曲妥珠单抗-qyyp(Trazimera^TM，Pfizer)、曲妥珠单抗-dttb(Ontruzant^TM，Samsung Bioepis)、曲妥珠单抗-pkrb((Herzuma^TM，Celltrion)、曲妥珠单抗-dkst(Ogivri^TM，Mylan GmbH)或前述任何一种的衍生物。

任选地，在本文方法和组合物的多种实施方案中，可以使用曲妥珠单抗衍生物替换曲妥珠单抗。曲妥珠单抗的衍生物(如果使用)保留对HER2的胞外结构域的结合特异性。优选地，曲妥珠单抗在基于细胞的测定中以高亲和力选择性结合HER2(例如，Kd≤5nM)。

曲妥珠单抗衍生物的实例包括但不限于在Selis F.等人,Int J Mol Sci.,2016Apr；17(4):491(其全部内容通过引用的方式并入本文)的表1和2中列出的那些(例如，TrastFab、TrastF(ab’)2、TrastFab’、TrastFab’-Cys-PEG(2×10kDa)、TrastFab’-Cys-PEG(2×20kDa)和TrastFab-(N-Term)-PEG20 kDa)。曲妥珠单抗或曲妥珠单抗衍生物可以为修饰或未修饰的，并且可以为缀合或未缀合的。

使用本领域已知的标准技术可以产生肽(如NPS)或抗体(例如曲妥珠单抗)的片段和变体，并可以测试对其靶点的免疫原性活性或亲和力的存在。在本发明的范围内考虑的多核苷酸、肽、嵌合和缀合的多肽还可以根据具有与本文具体举例说明的本发明的那些序列更具体的同一性和/或相似性的范围来定义。序列同一性通常将大于60％，优选大于75％，更优选大于80％，甚至更优选大于90％，并且可以大于95％。与本文举例说明的序列相比，序列的同一性和/或相似性可以为49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。除非另有说明，本文所用的两个序列的序列同一性和/或相似性百分比可使用Karlin和Altschul(1990)算法(Karlin,S.和Altschul,S.F.(1990)“Methods for Assessing theStatistical Significance of Molecular Sequence Features by Using GeneralScoring Schemes,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268)来确定，可以如Karlin和Altschul(1993)(Karlin,S.和Altschul,S.F.(1993)“Applications and Statistics forMultiple High-Scoring Segments in Molecular Sequences,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877)来进行修正。这种算法并入Altschul等人(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。可以使用NBLAST程序(分数＝100，字长＝12)进行BLAST搜索，以获得具有所需序列同一性百分比的序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul等人(1997)所述使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各自程序(NBLAST和XBLAST)的默认参数。参见全球网站：ncbi.nlm.nih.gov。

在一些实施方案中，曲妥珠单抗衍生物包含轻链和重链，其分别与SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

曲妥珠单抗的衍生物可以为完整抗体或其抗原结合片段，例如单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、微型抗体、双功能抗体、单链抗体(scFv)、可变区片段(Fv或Fd)、Fab或F(ab)2。在一些实施方案中，曲妥珠单抗的衍生物为恩美-(ado-)曲妥单抗emtansine(参见WO/2001/000244，其全部内容通过引用的方式并入本文)。

优选地，使用NPS和/或NPS变体的加强剂量。在一些实施方案中，进行NPS或其变体的给药代表初次接种阶段，并且其中所述方法还包括在完成初次接种后，以比初次接种更低的频率，任选地与免疫佐剂(例如，GM-CSF)一起，给予1、2、3、4或更多次加强剂量的NPS或其变体最高达30个月或更长的时间。

在一些实施方案中，给予两次或更多次加强剂量的NPS或其变体，并且其中每6个月给予一次加强剂量。每个加强剂量可以是与以初次剂量递送的NPS和/或NPS变体相同量的NPS和/或NPS变体，或者可以是不同的量(更多或更少)。

可以在进行曲妥珠单抗和nelipepimut-S或其变体的给药之前、期间或之后向个体给予一种或多种其他治疗剂。其他治疗剂可以包括抗癌剂(例如免疫治疗剂)、靶向剂或化学治疗剂。在一些实施方案中，给予免疫检查点抑制剂。

可以通过适合所用试剂的功能的任何途径给予另外的治疗剂，例如静脉内、肌肉内、皮下、局部、口服、经皮、皮内、腹膜内、眶内(intraorbitally)、植入、吸入、鞘内、心室内或鼻内。

在本发明的多种方法的一些实施方案中，给予至个体的另外的治疗为免疫疗法。如本文所用，术语“免疫疗法”指通过刺激、诱导、破坏(subversion)、模拟、增强、扩大或对受试者的免疫系统的任何其他调节以引发或增强针对癌性或其他有害蛋白质、细胞或组织的适应性或先天性免疫(主动或被动)来治疗疾病。无论是设计用于治疗现有的癌症还是预防癌症的发展或用于辅助治疗以减少癌症复发的可能性，免疫疗法(即免疫治疗剂)包括癌症疫苗、免疫调节剂、检查点抑制剂、肿瘤微环境调节剂、单克隆抗体(例如人源化单克隆抗体)——包括双特异性抗体、免疫刺激剂、树突状细胞和病毒疗法。

所述另外的治疗剂可以为免疫治疗，即免疫治疗剂。例如，免疫治疗可以为检查点抑制剂(还称为免疫检查点抑制剂)，其为阻断或抑制免疫检查点蛋白(即，阻断或抑制检查点受体或检查点受体配体)的化合物或试剂。可以使用的作为检查点抑制剂的化合物或试剂，或能够调节检查点抑制剂的活性的化合物或试剂的非限制性实例包括小分子、肽和抗体。抗体的非限制性实例包括尼沃单抗(nivolumab)(OPDIVO)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)(KEYTRUDA)、匹利珠单抗(pidilizumab)(CT-011)、MEDI0680(AMP-514)、AMP-224、AUNP-12、BMS 936559，阿替利珠单抗(atezolizumab)(MPDL3280A)、度伐利尤单抗(durvalumab)(MEDI4736)、阿维单抗(avelumab)(MSB0010718C)、BMS935559(MDX-1105)、rHIgM12B7、BMS-986016、GSK2831781、IMP321、lirilumab(BMS-986015)、IPH2101(1-7F9)、PF-05082566、乌洛单抗(Urelumab)(BMS-663513)和MEDI6469，而小分子的非限制性实例包括吲哚莫德(Indoximod)(NLG 9189)、NLG 919和艾卡哚司他(epacadostat)(INCB024360)。

可以作为调节靶点的检查点蛋白的实例包括但不限于CTLA-4、PD-L1、PD-L2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、IDO、KIR、2B4(属于CD2分子家族且在所有NK细胞和记忆CD8+ T细胞上表达)、CD160(还称为BY55)、CGEN-15049、CHK 1激酶和CHK2激酶、A2aR和多种B-7家族配体。阴性免疫调节人细胞表面受体程序性死亡-1(PD-1)为参与T细胞活化的调节的分子的免疫球蛋白超家族(IGSF)的成员。当在1992年被确认为在经历细胞死亡的T细胞杂交瘤中上调的基因时，PD-1获得其“程序性死亡”的名称。PD-1的结构由一个IGSF结构域、一个跨膜结构域和一个包含基于免疫受体酪氨酸的抑制性模体(ITIM)和基于免疫受体酪氨酸的开关模体(ITSM)的胞内结构域组成。PD-1具有两个结合配体(binding partner)：PD-L1(B7-H1、CD274)和PD-L2(B7-DC、CD273)。PD-L1在造血和非造血谱系中广泛表达。它见于T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、DC和肥大细胞以及周围组织中。PD-1参与代表肿瘤逃避免疫监视和清除的一种方法。尼沃单抗证明了PD-1途径的阻断。

所述另外的治疗剂可以为化学治疗剂，例如卡培他滨(capecitabine)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、环磷酰胺、多西他赛(docetaxel)、阿霉素(doxorubicin)(脂质体或非脂质体)、表柔比星(epirubicin)、艾瑞布林(eribulion)、5-氟尿嘧啶(5FU)、吉西他滨(gemcitabine)、ixabepiline、甲氨蝶呤、紫杉醇(白蛋白结合型或非白蛋白结合型)和长春瑞滨(vinorelbine)中的一种或多种。可以联合给予化学治疗剂，例如阿霉素和环磷酰胺；或阿霉素和环磷酰胺，随后为紫杉醇或多西他赛；或多西他赛、阿霉素和环磷酰胺；或环磷酰胺和多西他赛；或环磷酰胺、甲氨喋呤和5-FU(CMF)；或5-FU、阿霉素和环磷酰胺(FAC)；或5-FU、表柔比星和环磷酰胺(FEC)；多西他赛、卡铂和曲妥珠单抗；或多西他赛、卡铂、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗(pertuzumab)；或紫杉醇和曲妥珠单抗；或紫杉醇、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。

