阅读说明：本技术 一种体外评价卡介苗对中性粒细胞活性影响的方法 (Method for evaluating influence of BCG (bacillus calmette guerin) on neutrophil activity in vitro ) 是由 陈炳地 黄鑫 乐文俊 崔征 于 2019-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种体外评价卡介苗对中性粒细胞活性影响的方法,至少包括如下步骤：提供培养板；在所述培养板上接种靶细胞；制备卡介苗悬液；将中性粒细胞和所述卡介苗悬液共同作用于所述靶细胞；向所述培养板中添加检测试剂。本发明在体外就可以确定中性粒细胞对卡介苗有无应答反应。(The invention discloses a method for evaluating influence of BCG on neutrophil activity in vitro, which at least comprises the following steps: providing a culture plate; seeding the target cells on the culture plate; preparing BCG vaccine suspension; allowing the neutrophil and the BCG suspension to act on the target cells together; adding a detection reagent to the culture plate. The invention can determine whether the neutral particle cell has response reaction to the BCG vaccine in vitro.)

一种体外评价卡介苗对中性粒细胞活性影响的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种体外评价卡介苗对中性粒细胞活性影响的方法。

背景技术

目前，若要确定卡介苗对癌细胞的作用效果，通常需要采用灌注法注入到人体中，这样会存在高的风险率，对人体有伤害。本发明提出一种体外评价卡介苗对中性粒细胞活性影响的方法，在体外就可以确定中性粒细胞对卡介苗有无应答反应，从而根据个体情况合理选择是否使用卡介苗。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种体外评价卡介苗对中性粒细胞活性影响的方法，能根据中性粒对靶细胞的作用活性，体外判断中性粒细胞对卡介苗有无应答，从而体外鉴定了卡介苗对个体的作用效果。

为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现的，一种体外评价卡介苗对中性粒细胞活性影响的方法，至少包括如下步骤：

提供培养板；

在所述培养板上接种靶细胞；

制备卡介苗悬液；

将中性粒细胞和所述卡介苗悬液共同作用于所述靶细胞；

向所述培养板中添加检测试剂；

检测所述培养板中吸光度的变化；

根据所述吸光度的变化评价所述卡介苗对中性粒细胞活性的影响。

在一实施例中，所述制备卡介苗悬液的步骤包括：

将卡介苗接种于液体培养基中进行培养；

测量所述液体培养基中的OD600值；

待所述OD600值达到2.0-2.1值或以上时，收集所述液体培养基中的卡介苗并进行离心处理，获得上清液和沉淀层；

吸弃所述上清液，通过细胞培养基重悬所述沉淀层，获得所述卡介苗悬液。

在一实施例中，在将所述卡介苗接种于所述液体培养基中后，培养条件为在35-37℃培养5-14天。

在一实施例中，所述细胞培养基与接种所述靶细胞的培养基为同一类型的培养基，接种所述靶细胞的培养基位于所述培养板内。

在一实施例中，获得所述中性粒细胞的步骤包括：

配制若干组浓度梯度的淋巴细胞分离液；

将所述若干组浓度梯度淋巴细胞分离液按照浓度从大到小的顺序加入到离心管中，使浓度最小的淋巴细胞分离液位于所述离心管的最上层；

采集1-2ml外周血并稀释1-3倍，获得稀释后的外周血；

取1-4ml所述稀释后的外周血加入到所述浓度最小的淋巴细胞分离液上；

利用所述若干组浓度梯度的淋巴细胞分离液，通过分离提取步骤获得所述中性粒细胞。

在一实施例中，所述淋巴细胞分离液的组数为5-8组。

在一实施例中，所述卡介苗悬液中的卡介苗、所述中性粒细胞和所述靶细胞之间的作用比例为(500-2000)：(3-20)：1。

在一实施例中，所述培养板为96孔细胞培养板。

在一实施例中，在所述培养板上接种靶细胞的步骤中，所述靶细胞的密度为8000-12000细胞/孔。

在一实施例中，所述检测试剂为细胞增殖/毒性检测试剂、噻唑蓝试剂或台盼蓝试剂中的一种。

在本发明中，可体外检测出不同受试者的中性粒细胞经卡介苗刺激后，癌细胞存活率的变化。本发明可简便快速地在体外筛选出对卡介苗有无应答者，从而根据个体情况合理选择是否使用卡介苗，大大降低了卡介苗在人体中的使用风险并起到了很好的防范作用。本发明的方法具有对受试者创伤小、血液用量少、操作简单、高重复性、可批量操作等优点。本发明填补了技术领域的空白，是首次用此方法来评价在体外对中性粒细胞对卡介苗的应答反应，进而为个体是否需要使用卡介苗提供参考依据。

