一种检测细菌数量的方法
阅读说明：本技术 一种检测细菌数量的方法 (Method for detecting bacterial quantity ) 是由 贺令娟 程菊红 伍凤祥 于 2019-11-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种检测细菌数量的方法,涉及微生物检测技术领域。所述检测细菌数量的方法,在观察计数前先对样品进行一系列的处理,再采用扫描电子显微镜进行成像计数,在一系列的处理中,固定处理避免了计数过程中细菌运动导致计数不准确的问题,同时固定处理还可以避免由于气压和电子束轰击等导致细菌结构易变形的问题；利用扫描电子显微镜成像计数,可以直接利用样品表面材料的物质性能进行微观成像,对细菌浓度没有要求,且可以放大几十到上百万倍,基本上对细菌大小没有限制,同时扫描电子显微镜自带测量尺寸的功能,可以快捷地测量细菌的尺寸,且识别率高,能够区分微生物与微小杂物,在计数时将微小杂物排除,提高了计数的准确度。(The invention discloses a method for detecting the number of bacteria, and relates to the technical field of microbial detection. According to the method for detecting the number of bacteria, a series of treatments are carried out on a sample before observation and counting, then an imaging counting is carried out by adopting a scanning electron microscope, in the series of treatments, the problem of inaccurate counting caused by bacterial movement in the counting process is avoided by fixing treatment, and meanwhile, the problem of easy deformation of a bacterial structure caused by air pressure, electron beam bombardment and the like can also be avoided by fixing treatment; utilize scanning electron microscope imaging count, can directly utilize the material performance of sample surface material to carry out the microcosmic formation of image, do not have the requirement to bacterium concentration, and can enlarge dozens to millions of times, do not have the restriction to the bacterium size basically, scanning electron microscope is from taking the function of measuring size simultaneously, can swiftly measure the size of bacterium, and the recognition rate is high, can distinguish microorganism and small debris, gets rid of small debris when the count, has improved the degree of accuracy of count.)
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种利用场发射扫描电子显微镜成像检测细菌数量的方法。
背景技术
目前，微生物计数方法分为直接计数法、间接计数法，微生物显微镜直接计数法是将微生物均匀菌液滴至干净的血球计数板上，然后置于显微镜下，将微生物放大至合适的倍数，肉眼观察，进行计数的方法。
微生物显微镜直接计数法具有以下缺点：①不适用于对运动细菌的计数；②需要相对高的细菌浓度；③个体小的细菌在显微镜下难以观察，仅适用于菌体偏大的菌体或孢子；④菌体大小测定过程麻烦；⑤微小杂物亦可能被计算在内，使结果偏高；⑥不能区别活菌与死菌，使活菌计数的结果偏高；这些缺点使微生物显微镜直接计数法具有一定的局限性。
发明内容
针对现有技术中微生物显微镜直接计数法存在的缺陷，本发明提供一种检测细菌数量的方法，以解决背景技术中微生物显微镜直接计数法所存在的缺陷。
本发明是通过如下的技术方案来解决上述技术问题的：一种检测细菌数量的方法，包括以下步骤：