在一些实施方案中，通过静脉内、肌肉内、皮下、局部、口服、经皮、皮内、腹膜内、眶内、植入、吸入、鞘内、心室内或鼻内给予nelipepimut-S或其变体、曲妥珠单抗或其衍生物、免疫佐剂(如果使用)和另外的治疗剂(如果使用)。

在一些实施方案中，静脉内给予曲妥珠单抗或其衍生物，并且皮内给予nelipepimut-S或其变体。在一些实施方案中，皮内给予NPS或其变体和免疫佐剂，静脉内给予曲妥珠单抗或其衍生物。

在一些实施方案中，个体患有TNBC并且——在接受TNBC的治疗(例如护理治疗标准)后——在TZ或其衍生物以及NPS或其变体的给药时是临床无疾病的，并且本发明的方法延迟或防止了个体中TNBC的复发。

本发明的方法可以减小肿瘤尺寸和/或提高个体的无病生存率(无复发生存率)。在一些实施方案中，曲妥珠单抗和nelipepimut-S或其变体对个体具有协同作用。

本发明的其他方面涉及可用于治疗TNBC和/或在患有表达低水平HER2/neu的TNBC的个体中诱导对HER2/neu的免疫应答的药物和试剂盒，例如在本发明的方法中。本发明的一方面涉及一种包含nelipepimut-S或其变体的药物，其用于与曲妥珠单抗组合用于治疗个体中的三阴性乳腺癌。所述药物还可以包括免疫佐剂，例如GM-CSF。

本发明的另一方面涉及包含曲妥珠单抗的药物，其与nelipepimut-S或其变体组合使用，用于治疗个体中的三阴性乳腺癌。

本发明的另一方面为一种包含第一容器、第二容器和药品说明书的试剂盒，其中所述第一容器包含至少一个剂量的包含曲妥珠单抗的药物，所述第二容器包含至少一个剂量的包含nelipepimut-S或其变体的药物，药品说明书包含使用药物治疗个体的三阴性乳腺癌的说明。所述试剂盒可以还包括免疫佐剂，例如GM-CSF。免疫佐剂可以与nelipepimut-S或其变体一起容纳在容器中，或在单独的容器中。试剂盒可包含其他治疗剂(即除曲妥珠单抗或曲妥珠单抗衍生物以及NPS或NPS变体以外)。

所述试剂盒优选包括包装材料。如本文所用，术语“包装材料”指容纳试剂盒的组分的物理结构。包装材料可以将组分保持在无菌状态，并且可以由通常用于这种目的的材料(例如，纸、波纹纤维(corrugated fiber)、玻璃、塑料、箔、安瓿等)制成。标签或药品说明书可包括适当的印刷和/或数字化说明，例如，用于实施本发明的方法，例如，治疗三阴性乳腺癌(TNBC)。因此，在其他实施方案中，试剂盒包括标签或药品说明书，其包括用于在溶液中实施本发明的方法的说明。

因此，说明可以包括用于实施本文描述的本发明的任何方法的说明。例如，药物组合物可以与用于向受试者给药以治疗TNBC(例如，表达低水平的HER2/neu的TNBC)的说明书一起被包括在容器、包装或分配器中。说明可以另外包括令人满意的临床终点或可能出现的任何不良症状的指示、存储信息、失效期或监管机构(例如食品和药品监督管理局或欧洲药品管理局)要求在个人中使用的任何信息。

所述说明可以为数字化的或在“印刷品”上，例如，在试剂盒内的纸或纸板上、在贴于试剂盒或包装材料的标签上，或附于包含试剂盒组分的小瓶或管上。说明可以包括语音或录像带，且还可以包含于计算机可读媒介(例如磁盘(软盘或硬盘))、光学CD(例如CD-或DVD-ROM/RAM)、磁带、电存储介质(例如RAM和ROM)以及这些的混合体(例如磁/光存储介质)。

试剂盒可以另外包括缓冲剂、防腐剂或用于稳定本发明方法中使用的至少一种化合物的试剂。试剂盒的每个组分可以封装在单独的容器中或混合在一起，并且所有不同的容器可以在单个或多个包装中。

试剂盒可以包括包装材料，其被分隔开以容纳一个或多个容器，例如小瓶、管等，每个容器包括在本文所述的方法中使用的单独元件之一。用于包装药品的包装材料例如仅包括美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装(blister pack)、瓶、管、泵、袋、小瓶(vial)、不透光的密封容器、注射器、瓶以及合适所选制剂和预期给药和治疗方式的任何包装材料。

试剂盒可以包括一个或多个另外的容器，每个容器具有一种或多种从商业和用户角度适合用于治疗TNBC和/或诱导期望的免疫应答的化合物的用途的各种材料。此类材料的非限制性实例包括但不限于缓冲液、稀释剂、载体、包装、容器、列出内容和/或使用说明的小瓶和/或管标签，以及带有使用说明的药品说明书。

标签可以在包含用于本发明的方法中的化合物的容器上或与容器相关联。当将组成标签的字母、数字或其他字符粘贴、模制或蚀刻至容器本身中时，标签可以在容器上；当标签存在于还容纳容器的储藏器或载体中时(例如，作为药品说明书)，标签可以与容器相关联。标签可用于指出用于特定的治疗应用的内容物。标签还可以指出内容物的使用说明，例如在本文所述的方法中。

在试剂盒的一些实施方案中，用于本发明方法的化合物可以存在于包装或分配器装置中，该包装或分配器装置可以包含一种或多种含有本文公开的化合物的单位剂型。包装可以例如，包含金属或塑料箔(例如泡罩包装)。包装或分配器装置可以随附给药说明。包装或分配器还可以伴随与容器相关联的以规范药品的生产、使用或销售的政府机构规定的形式的公告，该公告反映了该机构对用于人类或兽用给药的药物形式的批准。例如，此类公告可以是为美国食品和药品监督管理局批准的处方药标签，或批准的产品说明书。还可以制备包含被配制于相容的药物载体中的本文提供的化合物的组合物，将其放置在适当的容器中，并标记用于治疗指定病症。

可以根据用于制备药学上有用的组合物的已知方法来配制可用于本发明的方法中的化合物和包含它们的组合物。曲妥珠单抗、曲妥珠单抗衍生物、NPS、NPS变体、免疫佐剂和其他治疗剂的每一种可以与载体、稀释剂或赋形剂联合给药。在本领域技术人员所熟知并且容易获得的许多来源中详细描述了制剂。例如，E.W.Martin的Remington’sPharmaceutical Science描述了可用于本发明的制剂。通常，配制本发明的组合物使得有效量的至少一种本发明的化合物与适合的载体或稀释剂组合以促进组合物的有效给药。本发明方法中使用的组合物还可以为多种形式。这些包括例如固体、半固体和液体剂型，例如片剂、丸剂、粉剂、液体溶液或悬浮液、栓剂、可注射和可输注的溶液以及喷雾剂。优选形式取决于预期给药模式和治疗应用。所述组合物还优选包含本领域技术人员已知的常规药学上可接受的载体和稀释剂。与本发明的肽和多核苷酸一起使用的载体或稀释剂的实例包括但不限于水、盐水(saline)、油(包括矿物油)、乙醇、二甲基亚砜、明胶、环糊精、硬脂酸镁、右旋糖、纤维素、糖、碳酸钙、甘油、氧化铝、淀粉以及等效的载体和稀释剂，或这些任何一种的混合物。本发明的化合物的制剂还可包含悬浮剂、保护剂、润滑剂、缓冲剂、防腐剂和稳定剂。

在本文的实施例1和2、材料和方法以及附图中公开的研究中，研究人员评估了在佐剂环境中，给予抗体(曲妥珠单抗)和NeuVax^TM疫苗(HER2蛋白E75肽与免疫佐剂GM-CSF一起给予)的组合以预防在患有表达低(1+)或中等(2+)水平的HER2的肿瘤的NP(或NN(如果雌激素(ER)受体和孕激素(PR)受体均为阴性))乳腺癌患者中的复发的能力。入组患者随机接受曲妥珠单抗和NeuVax^TM疫苗或仅含GM-CSF的曲妥珠单抗(无NeuVax^TM疫苗)。记录联合治疗的安全性，特别为了确保联合HER2靶向治疗不会导致附加的心脏毒性。通过比较治疗组之间的DFS和免疫应答记录功效。主要功效终点为比较治疗组之间24个月的DFS。主要的安全问题为证明联合HER2靶向疗法不存在附加的心脏毒性。该试验的次要终点是比较36个月时的DFS。还记录了对疫苗的免疫应答，并将其与临床益处相关。