附图说明

图1为本发明一实施例的实验流程示意图；

图2为本发明一实施例中针对第一种中性粒细胞，考察卡介苗、中性粒细胞及癌细胞共孵育后，癌细胞的存活率；

图3为本发明一实施例中针对第二种中性粒细胞，考察卡介苗、中性粒细胞及癌细胞共孵育后，癌细胞的存活率；

图4为本发明一实施例中针对第三种中性粒细胞，考察卡介苗、中性粒细胞及癌细胞共孵育后，癌细胞的存活率。

具体实施方式

以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本发明通过在体外确定中性粒细胞对卡介苗的应答结果，从而根据个体情况合理选择是否使用卡介苗，大大降低了卡介苗的使用风险并起到了很好的防范作用。

如图1所述，本发明提供一种体外评价卡介苗对中性粒细胞活性影响的方法，至少包括如下步骤：

S1、提供培养板；

S2、在所述培养板上接种靶细胞；

S3、制备卡介苗悬液；

S4、将中性粒细胞和所述卡介苗悬液共同作用于所述靶细胞；

S5、向所述培养板中添加检测试剂；

S6、检测所述培养板中吸光度的变化；

S7、根据所述吸光度的变化评价所述卡介苗对中性粒细胞活性的影响。

具体的，在S1步骤中，所述培养板例如为96孔细胞培养板，培养板上含有接种相应靶细胞对应的培养基。

具体的，在S2步骤中，将靶细胞以8000-12000细胞/孔的密度，接种于培养板例如96孔培养板中，培养板中加入细胞培养基(此处的细胞培养基与制备卡介苗悬液中重悬卡介苗的细胞培养基是同一类型的细胞培养基，因为每种癌细胞会对应不同的培养基)，于35-37℃培养12-24小时。

具体的，在S3步骤中，制备卡介苗悬液的步骤包括：将卡介苗接种于20-30ml液体培养基中进行培养，此处液体培养基例如为7H9培养基，在35-37℃培养5-14天；测量所述液体培养基中的OD600值；待所述OD600值达到2.0-2.1值或以上时，收集所述液体培养基中的卡介苗并进行离心处理，离心的条件例如为以3000-3500rpm的转速离心5-10分钟，获得上清液和沉淀层；吸弃所述上清液，通过细胞培养基重悬所述沉淀层，细胞培养基的体积例如为10-20ml，获得所述卡介苗悬液。

具体的，在S3步骤中，在制备卡介苗悬液的同时，需要检测卡介苗悬液的细菌浓度，便于后续计算卡介苗、中性粒细胞和癌细胞之间的作用比例。具体步骤为：

(1)将卡介苗悬液以含10-20％胎牛血清的高糖改良伊格尔培养基分别稀释5-1000倍中的某些倍数，检测OD600值；

(2)分别从稀释5-1000倍中的某些倍数的稀释液中，吸取100-150ul菌液，接种于Middlebrook 7H11琼脂培养基上，35-37℃培养2-3周；

(3)计数琼脂培养基上卡介苗菌落数，以不同稀释倍数下，OD600值为横坐标，不同稀释倍数的菌液浓度为纵坐标，绘制标准曲线；

(4)后续实验中，将待测浓度的卡介苗悬液的光密度值，带入所得标准曲线中，便可计算出其对应的细菌浓度。

具体的，在S4步骤中，获得所述中性粒细胞的步骤包括：配制若干组浓度梯度的淋巴细胞分离液；将所述若干组浓度梯度淋巴细胞分离液按照浓度从大到小的顺序加入到离心管中，使浓度最小的淋巴细胞分离液位于所述离心管的最上层；采集1-2ml外周血并稀释1-3倍，获得稀释后的外周血；取1-4ml所述稀释后的外周血加入到所述浓度最小的淋巴细胞分离液上；利用所述若干组浓度梯度的淋巴细胞分离液，通过分离提取步骤获得所述中性粒细胞。所述淋巴细胞分离液的组数为5-8组。所述卡介苗悬液中的卡介苗、所述中性粒细胞和所述靶细胞之间的作用比例为(500-2000)：(3-20)：1。