步骤1：称取适量样品，对样品进行溶解稀释处理，再离心处理后弃除上清液；
步骤2：对步骤1处理后的样品液进行固定处理，再离心处理后弃除上清液；
步骤3：对步骤2处理后的样品液进行漂洗处理，再离心处理后弃除上清液；
步骤4：对步骤3处理后的样品液进行脱水处理，再离心处理后弃除上清液；
步骤5：对步骤4处理后的样品液进行超声分散处理，取适量的样品进行喷金处理，得到待观察的样品；
步骤6：将待观察的样品放入场发射扫描电子显微镜的样品室内，进行成像计数，得到单位样品中细菌的数量。
本发明所述的方法，在成像计数前先对样品进行一系列的处理，再采用扫描电子显微镜进行成像计数，在一系列的处理中，固定处理避免了计数过程中细菌运动导致计数不准确的问题，同时固定处理还可以避免由于气压和电子束轰击等导致细菌结构易变形的问题；利用扫描电子显微镜成像计数，可以直接利用样品表面材料的物质性能进行微观成像，对细菌浓度没有要求，且可以放大几十到上百万倍，基本上对细菌大小没有限制，同时扫描电子显微镜自带测量尺寸的功能，可以快捷地测量细菌的尺寸，且识别率高，能够区分微生物与微小杂物，在计数时将微小杂物排除，提高了计数的准确度；在步骤1至4中，均进行离心处理后弃除上清液以提高细菌的浓度，使在观察时细菌充盈样品室，提高了细菌数量的检测精度。
进一步地，所述步骤1中，采用磷酸盐缓冲液对样品进行溶解稀释处理，调节细菌的pH值，使细菌保持恒定的pH值，以便在细菌最佳状态下进行观察。
进一步地，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.4。
进一步地，所述磷酸盐缓冲液的配制方法为：在1.36g磷酸二氢钾中加入0.1mol/L氢氧化钠溶液79ml，用水稀释至200ml，即得pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
进一步地，所述步骤2中，采用2.5%磷酸缓冲戊二醛固定液对样品进行固定处理，具体的固定处理步骤为：
2.1、将2.5%磷酸缓冲戊二醛固定液注入样品中，充分均匀，密封，冷藏时间为1～2小时，冷藏温度为0～5°C；
2.2、对冷藏后的样品进行超声分散处理，再继续进行冷藏，冷藏时间为1～2小时，冷藏温度为0～5°C。
进一步地，所述2.5%磷酸缓冲戊二醛固定液是由25%戊二醛、无菌水、磷酸盐缓冲液按体积比为1:4:5配制而成的。
进一步地，所述步骤4中，依次采用质量百分比浓度为30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇进行梯度离心脱水，每个梯度的离心脱水时间为8～15min。
进一步地，所述步骤5的具体操作过程为：在步骤4处理后的样品液中加入质量百分比浓度为100%的乙醇，进行超声分散5～10min，再取适量样品置于粘有导电胶的扫描电子显微镜的样品台上，进行抽真空干燥处理，然后再进行喷金处理，以备观察。
进一步地，所述步骤6中，单位样品中细菌的数量的计算公式为：
其中，U为单位样品中细菌的数量，单位为CFU/g，X为扫描电子显微镜中细菌的计数总量，单位为CFU，a为样品的稀释倍数，单位为ml，m为步骤1的取样量，单位为g，l为步骤5中的取样量，单位为ml。
有益效果
与现有技术相比，本发明所提供的一种检测细菌数量的方法，在观察计数前先对样品进行一系列的处理，再采用扫描电子显微镜进行成像计数，在一系列的处理中，固定处理避免了计数过程中细菌运动导致计数不准确的问题，同时固定处理还可以避免由于气压和电子束轰击等导致细菌结构易变形的问题；利用扫描电子显微镜成像计数，可以直接利用样品表面材料的物质性能进行微观成像，对细菌浓度没有要求，且可以放大几十到上百万倍，基本上对细菌大小没有限制，同时扫描电子显微镜自带测量尺寸的功能，可以快捷地测量细菌的尺寸，且识别率高，能够区分微生物与微小杂物，在计数时将微小杂物排除，提高了计数的准确度。
具体实施方式
下面对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以市售的益生菌（2g/支，标识乳酸菌200亿单位，即100亿CFU/g）为例，来说明本发明提出的一种检测细菌数量的方法，包括以下步骤：
1、称取0.01g益生菌，用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液将益生菌溶解稀释至合适的溶度（该溶度由粘有导电胶的样品台上细菌的数量来决定）后，进行离心处理。
pH值为7.4的磷酸盐缓冲液的具体配制方法为：在1.36g磷酸二氢钾中加入0.1mol/L氢氧化钠溶液79ml，用水稀释至200ml，即得pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。采用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液进行溶解稀释，可以使样品中的益生菌保持恒定的pH值，以便在细菌最佳状态下进行观察。为了减少磷酸盐缓冲液的使用量，具体的溶解稀释步骤为：用磷酸盐缓冲液将0.01g样品稀释至10ml，摇匀得到第一稀释样品液；取1ml第一稀释样品液加入到9ml磷酸盐缓冲液中，摇匀得到第二稀释样品液；取1ml第二稀释样品液加入到9ml磷酸盐缓冲液中，摇匀得到第三稀释样品液；取1ml第三稀释样品液加入到9ml磷酸盐缓冲液中，摇匀得到第四稀释样品液；取1ml第四稀释样品液加入到9ml磷酸盐缓冲液中，摇匀得到第五稀释样品液，再对第五稀释样品液进行离心处理。