所述研究为抗体+NeuVax^TM疫苗与单独的抗体+GM-CSF的多中心、前瞻性、随机、单盲、安慰剂对照的II期临床试验。目标研究人群为护理治疗标准后无病的患有HER2 1+和2+表达肿瘤的NP(或NN(如果ER和PR均为阴性))乳腺癌患者。筛选在护理多模式治疗(care multi-modality therapy)标准后的无病受试者并进行HLA分型。Nelipepimut-S(以前称为E75肽)为仅限于HLA-A2+或HLA-A3+患者(约占美国人口的三分之二)的CD8引发的肽疫苗，并已扩展至HLA-A24+和HLA-A26+。

符合所有其他资格标准的HLA-A2+/A3+/A24+/或A26+患者被随机分配接受曲妥珠单抗+NeuVax^TM疫苗或单独的曲妥珠单抗+GM-CSF。对于两组，每三周作为单药治疗给予曲妥珠单抗，持续一年，并在完成护理化学治疗/放射治疗标准后给药。化学治疗/放射治疗完成后不早于3周且不迟于12周给予首次曲妥珠单抗输注。以8mg/kg的建议初始负荷剂量给药和每三周6mg/kg的建议维持剂量给予曲妥珠单抗。如4.3节所述给予曲妥珠单抗。随机分配至NeuVax疫苗组的患者每三周在完成曲妥珠单抗输注后30-120分钟，接受皮内给予的nelipepimut-S肽(1000mcg)和GM-CSF(250mcg)的接种，共接种六次。NeuVax疫苗系列将在第三次曲妥珠单抗输注完成后立即开始。在减轻的情况下，在首席研究人员事先批准的情况下，第一次接种可以延迟至第四或第五次曲妥珠单抗输注。那些被随机分配至单独的GM-CSF组的患者接受以与那些接受NeuVax疫苗相同的接种方式来接种GM-CSF(250mcg)。病人不知道他们是接受NeuVax疫苗还是单独的GM-CSF。

接种系列完成后，每六个月x 4给予加强接种(相同剂量和途径)，总联合(曲妥珠单抗和NPS疫苗)治疗时间为30个月。第一次加强接种发生于最后一次曲妥珠单抗输注时，随后的加强免疫从第一次加强免疫开始每六个月一次。加强接种发生于随机分配至接受nelipepimut-S/GM-CSF的患者，以及随机分配至接受单独的GM-CSF的患者，并且其包含相同的治疗药物和剂量(即，nelipepimut-S/GM-CSF患者用nelipepimut-S/GM-CSF进行加强，而只用GM-CSF的患者用单独的GM-CSF进行加强)。在整个研究中，患者、临床人员(临床医师、护理和辅助人员)以及临床研究协调员、数据管理员、统计学家和临床研究组织的领导均保持盲法，除了正在准备剂量和盲法材料标签的研究药剂师。

已随访受试者的安全问题、免疫应答和临床复发。每次接种后48-72小时监测患者对接种的反应，以及记录所经历的任何不良反应。免疫学应答为体内迟发性超敏反应(DTH)，并且还将通过体外表型和功能测定进行记录。最初打算对所有患者进行总共36个月的随访，以记录其无病状态。

定义：

以下参考实例仅出于说明目的描述本发明的几个方面。应当理解，阐述了许多具体细节、关系和方法以提供对本发明的全面理解。然而，相关领域的普通技术人员将容易地认识到，本发明可在没有一个或多个特定细节的情况下实践或者用其他方法、方案、试剂、细胞系和动物来实践。本发明涉及不受所图示的行为或事件的顺序限制，因为一些行为可以按照不同的顺序发生和/或与其他行为或事件同时发生。另外，并不要求所有举例说明的动作、步骤或事件来实施根据本发明的方法。本领域技术人员使用常规方法良好地理解并通常采用本文描述或引用的许多技术和程序。

在详细阐述本发明后，定义多个术语可能对理解本发明有所帮助，并且这些术语在以下的下一部分中相应地阐述。除非另有定义，本文中使用的所有技术术语、符号和其他科学术语或专有名词(terminology)旨在具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，本文定义了具有通常理解的含义的术语以明晰和/或便于参考，并且本文中包括这样的定义不应该被解释为代表与本领域通常所理解的实质性区别。还将理解，术语(例如在常规使用的字典中定义的那些)应解释为具有与其在相关领域的上下文中的含义一致的含义和/或如本文另外定义的含义。

术语“多核苷酸”或“核酸”——其在本文中可互换使用——指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶并入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。其他类型的修饰包括例如“封端”，用以下类似物、核苷酸间修饰替换一个或多个天然存在的核苷酸：例如，具有不带电荷的键的那些(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和具有带电荷的键的那些(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、包含侧链部分的那些(例如，蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等))、具有嵌入剂的那些(例如，吖啶、补骨脂素等)、含有螯合剂的那些(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)、含有烷基化剂的那些、具有修饰的键的那些(例如，α异头核酸等)，以及多核苷酸的未修饰形式。此外，糖中通常存在的任何羟基可被例如膦酸酯基、磷酸基替换，被标准保护基团保护，或被活化以制备与额外核苷酸的额外的键，或者可以与固体支持物缀合。可以磷酸化，或用胺或具有1至20个碳原子的有机封端基团部分取代5'和3'末端OH。还可以将其他羟基衍生为标准保护基团。多核苷酸还可以包含本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如，2'-O-甲基-2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮核糖、碳环糖类似物、a-异头糖、差向异构糖(例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖)、无环类似物和脱碱基核苷类似物(例如甲基核糖苷)。替代的连接基团可以替换一个或多个磷酸二酯键。这些替代的连接基团包括但不限于其中用P(O)S(“硫代硫酸盐”)、P(S)S(“二硫代硫酸盐”)、"(O)NR 2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH 2(“甲缩醛(formacetal)”)替换磷酸盐的实施方案，其中每个R或R'独立地为H或取代或未取代的烷基(1-20C)，其任选地包含醚(--O--)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或araldyl。并非多核苷酸中的所有连接都需要相同。先前的描述适用于本文所指的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

如本文所用，术语“表达”指mRNA的产生以及mRNA翻译成蛋白质。

如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，以指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。

本文所用的术语仅为了描述特定实施方案的目的并且不意图限制本发明。如本文所用，不定冠词“一”、“一个”和“该(the)”应理解为包括复数引用，除非上下文另外明确指出。

如本文所用，术语“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”或其变体旨在是包括性的，与术语“包括(comprising)”相似。

如本文所用，术语“个体”、“受试者”和“患者”为可互换的，并且指能够罹患三阴性乳腺癌的任何性别的人。在一些实施方案中，个体为18岁或更大的女性。在一些实施方案中，受试者患有或已经患有HER2低表达(IHC1+/2+，FISH无扩增)乳腺癌。

如本文所用的短语“和/或”应理解为意指这样结合的要素的“二者择一或两者兼有(either or both)”，即，在一些情况下结合存在并且在其他情况下分离存在的要素。

如本文所用，“或”应理解为具有与以上定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“和/或”或“或”应解释为是包括性的，即，包括多个项目中的至少一个，但还包括多个项目的多于一个，以及任选地额外的未列出的项目。明确指向相反意思的术语“仅(only)”(例如“......中的仅一个”或“......中的恰好一个”)，或在权利要求中使用时的“由......组成(consisting of)”将指包括多个要素或要素列表中的恰好一个要素。通常，仅当在排他性术语(例如“任一(either)”、“......中的一个”、“......中的仅一个”或“......中的恰好一个”)之后时，本文所用术语“或”才应解释为表示互斥的替代方案(即“一个或另一个，但不是两者”)。

如本文所用，“治疗”指试图改变被治疗的个体或细胞的自然进程的临床干预，并且可以在临床病理过程之前或期间进行。理想的治疗效果包括延迟或预防疾病或病症(例如三阴性乳腺癌或其症状)或其症状的发生或复发、延迟疾病或病症的发作、减轻疾病的病症或症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、降低疾病进展速度、改善或缓和疾病状态、实现缓解或改善预后以及提高无病生存率。在治疗TNBC时，以治疗有效量给予曲妥珠单抗或其衍生物，和NPS或其变体的组合。