具体的，在S5步骤中，所述检测试剂为细胞增殖/毒性检测试剂、噻唑蓝试剂或台盼蓝试剂中的一种。

在一个实施例中，提取例如人外周血中的中性粒细胞的具体过程为：配制5-8组不同密度的淋巴细胞分离液，例如为Percoll淋巴细胞分离液，以配制5组为例，分别为：第一组的密度>第二组的密度>第三组的密度>第四组的密度>第五组的密度，第一组密度为70％-75％的Percoll淋巴细胞分离液，第二组密度为60％-63％的Percoll淋巴细胞分离液，第三组密度为45％-55％的Percoll淋巴细胞分离液，第四组密度为36％-40％的Percoll淋巴细胞分离液，第五组密度为10％-25％的Percoll淋巴细胞分离液，然后分别吸取第一组、第二组、第三组、第四组、第五组各1-2mL，依次加入离心管中；采集例如人类外周血1-2ml，用磷酸缓冲盐溶液PBS稀释1-3倍，吸取1-4mL稀释后的外周血，加于第五组之上，以500-1000rpm的转速离心30-60分钟，本次离心，能将Percoll淋巴细胞分离液与中性粒细胞分离，获得中性粒细胞层，吸取所述中性粒细胞层并加入体积为所述中性粒细胞层10-20倍的细胞培养基例如为含10-20％胎牛血清的高糖改良伊格尔培养基，离心5-10分钟，去掉离心后的上层溶液，在下层沉淀中加入0.5-50ml细胞培养基例如含体积分数10-20％胎牛血清的高糖改良伊格尔培养基，使中性粒细胞处于悬浮状态，在悬浮状态下，利用自动细胞计数仪计数中性粒细胞，计数的目的是为了后续计算卡介苗、中性粒细胞和癌细胞之间的作用比例。本发明的方法具有对受试者创伤小、血液用量少、操作简单、重复性好、可批量操作等优点。

制备卡介苗悬液的具体步骤为：将卡介苗菌种接种于20-25mL的培养基中例如7H9培养基，于37℃培养5-14天，每3-5天测量一次OD600，直到OD600达2.0-2.1值或达到2.0-2.1以上(此处OD600值指在600nm波长处的光密度值)；接着，将卡介苗悬液以磷酸盐缓冲液PBS稀释不同倍数，同时测量稀释后的OD600值并记录，并接种于Middlebrook 7H11琼脂培养基，37℃培养2-4周，计数琼脂培养基上卡介苗菌落数，绘制标准曲线。收集所述培养基中的细菌，于室温下，以3000-3500rpm转速离心5-10分钟，获得上清液和下层沉淀，吸弃上清液，以10-20mL含10-20％胎牛血清的高糖改良伊格尔培养基重悬下层沉淀即卡介苗，获得卡介苗悬液，并测量此时的OD600，从而根据标准曲线计算卡介苗浓度，此处计算卡介苗浓度是为了后续计算卡介苗、中性粒细胞和癌细胞之间的作用比例。卡介苗的培养过程是非常困难的，本发明的这种制备卡介苗悬液的方法，使得培养的卡介苗存活率较高，能更好的为本发明的体外评价方法提供便利。

中性粒细胞、卡介苗与靶细胞例如癌细胞体外共孵育的具体过程为：将癌细胞例如人***细胞HeLa、人膀胱癌细胞5637或者人膀胱癌细胞J82，以8000-12000细胞/孔的密度，接种于培养板例如96孔细胞培养板中，培养板中加入细胞培养基(此处的细胞培养基与制备卡介苗悬液中重悬卡介苗的细胞培养基是同一类型的细胞培养基，因为每种癌细胞会对应不同的培养基)，于例如35-37℃培养12-24小时，温度以人体温度最适宜；吸弃细胞培养基，用磷酸盐缓冲液PBS洗2-3次，将卡介苗悬液及所得人类中性粒细胞加入癌细胞中，于35-37℃培养12-24小时，其中，卡介苗、中性粒细胞和癌细胞之间的作用比例为(500-2000)：(3-20)：1。本发明采用中性粒细胞、卡介苗与靶细胞共孵育的目的是充分模拟体内环境，避免其他因素造成的结果偏差，利用96孔细胞培养板，人为模拟例如人体的膀胱环境，使实验结果接近体内真实结果，结果的可信程度高。