溶解稀释所用容器为已灭菌的10ml刻度的离心管，在后续处理步骤（步骤1至5）中，样品液均于离心管内再进行相应的处理，避免了样品液在处理过程中需要转移而造成的污染和误差。
离心处理选用市售的离心机，以1500r/min的转速离心处理8min，沉淀后弃除上清液，取沉淀后的样品液以便进行下一步操作。
2、对步骤1离心处理后的样品液进行固定处理，再离心处理后弃除上清液。
在合适的环境条件下，生物样品一般不需要固定即可在扫描电子显微镜中观察。但是由于气压和电子束轰击等原因，细菌这类含水量高的生物样品在扫描电子显微镜观察时间太长，其结构容易变形。采用化学物质进行固定可使细菌的组织和细胞成分产生交联作用，形成相对稳定的支架，使其不易变形。因此，细菌样品需考虑先用化学物质进行固定后再在扫描电子显微镜中观察。
采用2.5%磷酸缓冲戊二醛固定液对样品进行固定，具体的固定处理步骤为：
2.1、用吸管将1ml，2.5%磷酸缓冲戊二醛固定液注入至装有步骤1处理后样品液的离心管中，充分摇匀，使菌体与固定液充分接触，盖上盖子密封，放入冰箱冷藏室内，冷藏时间为1小时，冷藏温度为3°C；
2.2、为了防止细菌在静止冷藏过程中沉积而与2.5%磷酸缓冲戊二醛固定液接触不完全，应取出离心管，将离心管放入盛有水的小烧杯中（离心管的管口朝上，烧杯中的水以超声时烧杯在超声波清洗仪中不倒且水不进入离心管内为宜），将载有离心管的烧杯放入25kHZ超声波清洗仪的水槽中，超声10min，再继续放入冷藏室内进行冷藏，冷藏时间为1小时，冷藏温度为3°C；
2.3、取出离心管，以1500r/min的转速离心处理10min，菌体沉淀后弃除上清液，取沉淀后的样品液以便进行下一步操作。
2.5%磷酸缓冲戊二醛固定液对细菌结构保存较好，避免了细菌结构易变形，2.5%磷酸缓冲戊二醛固定液是由25%戊二醛、无菌水、磷酸盐缓冲液按体积比为1:4:5配制而成的。无菌水是将100mL水加入200mL或250mL的三角瓶中，加棉塞、包扎、高压灭菌而得到。
3、对步骤2离心处理后的样品液进行漂洗处理，再离心处理后弃除上清液。
漂洗处理的目的是避免附着在样品上的残余固定液与步骤4将用到的脱水剂进行反应而破坏样品表面的真实形貌，漂洗的具体方法：将磷酸盐缓冲液注入装有样品的离心管中，盖上盖子反复振动3～5min，以1500r/min离心8min，沉淀后弃除上清液，重复操作该步骤3次，得到步骤3处理后的样品液，以便进行下一步操作。
4、对步骤3处理后的样品液进行脱水处理，再离心处理后弃除上清液。
依次分别取10ml质量百分比浓度为30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇对步骤3处理后的样品液进行梯度离心脱水，每个梯度的离心脱水时间为10min。在梯度离心脱水后，再以1500r/min的转速离心处理8min，沉淀后弃除上清液，取沉淀后的样品液以便进行下一步操作。梯度离心脱水处理使样品中细菌的有序结构不被破坏，便于后续有效的观察。
5、在步骤4处理后的样品液中加入100%的乙醇至10ml，于25kHZ超声波清洗仪中进行超声分散5min，再用微量进样器取0.05ml（即50微升，50CFU）样品置于粘有导电胶的扫描电子显微镜的样品台上，放入喷金仪中进行抽真空干燥处理（干燥时间为5min），然后再进行喷金处理，以备观察。喷金处理使样品中的细菌导电性良好，便于后续成像的稳定性。细菌数量少计数误差大，细菌数量多难以计数，因此粘有导电胶的样品台上细菌的数量以30~100CFU为宜。
6、将待观察的样品放入场发射扫描电子显微镜的样品室内，选用15kV加速电压，经过调焦、消像散后进行成像计数，统计整个导电胶上细菌的总量X，得到单位样品中细菌的数量，单位样品中细菌的数量U为：
本发明检测细菌数量的方法，在成像计数前先对样品进行一系列的处理，再采用扫描电子显微镜进行成像计数，在一系列的处理中，固定处理避免了计数过程中细菌运动导致计数不准确的问题，同时固定处理还可以避免由于气压和电子束轰击等导致细菌结构易变形的问题；利用扫描电子显微镜成像计数，可以直接利用样品表面材料的物质性能进行微观成像，对细菌浓度没有要求，且可以放大几十到上百万倍，基本上对细菌大小没有限制，同时扫描电子显微镜自带测量尺寸的功能，可以快捷地测量细菌的尺寸，且识别率高，能够区分微生物与微小杂物，在计数时将微小杂物排除，提高了计数的准确度；由于稀释、固定、漂洗、以及脱水处理降低了样品液的浓度，使单位样品中细菌的数量下降，因此，在步骤1至4中均进行离心处理后弃除上清液以提高单位样品中细菌的数量，使在观察时细菌充盈样品室，提高了细菌数量的检测精度。
以上所揭露的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或变型，都应涵盖在本发明的保护范围之内。