“有效量”意指防止或延迟发作、防止或延迟复发、去除、减少或减缓TNBC对人的有害作用的曲妥珠单抗或其衍生物和NPS或其变体的量。应理解本领域技术人员可以根据患者、病理、给药方式等调整给药剂量。

如本文所用，术语“肿瘤”指所有赘生性的细胞生长和增殖(无论恶性或良性)，以及所有癌前的和癌变的细胞和组织。例如，特定癌症可以以实体瘤或非实体瘤为特征。实体瘤块(如果存在)可以为原发性肿瘤块。原发性肿瘤块指由组织的正常细胞转化产生的该组织中的癌细胞的生长。在大多数情况下，原发性肿瘤块通过囊肿的存在——其可以通过目视或触诊方法，或通过组织的形状不规则、质地或重量来发现——来鉴定。然而，一些原发性肿瘤为不可触知的，并且只能通过医学成像技术(例如X射线(例如，乳房摄影术)或磁共振成像(MRI))或通过针吸检查(needle aspiration)进行检测。这些后面的技术的使用在早期检测中更为常见。通常可以使用组织内癌细胞的分子和表型分析来确认癌症是否为组织内源性的，或者病变是否是由于其他部位的转移。一些肿瘤是无法切除的(例如由于转移灶的数量或因为其在手术危险区域而无法手术去除)。本发明的方法可用于早期、中期或晚期疾病，以及急性或慢性疾病。

MHC I类肽疫苗为HLA限制性的，但可以结合多种HLA类型。HLA类型已与对多种免疫疗法的反应相关，包括检查点抑制剂。HLA类型、预测的肽结合潜力和临床应答之间的关系对主动免疫疗法的设计和开发有影响。用MHC I类肽、E75(HER2 369-377)+GM-CSF(NeuVax)+曲妥珠单抗与GM-CSF+曲妥珠单抗进行随机IIb期试验，以防止在结节阳性和/或ER^-/PR^-阴性、HER2低表达的乳腺癌患者中复发。在计划的中期分析中，NeuVax+曲妥珠单抗特别在TNBC患者中表明了显著的无病生存益处。实施例1和2中的分析检验了HLA类型对试验结果的影响。

在标准治疗后，通过流式细胞仪检测临床无病、HER2低表达(IHC1+/2+，FISH无扩增)、结节阳性(AJCC N1、N2或N3)和/或三阴性乳腺癌患者的A2、A3、A24和A26等位基因的存在。HLA-A2、A3、A24和/或A26+患者被随机分配以接受曲妥珠单抗+NeuVax(疫苗组)或曲妥珠单抗+GM-CSF(对照组)。所有患者按护理标准接受一年的曲妥珠单抗。从第三次曲妥珠单抗剂量开始，每3周x 6给予NeuVax或GM-CSF，且然后每6个月x 4加强接种。在最后一次患者入组后六个月，开始预先指定的中期分析。主要终点为通过对数秩评估的无病生存率。使用IEDB分析资源共识(IEDB Analysis Resource Consensus)工具进行MHC I类结合预测。

材料与方法

实验：Herceptin+NeuVax疫苗研究组。随机分配至这组的患者每3周接受抗体(曲妥珠单抗)作为单药疗法，持续1年；在完成护理化学治疗/放射治疗标准后不早于3周且不迟于12周，施用首次曲妥珠单抗输注。曲妥珠单抗以8mg/kg的建议初始负荷剂量给药，建议的维持剂量为每三周6mg/kg。每3周，在完成输注曲妥珠单抗后30-120分钟，患者接受皮内给予的NeuVax疫苗的接种，共接种6次。NPS疫苗系列在第三次曲妥珠单抗输注完成后立即开始，但在PI事先批准的情况下，可以推迟至第四次或第五次曲妥珠单抗输注。患者对于分配组不知情。在完成初级疫苗系列后，患者每6个月x 4接受4次NeuVax疫苗加强接种，总治疗时间为30个月。

实验：活性药物对照组(active comparator)：仅Herceptin+GM-CSF研究组。

随机分配至这组的患者每3周作为单药疗法接受抗体(曲妥珠单抗)持续1年。在完成护理化学治疗/放射治疗标准后，不早于3周且不迟于12周，给予首次曲妥珠单抗输注。曲妥珠单抗以8mg/kg的建议初始负荷剂量给药，建议的维持剂量为每三周6mg/kg。每3周，在完成曲妥珠单抗输注后30-120分钟，患者接受皮内给予的仅GM-CSF(250mcg)的接种，共接种6次。在完成第三次曲妥珠单抗输注后，仅GM-CSF的接种系列立即开始。病人不知道他们是接受NeuVax疫苗还是仅GM-CSF。在六次接种初级疫苗系列完成后，然后患者接受从首次曲妥珠单抗输注之日起的第12、18、24和30个月给予的总共四次仅GM-CSF的加强接种。

曲妥珠单抗干预。在完成护理化学治疗/放射治疗标准后，曲妥珠单抗每3周作为单药治疗给予至患者，持续一年。在完成护理化学治疗/放射治疗标准后不早于3周且不迟于12周，给予首次曲妥珠单抗输注。以8mg/kg的建议初始负荷剂量给药和每3周6mg/kg的建议维持剂量给予曲妥珠单抗。

Nelipepimut-S干预。疫苗给药时，将冰冻的E75醋酸盐溶液(1.5mg/ml)解冻，并将1000mcg E75肽(KIFGSLAFL(SEQ ID NO:1)，HER2/neu，369-377)与250mcg GM-CSF(sargramostim)充分混合。这构成了NeuVax疫苗。对于随机分配至曲妥珠单抗+NeuVax疫苗组的患者，他们开始曲妥珠单抗单药疗法，然后在完成第三次曲妥珠单抗输注后，立即开始NeuVax疫苗系列。所述疫苗系列包括每3周，在完成曲妥珠单抗输注后30-120分钟，皮内给予NeuVax疫苗，共六次接种。

GM-CSF干预。对于随机分配至仅曲妥珠单抗+GM-CSF组的患者，他们开始曲妥珠单抗单药疗法，然后在完成第三次曲妥珠单抗输注后，立即开始GM-CSF(sargramostim)接种系列。GM-CSF接种系列包括完成曲妥珠单抗输注后30-120分钟，每三周皮内给予250mcgGM-CSF，共六次接种。

研究标准：纳入标准。

根据以下标准将患者纳入研究中：

·18岁或以上的女性

·结节阳性乳腺癌(AJCC N1、N2或N3)

·结节阴性乳腺癌——如果雌激素(ER)受体和孕激素(PR)受体均为阴性，并且已接受护理标准的化学治疗

·在护理治疗标准(NCCN指南指示的手术、化学疗法、放射疗法)后，临床上无癌症(无疾病证据)。按照护理标准继续激素治疗。

允许新辅助化学疗法。

·从与先前辅助治疗相关的任何毒性中恢复。

·HER2表达为IHC1+或2+。必须对IHC 2+肿瘤进行FISH(或Dual-ISH)测试，并通过FISH(≤2.0)(或Dual-ISH，≤2.0)显示无扩增。

·HLA-A2、A3、A24或A26阳性

·LVEF>50％，或LVEF在机构特定测试的正常范围内(多次采集[MUGA]心脏扫描或超声心动图[Echo])

·东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group(ECOG))的表现状态为0或1

·签署知情同意书

·适当的节育(禁欲、子宫切除术、双侧卵巢切除术、双侧输卵管结扎、口服避孕药、宫内节育器(IUD)或使用避孕套或避孕隔膜)

·必须在完成护理治疗标准后的3至12周内开始研究治疗(接受首次曲妥珠单抗输注)。

研究标准：排除标准。

根据以下标准，将患者排除在研究之外：

·结节阴性乳腺癌(美国癌症联合会(American Joint Committee on Cancer[AJCC])N0或N0(i+))，除非雌激素(ER)受体和孕激素(PR)受体均为阴性且已接受护理标准的化学治疗

·远端或残留的乳腺癌的临床或影像学证据

·HER2阴性(IHC 0)或HER2 3+或FISH或Dual-ISH显示扩增(FISH>2.0；Dual-ISH>2.0)