检测癌细胞存活率的具体过程为：吸弃培养板例如96孔细胞培养板中的细胞培养基、人中性粒细胞及卡介苗，并用磷酸盐缓冲液PBS洗2-3次，将检测试剂例如为WST-1细胞增殖/毒性检测试剂以1:(10-15)的比例，加入含10-20％胎牛血清的高糖改良伊格尔培养基中，吹打混匀，获得稀释后的检测溶液；将稀释后检测溶液加入96孔细胞培养板中，每孔110-220μL，并于35-37℃培养0.5-4小时，然后利用酶标仪在波长420-480nm处，检测光密度值，并计算癌细胞存活率。WST-1是MTT的一种升级替代产品，其优点在于，MTT被细胞线粒体中脱氢酶还原生成的甲瓒是不溶于水的，后续需要增加溶解步骤，较为麻烦；WST-1、XTT、MTS被细胞线粒体中脱氢酶还原生成的甲瓒是水溶性的，可省去后续溶解步骤；但WST-1生成的甲瓒比XTT、MTS都更容易溶解；其次，WST-1比XTT、MTS更加稳定；最后，WST-1比XTT、MTT线性范围更宽，灵敏度更高，这里，WST-1、MTT、XTT、MTS均为细胞增殖及毒性检测试剂。

癌细胞存活率计算的具体过程为：接种癌细胞、中性粒细胞、有或无卡介苗的实验孔的吸光度以字母A表示；只接种癌细胞的实验孔的吸光度以字母B表示；只接种中性粒细胞、有或无卡介苗的实验孔的吸光度以字母C表示；不接种任何细胞的空白孔的吸光度以字母D表示，则癌细胞的存活率＝(A-C)/(B-D)×100％。

运用本发明的方法，对正常癌细胞、经中性粒细胞共孵育后的癌细胞、经卡介苗及中性粒细胞共孵育后的癌细胞存活率加以检测对比。结果如图2-图4所示。

本发明对3种中性粒细胞进行了考察，这3种中性粒细胞来源于3个不同的受试者，请参阅图2，实验结果显示，对于第一种中性粒细胞而言，该中性粒细胞来源的受试者为膀胱癌患者，其中性粒细胞可显著抑制人***细胞HeLa、人膀胱癌细胞5637及人膀胱癌细胞J82的存活率。加入卡介苗后，其中性粒细胞对人***细胞HeLa及5人膀胱癌细胞5637存活率的抑制效果更为显著，但对人膀胱癌细胞J82存活率的抑制效果没有显著提升作用。综合3种靶细胞的结果，第一种中性粒细胞经卡介苗刺激后，其对67％的靶细胞显示阳性结果。因此，体外检测评价结果判断，提供第一种中性粒细胞的受试者可以使用卡介苗，并且效果显著。临床治疗结果与本发明的方法显示的针对该患者的体外检测判断结果相一致，这进一步验证了本发明的方法的准确可靠性。

请参阅图3，实验结果显示，对于第二种中性粒细胞而言，该中性粒细胞来源的受试者也为膀胱癌患者，其中性粒细胞可显著抑制人***细胞HeLa、人膀胱癌细胞5637及人膀胱癌细胞J82的存活率。加入卡介苗后，其中性粒细胞对3种靶细胞存活率的抑制效果均无显著提升作用。体外检测评价结果判断，提供第二种中性粒细胞的受试者则不需要考虑使用卡介苗。临床治疗结果与本发明的方法显示的针对该患者的体外检测判断结果相一致，这进一步验证了本发明的方法的准确可靠性。

请参阅图4，实验结果显示，对于第三种中性粒细胞而言，该中性粒细胞来源的受试者也为膀胱癌患者，其中性粒细胞可显著抑制人***细胞HeLa及人膀胱癌细胞J82的存活率，但对人膀胱癌细胞5637的存活率无显著抑制作用。加入卡介苗后，其中性粒细胞对人***细胞HeLa存活率的抑制效果更为显著，但对人膀胱癌细胞5637存活率的抑制效果没有显著提升作用。综合3种靶细胞的结果，第三种中性粒细胞经卡介苗刺激后，其对67％的靶细胞显示阳性结果。因此，体外检测评价结果判断，第三种中性粒细胞对卡介苗有良好的应答反应。临床治疗结果也与本发明的方法显示的针对该患者的体外检测评价结果相一致，这进一步验证了本发明的方法的准确可靠性。

本发明的靶细胞包括膀胱癌细胞、***细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、***癌细胞、甲状腺癌细胞、卵巢癌细胞、淋巴癌细胞、肾癌细胞、胃癌细胞、肠癌细胞、胰腺癌细胞、骨癌细胞、黑色素瘤细胞或白血病癌细胞中的一种。

本发明可体外检测出不同受试者的中性粒细胞经卡介苗刺激后，癌细胞存活率的变化。本发明可简便快速地在体外筛选出对卡介苗有无应答者，从而根据个体情况合理选择是否使用卡介苗，为受体是否适合使用卡介苗提供参考依据，降低了卡介苗在人体中的风险并起到了很好的防范作用。本发明填补了技术领域的空白，是首次用此方法来评价在体外对中性粒细胞对卡介苗的应答反应。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以***其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。