·人白细胞抗原(HLA)-A2、A3、A24、A26阴性

·先前的曲妥珠单抗治疗史

·纽约心脏协会(New York Heart Association(NYHA))3或4级心脏病

·左心室射血分数(LVEF)<50％，或低于该机构特定测试(MUGA或Echo)的正常限值

·免疫缺陷性疾病或HIV、HBV、HCV

·接受免疫抑制疗法，包括化学疗法、长期类固醇、甲氨蝶呤或其他已知的免疫抑制剂

·ECOG表现状态≥2

·总(血清)胆红素>1.8mg/dL、肌酐>2.0mg/dL、血红蛋白<10g/L、血小板<50,000/uL、WBC<2,000/uL

·怀孕(通过尿HCG评估)

·母乳喂养

·任何需要治疗的活动期自身免疫疾病，白癜风除外

·需要药物治疗至包括多个吸入器的活动性肺部疾病

·参与其他实验方案(除非获得其他研究PI的许可)

评估：24个月时的无病生存率(DFS)。所有患者的DFS(不管随机分组)由患者自己的医师在常规随访筛查期间在各个研究地点测定。这在完成初级治疗后的前24个月中每三个月发生一次，且此后每六个月进行一次，用临床检查以及实验室和射线照相监测进行。这项研究的主要目标为在24个月时的无病生存率(DFS)。

评估：36个月时的无病生存率(DFS)。所有患者的DFS(不管随机分组)由患者自己的医师在常规随访筛查期间在各个研究地点测定。这发生在初级治疗后的第30和36个月，用临床检查以及实验室和射线照相监测进行。该研究的次要目标为36个月时的无病生存率(DFS)。

评估：24个月时的心脏毒性。每位患者(不管随机分组)优选用多门控采集扫描(MUGA)，允许用超声心动图(ECHO)，要求一致性且在3、6、12和24个月时进行基线心脏评估(射血分数)。如果患者经历超过10％的基线下降，则在试验期间或在症状消退(resolution)前每六个月继续进行心脏评估。

疫苗或接种系列和加强系列持续期间的局部和全身毒性。根据国家癌症研究所通用不良事件术语标准(National Cancer Institute Common Terminology Criteria forAdverse Events(NCI-CTCAE))，版本4.03的毒性量表，收集标准的局部和全身毒性并进行分级。对于常规和加强接种，在接种后，采用每15分钟进行询问、连续检查和生命体征的方式对患者进行严密监测一小时，以观察超敏反应。每次接种后48-72小时，患者还要返回诊所，以针对全身毒性进行询问，并检查和测量接种部位的局部反应。

本文所提到或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物，包括所有附图和表格，只要它们不与本说明书的明确教导不符，其全部内容通过引用的方式并入本文。

以下为举例说明实施本发明的方法的实施例。这些实施例不应被解释为限制性的。除非另有说明，所有百分比均以重量计，且所有溶剂混合物比例均以体积计。

实施例1—曲妥珠单抗加Nelipepimut-S(NEUVAX)与曲妥珠单抗针对预防复发的 随机2b期试验的预先指定的中期分析比较，显示在三阴性(HER2低表达)乳腺癌患者中的益 处。

人类表皮生长因子受体2(HER2)低表达乳腺癌(免疫组织化学法(IHC)1-2+)不适合曲妥珠单抗(TZ)辅助治疗。NSABP B-47证实曲妥珠单抗不能改善HER2低表达乳腺癌的预后(Fehrenbacher等人,SABCS,2017,摘要GS1-02)。这些患者目前无法获得HER2-靶向疗法。TZ为成功靶向治疗癌症的最广为人知的实例。15-20％的BC患者由于他们为HER2过表达(IHC3+或FISH显示扩增)而符合条件接受TZ。

先前已经进行了扩大曲妥珠单抗应用的努力。最近，NSABP B-47试验证实TZ不改善这类人群的预后(Fehrenbacher等人,2017)。HER2阴性、ER阳性的患者状况很好，且可能不需要激素治疗以外的靶向治疗；但是，TNBC患者的长期生存期最差，并且几乎没有治疗选择。因此，需要针对TNBC患者的新的疗法。

HER2还是曲妥珠单抗的靶点，20％的乳腺癌患者适合接受曲妥珠单抗。NeuVax为一种HER2靶向疫苗，其最初准备可用于更广泛基础的50-60％的乳腺癌患者，其肿瘤为HER2“低表达”。如图1所示，nelipepimut-S为衍生自HER2蛋白(乳腺癌患者中有前景的疫苗接种的靶点)的胞外结构域的免疫优势肽。Nelipepimut-S与抗原呈递细胞(APC)上的特定HLA分子结合后，刺激特定的CD8+CTL。

佐剂nelipepimut-S+GM-CSF(NeuVax)的1/2期试验证明了其安全性和免疫原性，并表明了临床疗效(Gall等人,Cancer Res.,2017,77:5374-83)。使用该疫苗的目的为启动免疫系统，以识别和攻击见于乳腺癌中的HER2蛋白；因此，当/如果早期乳腺癌患者在完成他们的一线治疗后有复发风险，他们的免疫系统将在nelipepimut-S给药后识别HER2并采取行动，因此延迟或阻止临床复发的出现。在临床上，应将其翻译为延长无病生存率(DFS)，并最终延长总生存率(OS)。

进行了一项多中心、前瞻性、随机、单盲、安慰剂对照的抗体+NeuVax^TM疫苗(nelipepimut-S(NPS，也称为E75肽)+粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)相对于单独的抗体+GM-CSF的II期临床试验。目标研究人群为患有HER2 1+和2+表达肿瘤的结节阳性(NP)(或者，如果ER和PR均为阴性，则为结节阴性[NN])乳腺癌患者，其在护理治疗标准后为无疾病。在护理多模式治疗标准后，对无病受试者进行筛选和HLA分型。NeuVax^TM疫苗为CD8引发的肽疫苗，其仅限于HLA-A2+或HLA-A3+患者(约占美国人口的三分之二)，并且已扩展至HLA-A24+和HLA-A26+。研究设计在图2中示出。

关键纳入标准：

·≥18岁的女性

·HER2表达为IHC 1-2+的高危浸润性乳腺癌

·接受护理治疗标准后临床无疾病

·HLA-A2、A3、A24或A26阳性

评估：

·局部和全身毒性

·心脏毒性

·体内免疫学应答

·无病生存率

详细纳入标准：

·≥18岁的女性；ECOG PS 0-1

·经组织学证实的HER2表达为IHC*1-2+的结节阳性(HR+/-)的浸润性乳腺癌或结节阴性(HR-)的浸润性乳腺癌

-对于IHC 2+肿瘤，FISH或Dual-ish HER2：CEP17≤2.0(无扩增)

·接受手术、辅助或新辅助化学疗法和放射疗法后临床上无疾病

·HLA-A2、A3、A24或A26阳性

·目前将HR-和HER2 1+/2+的患者定义为TNBC患者

详细评估：

·局部和全身毒性(NCI CTCAE版本4.03)

·心脏毒性：心脏射血分数(MUGA或超声心动图)：基线，3、6、12和24个月

·迟发型超敏反应(DTH)(灵敏圆珠笔法(sensitive ball point pen method))：接种前和接种后时间点

·DFS：完成初级治疗后的前24个月每3个月评估复发，此后每6个月评估复发

·缩写：CEP，染色体计数探针；DFS，无病生存率；DTH，迟发型超敏反应；ECOG PS，东部肿瘤协作组表现状态；FISH，荧光原位杂交；HER2，人表皮生长因子受体2；HLA，人类白细胞抗原；HR，激素受体；IHC，免疫组织化学法；MUGA，多门控采集扫描；NCI CTCAE，国家癌症研究所通用不良事件术语标准。

从预先指定的中期分析中获得结果。

·最后一名患者入组后6个月

·评估安全性和功效

以下表1和表2示出了患者人数统计(ITT)

表1

表2

筛选了589名患者并同意进行HLA分型，根据HLA状态，仅16.6％不符合条件。216名为合适的HLA类型，但没有计入筛查失败或患者选择。招募了275名患者。治疗组(AJCC7阶段)之间不存在临床病理差异。

图3示出了每名患者的最大分级毒性图。每组中有7名患者未开始指定的治疗，并从安全性分析排除。患者所经历的相关毒性或最大毒性的分布或严重程度不存在差异。除在NeuVax组中的1/2级局部瘙痒和疼痛稍多外，个体的局部或全身毒性不存在差异。TRAE主要包括可控制的局部注射部位反应、皮肤硬结、瘙痒和疲劳。不存在4/5级的TRAE。

图4为随时间的心脏射血分数(LVEF)的图。治疗组之间的心脏相关不良事件的发生率不存在显著差异(表2)。在预先指定的3、6和12个月评估中，两组的平均LVEF较基线略有降低(p<0.02)，但在24个月时停药曲妥珠单抗后无差异(p>0.58，图3)。当评估其中用混合线性回归模型评估LVEF的所有时间点时，在随机分组之间(p＝0.91)或在随时间的组之间(p＝0.81，图4)，心脏射血分数随时间变化没有显著差异(p＝0.65)。

表3.复发

ITT，意向治疗；TNBC，三阴性乳腺癌；TZ，曲妥珠单抗。

图7示出了TNBC患者的无病生存率的图。在预先指定的亚组分析中，在三阴性人群中观察到更强的临床益处。

该患者人群引起了特别的兴趣，因为在乳腺癌的有效靶向治疗时代，这些患者几乎没有有效的治疗方法。如先前所讨论，目前大约有80％的乳腺癌患者不具有有效的HER2靶向分子疗法(例如曲妥珠单抗和其他结合HER2的高分子/抗体)的资格，但这些患者中的约有四分之三将患有ER阳性疾病，其相对侵袭性较小，并确保他们可以接受激素疗法，后者也非常有效。虽然这些患有激素受体阳性、HER2阴性(包括激素受体阳性，HER2“低表达”)疾病的患者具有非常良好的预后，目前三阴性疾病患者中的20％为乳腺癌患者的风险最高的生物学子集，预后特别差，且仅依靠细胞毒性化学疗法作为其治疗的支柱。重要的是，这在转移阶段和早期阶段，以及在成功完成早期疾病的主要一线治疗后的辅助/维持环境中均是如此。因此，TNBC患者代表了需要新型疗法的乳腺癌患者的服务不足的人群。

在这项研究中，发现NeuVax+曲妥珠单抗组合是安全的，治疗组之间没有明显的安全性差异。没有增加的心脏毒性。NeuVax+曲妥珠单抗可以向HER2低-表达乳腺癌患者提供临床意义的益处。最重要地，NeuVax+曲妥珠单抗组合在TNBC患者中显示出DFS的统计学显著改善。

实施例2—HLA-A24+三阴性(HER2低表达)乳腺癌患者中的NPS的活性

在这项研究(实施例1)的三阴性乳腺癌(TNBC)队列中(n＝97)的患者中，积极治疗(NPS加曲妥珠单抗)使所有HLA类型受益(见图8，示出了试验中的各种HLA亚型患者的风险比的样图，其中TNBC队列的整体风险比[H.R.]——在所有HLA类型中——是令人印象深刻的0.29)。但是，该样图亚组分析显示，在HLA-A24+患者中，H.R.达到最低，其具有引人注目的H.R.值0.08且p值为0.003。HLA-A24阳性与亚洲/太平洋盆地人口特别相关。

在图9中，示出了HLA-A24+TNBC患者的DFS。在TNBC患者的较后的亚组中，相对于24个月DFS界标分析(landmark analysis)中的对照组(仅曲妥珠单抗)，NPS加曲妥珠单抗组合引起24个月的复发或死亡的相对风险显著降低90.6％。

图8和图9中的数据证实了，在全部其他被测患者的亚组中(这些亚组根据不同的基线患者和疾病特征以及数据分层参数来定义)，TNBC患者的HLA-A24+亚组表现出所观察到的最高临床活动性——其通过活动组(组合的NPS+曲妥珠单抗)和对照组(单独的曲妥珠单抗)间的Δ(DFS)来评估。

另外，HLA-A24+患者在研究范围内(即在ITT人群的HLA-A24+部分中，其包括TNBC和非TNBC患者)还显示出改善DFS的趋势(参见图10)。在这项对ITT中HLA-A24+患者的中位DFS的分析中(整体研究人群)，其显示H.R.为0.43，p值为0.07，这对应于：相对于对照组(仅曲妥珠单的)在24个月的DFS界标分析，联合组(NPS+曲妥珠单抗)在24个月时的复发或死亡的相对风险降低了61.2％。

因此，对于TNBC队列和ITT人群(不管激素受体状态，后者均为HER2 IHC 1+/2+)，所观察到的NPS加曲妥珠单抗组合的最强临床功效是在HLA-A24+患者中。至少出于两个原因，这一发现很吸引人。

首先，HLA-A24为生活在亚洲/太平洋海盆地区域人口中表达最强的HLA类型，并且这使得该发现与亚洲市场非常相关，因为，考虑到HLA-A24等位基因在亚洲的患病率很高，这些数据在生物学上将NPS强烈定位为最佳地在这些地区可能(与曲妥珠单抗组合)使用的药剂，尽管其在全球范围内也是有效的。

其次，当人们观察各种HLA亚型与E75(NPS)肽的结合亲和力时，这一发现是无法预测的。实际上，HLA-A24(和A26)分子(在亚洲患者中普遍表达)对NPS肽的结合活性最低(参见表4)，但却与最有效的临床应答相关(根据以上DFS临床结果数据)。

在以下表4中，人工神经网络(ANN)IC50表示与MHC I类进行50％结合所需的蛋白质的浓度。低IC50值表示与给定HLA分子的抗原识别的生物物理“口袋”的强结合，并且反之，高IC50值表示与所述“口袋”的弱结合。

表4在测试HLA类型之间对E75(NPS)HER2表位的预测的结合亲和力。

表5 HLA-A24+患者的人口统计

从表4可以明显看出，等位基因HLA-A24(和A-26)产生最高的肽结合IC50值。当通过建模的结合强度等级(包括除IC50之外的其他因素)评估时，在所有四种主要的HLA I类等位基因(A02、A03、A24[在这种情况下甚至是A26])中，HLA-A24亚型与NPS肽的关联最弱。

综上所述，以上表明除了高亲和力构象(即A02和A03)外，NPS能够与较低亲和力的MHC-1构象(A24)结合，特别是在亚洲人群中。实际上，这种在生物物理/分子水平上与这两种HLA构象相关联的能力可能——至少部分地——是产生针对我们接种的抗原(NPS)以及很可能其他一般的HER2片段的最佳有利的免疫应答的原因。据预测，这可能是在多个其他HER2表位上的情况，NPS疫苗接种后的表位扩散已在较早的研究中反复显示(Conrad H等人J Immunol.2008；180:8135-45；Emens LA等人Endocr Relat Cancer.2005；12:1-17；Mittendorf EA等人,Surgery.2006；139:407-18；Disis ML等人,J Clin Oncol.2002；20:2624-32；Brossart P等人Blood.2000；96:3102-8；Disis ML等人,Clin Cancer Res.1999；5:1289-97)。

面对NPS对实际HLA-A24分子的低亲和力，在NPS疫苗接种后的HLA-A24+患者中观察到深远的临床应答(明显的矛盾)，这一事实很可能由于宿主的抗原呈递细胞(抗原呈递细胞(APC)，即巨噬细胞和单核细胞)——且最终为CD8 T细胞——对HLA-A24个体的NPS表位的“暴露”减少(由于免疫系统降低了抗原识别“事件”的频率)。因此，该作用可能是由于对该关键表位(NPS)的耐受性的出现率降低。换言之，在亚洲人群中，较低的肽结合亲和力可能是对许多HLA-A24结合自身肽(包括NPS)的无效耐受性的基础。这很重要，因为与HLA-A24具有更高亲和力的除NPS以外的肽疫苗(尤其是单价疫苗)可能为快速致耐受的(尽管诱导早期免疫反应性达到“适当的”水平)，并导致随时间逐渐降低的免疫原性。此外，这种作用在HLA-A24+个体中可能更加增强。因此，这是我们不期望在NPS上看到的效果，尤其是在亚洲人群中，其为NPS的非常正面且显著与众不同的属性。

相比其他HER2靶向的免疫治疗(包括肽类疫苗或其他类型的疫苗)，以上全部可以提供NPS(或NPS变体)(尤其在亚洲患者中)的潜在强分化，因为此类药剂可以表现出：要么与HLA-A24的亲和力太低(在这种情况下，它们的抗原性/免疫原性相比于NPS会更差)，要么与HLA-A24的亲和力太高(在这种情况下，它们将更迅速、更明确地导致免疫耐受和对给定抗原的无反应性)。在一般的肽疫苗文献中还已知，与免疫T细胞所需的肽-HLA亲和力的阈值相比，可能需要更高阈值的肽-HLA亲和力来诱导免疫耐受。因此，在肽疫苗抗原的大多数情况下，平衡向两个方向(免疫原性与耐受性诱导)之一强烈倾斜。总而言之，以上发现偶然发现地且非常有利地表明，似乎NPS同时是最佳抗原性的和抗致耐受的(特别在HLA-A24患者的情况下)，并且这很可能是NPS(和NPS变体)独特且“奇特”的特征。

最后，有基本的/一般的(即不针对于NPS或不与NPS相关)文献(参见下文带有星号[*]的列表)，其将给定自身抗原的结合弱(即，内在地“弱”抗原，如与大多数肿瘤相关的抗原，包括NPS)与其同源的HLA/MHC I类“口袋”和缺乏对该所述抗原的致耐受性(后一种特性为抗癌疫苗的最佳特性，NPS似乎具有这种特性)正向关联。最后，很有意思的是，NPS的这种抗致耐受性可以成为接种患者中的NPS特异性CD4(即，T记忆)细胞克隆的激活和持久性的基础，其为NPS的罕见(从临床角度来看还非常有益)特性(参见：Peoples GE等人ClinCancer Res.2008；14:797-803；其为证明NPS接种后CD4 T记忆细胞应答良好的关键论文，所述良好的应答对于主要为CD8激活的短[9-氨基酸]肽(如NPS)来说，将是出乎意料的)。

*有关抗原的HLA亲和力和致耐受性之间的关系(在癌症免疫治疗中，但不与NPS直接相关)的引文如下列出：

·Blum JS等人Annu Rev Immunol.2013；31:443-73。

·Janicki CN等人Cancer Res.2008；68:2993-3000。

·Gebreselassie D等人Hum Immunol.2006；67:894-906。

·Gross DA等人J Clin Invest.2004；113:425-33。

·McMahan C和Fink P.J Immunol.2000；165:6902-7。

·Arnold B等人Immunol Today.1993；14:12-4。

·J&Carbone FR.Immunol Res.1991；10:54-65。

·Milich DR等人J Immunol.1989；143:3148-56。

示例性的实施方案

本发明的实施方案的实例包括但不限于：

实施方案1.一种用于治疗个体中的三阴性乳腺癌(TNBC)的方法，其包括向所述个体给予：(a)有效量的曲妥珠单抗或其衍生物；和(b)有效量的nelipepimut-S或其变体。

实施方案2.实施方案1的方法，其中间隔给予所述曲妥珠单抗或其衍生物和nelipepimut-S或其变体，并且在曲妥珠单抗或其衍生物的给药开始后，再开始nelipepimut-S或其变体的给药。

实施方案3.实施方案1或2的方法，其中所述方法包括开始准备阶段，其包括将一定剂量的曲妥珠单抗或衍生物进行定期给药，而没有nelipepimut-S或变体；随后是联合阶段，其包括将一定剂量的曲妥珠单抗或衍生物和nelipepimut-S或变体进行定期给药。

实施方案4.实施方案3的方法，其中所述准备阶段包括进行曲妥珠单抗或其衍生物给药的频率和持续时间，该频率和持续时间足以在所述给予nelipepimut-S或其变体之后增加主要组织相容性复合体I型介导的HER2抗原在个体的乳腺癌细胞上的呈递。

实施方案5.任何前述实施方案的方法，其中初始免疫阶段期间，nelipepimut-S或变体的给药是在完成曲妥珠单抗或其衍生物的第三、第四或第五次给药后开始的。

实施方案6.任何前述实施方案的方法，其中以8mg/kg的初始负载剂量和每3周(q3wk)6mg/kg的维持剂量给予曲妥珠单抗或其衍生物，且其中给予剂量为1,000mcg的nelipepimut-S或变体。

实施方案7.任何前述实施方案的方法，其中通过免疫组织化学法(IHC)，所述TNBC具有1+或2+的HER2表达。

实施方案8.任何前述实施方案的方法，其中所述个体为HLA-A2阳性、HLA-A3阳性、HLA-A24阳性或HLA-A26阳性。

实施方案9.任何前述实施方案的方法，其中在接受针对TNBC的护理治疗标准(例如，化学疗法、外科原发性肿瘤切除、放射疗法或前述的两种或更多种的组合)后，所述个体在所述给药时为临床无疾病。

实施方案10.实施方案9的方法，其中在完成护理治疗标准后3周至12周之间开始进行曲妥珠单抗或其衍生物的给药。

实施方案11.任何前述实施方案的方法，其中，在所述给药时，所述TNBC为结节阴性(例如，AJCC N0或N0(i+))。

实施方案12.任何前述实施方案的方法，其中静脉内给予曲妥珠单抗或其衍生物。

实施方案13.任何前述实施方案的方法，其中皮内给予所述nelipepimut-S或其变体。

实施方案14.任何前述实施方案的方法，其还包括向所述个体给予免疫佐剂。

实施方案15.实施方案12的方法，其中所述免疫佐剂包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

实施方案16.实施方案15的方法，其中每天给予剂量为250mcg的GM-CSF。

实施方案17.实施方案14-16的任一项的方法，其中每3周(q3wk)给予所述免疫佐剂。

实施方案18.任何前述实施方案的方法，其中每三周，在完成曲妥珠单抗或其衍生物的输注后30-120分钟，皮内给予1,000mcg的nelipepimut-S或其变体和250mcg的GM-CSF。

实施方案19.实施方案14至18中任一项的方法，其中所述免疫佐剂与nelipepimut-S或其变体在同一或分开的制剂中一起给予。

实施方案20.任何前述实施方案的方法，其中所述nelipepimut-S包含由氨基酸序列KIFGSLAFL(SEQ ID NO:1)组成的HER2/neu肽，并且所述变体在SEQ ID NO:1的第4位具有α-氨基丁酸、正缬氨酸或正亮氨酸，在SEQ ID NO:1的第7位具有α-氨基丁酸、正缬氨酸或正亮氨酸，或在SEQ ID NO:1的第8位具有异苯丙氨酸。

实施方案21.实施方案20的方法，其中给予nelipepimut-S的变体，且所述变体选自：

K I F Abu S L A F L(SEQ ID NO:2)；

K I F Nva S L A F L(SEQ ID NO:3)；

K I F Nle S L A F L(SEQ ID NO:4)；

K I F G S L Abu F L(SEQ ID NO:5)；

K I F G S L Nva F L(SEQ ID NO:6)；

K I F G S L Nle F L(SEQ ID NO:7)；和

K I F G S L A isoF L(SEQ ID NO:8)。

实施方案22.任何前述实施方案的方法，其中所述方法还包括在进行曲妥珠单抗或其衍生物和nelipepimut-S或其变体的给药之前、期间或之后，向受试者给予另外的治疗剂。

实施方案23.实施方案22的方法，其中所述另外的治疗剂为免疫治疗剂。

实施方案24.实施方案23的方法，其中所述免疫治疗剂包括免疫检查点抑制剂。

实施方案25.任何前述实施方案的方法，其中所述给药减小了肿瘤尺寸和/或提高了个体的无病生存率(无复发生存率)。

实施方案26.任何前述实施方案的方法，其中将曲妥珠单抗或其衍生物和nelipepimut-S或其变体进行给药对个体具有协同作用。

实施方案27.任何前述实施方案的方法，其中所述方法还包括在将曲妥珠单抗或其衍生物和nelipepimut-S或其变体进行给药之前、期间或之后向个体施用另外的治疗剂。

实施方案28.实施方案27的方法，其中所述另外的治疗剂为免疫治疗剂。

实施方案29.实施方案28的方法，其中所述免疫治疗剂包括免疫检查点抑制剂。

实施方案30.任何前述实施方案的方法，其中在接受针对TNBC的治疗(例如，化学疗法、外科原发性肿瘤切除、放射疗法或前述的两种或更多种的组合)后，所述个体在所述给药时为临床无疾病，并且其中所述方法延迟或防止该个体中TNBC的复发。

实施方案31.任何前述实施方案的方法，其中将曲妥珠单抗或其衍生物和nelipepimut-S或其变体进行给药对个体具有协同作用。

实施方案32.任何前述实施方案的方法，其中向个体给予有效量的曲妥珠单抗和有效量的nelipepimut-S。

实施方案33.一种在患有表达低水平的HER2/neu的三阴性乳腺癌的个体中诱导针对HER2/neu的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予：(a)有效量的曲妥珠单抗或其衍生物；和(b)有效量的nelipepimut-S或其变体。

实施方案34.实施方案33的方法，其中间隔给予所述曲妥珠单抗或其衍生物和nelipepimut-S或其变体，并且在开始进行曲妥珠单抗或其衍生物的给药后，再开始进行nelipepimut-S或其变体的给药。

实施方案35.实施方案33或34的方法，其中所述方法包括开始准备阶段，其包括将一定剂量的曲妥珠单抗或其衍生物进行定期给药，而没有nelipepimut-S或变体；然后是联合阶段，其包括将一定剂量的曲妥珠单抗或其衍生物和nelipepimut-S或其变体进行定期给药。

实施方案36.实施方案35的方法，其中所述准备阶段包括进行曲妥珠单抗或其衍生物给药的频率和持续时间，该频率和持续时间足以在所述给予nelipepimut-S或其变体之后增加主要组织相容性复合体I型介导的HER2抗原在个体的乳腺癌细胞上的呈递。

实施方案37.任何前述实施方案的方法，其中在完成曲妥珠单抗或其衍生物的第三、第四或第五次给药后，开始进行nelipepimut-S或变体的给药。

实施方案38.任何前述实施方案的方法，其中以8mg/kg的初始负载剂量和每3周(q3wk)6mg/kg的维持剂量给予曲妥珠单抗或其衍生物，且其中给予剂量为1,000mcg的nelipepimut-S或变体。

实施方案39.任何前述实施方案的方法，其中通过免疫组织化学法(IHC)，所述TNBC具有1+或2+的HER2表达。

实施方案40.任何前述实施方案的方法，其中所述个体为HLA-A2阳性、HLA-A3阳性、HLA-A24阳性或HLA-A26阳性。

实施方案41.任何前述实施方案的方法，其中所述个体为HLA-A24阳性。

实施方案42.任何前述实施方案的方法，其中在接受针对TNBC的护理治疗标准(例如，外科原发性肿瘤切除、化学疗法、放射疗法或前述的两种或更多种的组合)后，所述个体在所述给药时为临床无疾病。

实施方案43.实施方案42的方法，其中在完成护理治疗标准后3周至12周之间开始进行曲妥珠单抗或其衍生物的给药。

实施方案44.任何前述实施方案的方法，其中在所述给药时，所述TNBC为结节阴性(例如，AJCC N0或N0(i+))。

实施方案45.任何前述实施方案的方法，其中静脉内给予曲妥珠单抗或其衍生物。

实施方案46.任何前述实施方案的方法，其中皮内施用所述nelipepimut-S或其变体。

实施方案47.任何前述实施方案的方法，其还包括给予免疫佐剂。

实施方案48.实施方案47的方法，其中所述免疫佐剂与nelipepimut-S或其变体在同一或分开的制剂中一起给予。

实施方案49.实施方案47或48的方法，其中皮内给予所述免疫佐剂。

实施方案50.实施方案47至49中任一项的方法，其中所述免疫佐剂包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

实施方案51.实施方案49的方法，其中每天给予剂量为250mcg的GM-CSF。

实施方案52.实施方案46-50中任一项的方法，其中每3周(q3wk)给予所述免疫佐剂。

实施方案53.任何前述实施方案的方法，其中每三周，在完成曲妥珠单抗或衍生物输注后30-120分钟，皮内给予1,000mcg的nelipepimut-S或其变体和250mcg的GM-CSF。

实施方案54.任何前述实施方案的方法，其中所述nelipepimut-S包含由氨基酸序列KIFGSLAFL(SEQ ID NO:1)组成的HER2/neu肽，并且所述变体在SEQ ID NO:1的第4位具有α-氨基丁酸、正缬氨酸或正亮氨酸，在SEQ ID NO:1的第7位具有α-氨基丁酸、正缬氨酸或正亮氨酸，或在SEQ ID NO:1的第8位具有异苯丙氨酸。

实施方案55.实施方案54的方法，其中给予nelipepimut-S的变体，且所述变体选自：

K I F Abu S L A F L(SEQ ID NO:2)；

K I F Nva S L A F L(SEQ ID NO:3)；

K I F Nle S L A F L(SEQ ID NO:4)；

K I F G S L Abu F L(SEQ ID NO:5)；

K I F G S L Nva F L(SEQ ID NO:6)；

K I F G S L Nle F L(SEQ ID NO:7)；和

K I F G S L A isoF L(SEQ ID NO:8)。

实施方案56.任何前述实施方案的方法，其中进行所述nelipepimut-S或其变体的给药代表初次接种，并且其中所述方法还包括在完成初次接种后，以比初次接种更低的频率，任选地与免疫佐剂(例如，GM-CSF)一起，施用1、2、3、4或更多次加强剂量的nelipepimut-S或其变体，最高达30个月或更久。

实施方案57.实施方案56的方法，其中给予两次或更多次加强剂量的nelipepimut-S或其变体，并且其中每6个月给予一次加强剂量。

实施方案58.任何前述实施方案的方法，其中所述方法还包括在进行曲妥珠单抗或其衍生物和nelipepimut-S或其变体的给药之前、期间或之后向个体给予另外的治疗剂。

实施方案59.实施方案58的方法，其中所述另外的治疗剂为免疫治疗剂。

实施方案60.实施方案59的方法，其中所述免疫治疗剂包括免疫检查点抑制剂。

实施方案61.任何前述实施方案的方法，其中所述给予减小了肿瘤尺寸和/或提高了个体的无病生存率(无复发生存率)。

实施方案62.任何前述实施方案的方法，其中在接受针对TNBC的治疗(例如，化学疗法、外科原发性肿瘤切除、放射疗法或前述的两种或更多种的组合)后，所述个体在所述给药时为临床无疾病，并且其中所述方法延迟或防止该个体中TNBC的复发。

实施方案63.任何前述实施方案的方法，其中将曲妥珠单抗或其衍生物和nelipepimut-S或其变体进行给药对个体具有协同作用。

实施方案64.任何前述实施方案的方法，其中向个体给予有效量的曲妥珠单抗和有效量的nelipepimut-S。

实施方案65.一种包含nelipepimut-S或其变体的药物，其与曲妥珠单抗或其衍生物组合使用，用于治疗个体中的三阴性乳腺癌。

实施方案66.实施方案65的药物，其还包含免疫佐剂。

实施方案67.实施方案65的药物，其中所述免疫佐剂包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

实施方案68.一种包含曲妥珠单抗或其衍生物的药物，其与nelipepimut-S或其变体组合使用，用于治疗个体中的三阴性乳腺癌(TNBC)。

实施方案69.一种包含第一容器、第二容器和药品说明书的试剂盒，其中所述第一容器包含至少一个剂量的包含曲妥珠单抗或其衍生物的药物，所述第二容器包含至少一个剂量的包含nelipepimut-S或其变体的药物，且药品说明书包含使用药物治疗个体的三阴性乳腺癌的说明。

实施方案70.实施方案69的试剂盒，其还包含免疫佐剂，其中所述免疫佐剂在第三容器中或与nelipepimut-S或其变体一起在第二容器中。

实施方案71.实施方案69或70的试剂盒，其中所述免疫佐剂包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

实施方案72.实施方案69或70的试剂盒，其中所述试剂盒包含曲妥珠单抗和nelipepimut-S。

应当理解的是，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且鉴于其的各种修饰或变化将提示于本领域技术人员并且包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。另外，本文公开的任何发明或其实施方案的任何要素或限制可以与本文公开的任何和/或全部其他元素或限制(单独地或以任何组合)或任何其他发明或其实施方案组合，并且全部这样的组合可以理解为具有本发明的范围，而不限于此。

参考文献

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PEOPLES, George E.

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SARLIS, Nicholas J.

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<130> SEL.101CXPCT

<150> 62/855,650

<151> 2019-05-31

<150> 62/748,511

<151> 2018-10-21

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> nelipepimut-S肽

<400> 1

Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> nelipepimut-S肽的变体

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Abu

<400> 2

Lys Ile Phe Ala Ser Leu Ala Phe Leu

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> nelipepimut-S肽的变体

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Nva

<400> 3

Lys Ile Phe Val Ser Leu Ala Phe Leu

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> nelipepimut-S肽的变体

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Nle

<400> 4

Lys Ile Phe Leu Ser Leu Ala Phe Leu

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> nelipepimut-S肽的变体

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Abu

<400> 5

Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> nelipepimut-S肽的变体

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Nva

<400> 6

Lys Ile Phe Gly Ser Leu Val Phe Leu

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> nelipepimut-S肽的变体

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Nle

<400> 7

Lys Ile Phe Gly Ser Leu Leu Phe Leu

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> nelipepimut-S肽的变体

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> 异苯丙氨酸

<400> 8

Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Xaa Leu

1 5

<210> 9

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗HER2轻链(1和2)

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 10

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗HER2重链(1和2)

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450