阅读说明：本技术 绿原酸化合物在制备治疗由don引起炎症的药物中应用 (Application of chlorogenic acid compound in preparing medicine for treating inflammation caused by DON ) 是由 尹清强 许小向 常娟 王平 卢富山 王潇 刘超齐 宋安东 李茂龙 李慧娟 耿启泉 于 2019-12-03 设计创作，主要内容包括：本发明实施例公开了式I所示的绿原酸化合物及其药学上可接受的盐类,在制备治疗由DON引起的炎症的药物中应用。本发明实施例的绿原酸对呕吐毒素诱导猪肠道上皮细胞炎症和凋亡的保护作用。随着DON浓度的增加及培养时间的延长,细胞活力显著降低。CGA可以显著增加细胞活力、减少乳酸脱氢酶(LDH)释放和细胞凋亡率。此外,CGA还可以显著下调由DON诱导的猪肠道上皮细胞(IPEC-J2)中IL-6、IL-8、TNF-α、COX-2、Bax、Caspase 3和ASCT2基因的相对表达量,并显著上调由DON诱导的IPEC-J2细胞中ASCT2、ZO-1、Occludin、Claudin-1、PePT1和GLUT2基因的表达。本发明实施例的CGA可以减轻DON诱导IPEC-J2细胞的细胞毒性、炎症和凋亡,保护肠道的完整性和动物的健康。(The embodiment of the invention discloses application of a chlorogenic acid compound shown in a formula I and pharmaceutically acceptable salts thereof in preparing a medicament for treating inflammation caused by DON, wherein the chlorogenic acid compound has a protective effect on vomitoxin-induced porcine intestinal epithelial cell inflammation and apoptosis, and the cell viability is remarkably reduced along with the increase of DON concentration and the extension of culture time.)

绿原酸化合物在制备治疗由DON引起炎症的药物中应用

技术领域

本发明实施例涉及生物医药技术领域，具体涉及一种绿原酸在制备治疗由DON引起的炎症的药物中应用。

背景技术

脱氧雪烯醇(Deoxynivalenol,DON)，又称呕吐毒素，是由赤霉病菌(Fusariumgraminearum)和赤霉病菌(Fusarium culmorum)等真菌产生的一种B型三孢菌毒素。呕吐毒素普遍存在于世界各地的小麦、玉米、燕麦、大麦、饼粕类和酒糟等谷物和饲料中作物，被动物体采食后可以产生广泛的毒性效应，对人类和动物的健康构成潜在威胁。据报道，DON及其衍生物可能通过食用受污染的食物和水、吸入或皮肤接触传染给人体。研究发现在饲喂含有不同DON含量的日粮的猪中也检测到了残留的DON及其代谢产物。当动物体长期接触DON，会导致呕吐、拒绝食物、减少采食量、发育迟缓、腹泻、免疫系统疾病、神经系统疾病，并最终导致死亡。

在常见的家畜中，猪是与人类敏感性最相关的动物模型，且对DON的敏感性最高。而肠道是集消化、吸收、内分泌、免疫和防御功能于一体的器官，易于受到毒素、细菌、抗营养因子等有害物质的损伤。而且肠道是DON的主要靶标，可能会发生各种肠道疾病。腹泻是一种常见的肠道疾病，每年可导致断奶仔猪的死亡率约为5％。有报道称，DON可以通过增加与炎症和细胞凋亡相关基因的表达来诱导IPEC-J2细胞凋亡和炎症。因此，寻找一种有效物质来减轻DON引起的炎症和凋亡以维持肠道健康是非常有必要的。

酚酸在体外防御植物真菌病原体和抑制各种霉菌毒素的产生具有重要的作用。绿原酸(CGA)是植物经光合作用合成的一种苯丙素类似物，是杜仲、金银花等中药材的主要活性成分。

综上所述，如何研发一种可减轻或治疗由于DON诱导的肠道炎症的药物，是亟待要解决的技术问题。

发明内容

为此，本发明实施例提供绿原酸化合物在制备治疗由DON引起的炎症的药物中应用，以解决现有技术中缺乏有效减轻或治疗由DON诱导肠道炎症药物的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

式I所示的绿原酸化合物及其药学上可接受的盐类，在制备治疗由DON引起的炎症的药物中应用。

优选的，所述炎症为DON诱导的肠道上皮细胞炎症。

优选的，所述绿原酸化合物用于上调DON诱导的IPEC-J2细胞中IL-8基因mRNA的表达丰度，下调TNF-α基因mRNA的表达丰度。

优选的，所述绿原酸化合物用于下调DON诱导的IPEC-J2细胞中Bcl-2基因mRNA丰度的表达，上调DON诱导的IPEC-J2细胞中紧密连接蛋白的mRNA丰度。

优选的，所述绿原酸化合物用于上调DON诱导的IPEC-J2细胞中PepT1丰度，并促进上调葡萄糖转运蛋白mRNA的丰度。

优选的，其中，所述绿原酸化合物或其药学上可接受的盐有效剂量组成的药物组合物，其中含有一个或多个药学上可接受的药物载体。

优选的，稀释剂、赋形剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂。

优选的，其中，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊、口服液、注射剂、粉剂或膏剂。

本发明实施例中，所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明药物组合物的形式通过口服，鼻吸入、直肠或者肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明实施例具有如下优点：

本发明实施例的绿原酸(CGA)对呕吐毒素(DON)诱导猪肠道上皮细胞炎症和凋亡的保护作用。随着DON浓度的增加及培养时间的延长，细胞活力显著降低。CGA可以显著增加细胞活力、减少乳酸脱氢酶(LDH)释放和细胞凋亡率。此外，CGA还可以显著下调由DON诱导的猪肠道上皮细胞中IL-6、IL-8、TNF-α、COX-2、Bax、Caspase 3和ASCT2基因的相对表达量，显著上调ASCT2、ZO-1、Occludin、Claudin-1、PePT1和GLUT2基因的表达。本发明实施例的CGA可以减轻DON诱导IPEC-J2细胞的细胞毒性、炎症和凋亡，保护肠道的完整性和动物的健康。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明实施例提供的不同浓度DON和时间对IPEC-J2细胞活力的影响图，其中，标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P＞0.05)；

图2为本发明实施例提供的CGA减轻DON引起的细胞毒性图，其中(A)不同浓度的CGA对DON引起细胞毒性的缓解作用；(B)不同处理组对LDH释放率的影响，标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P＞0.05)；

图3为本发明实施例提供的图CGA缓解DON引起的细胞凋亡图，其中，(A)流式细胞术分析Annexin V/FITC/PI染色凋亡细胞，红色、绿色、蓝色和粉红色分别代表晚期凋亡细胞率(Q1)、坏死细胞率(Q2)、存活细胞率(Q3)和早期凋亡细胞率(Q4)；(B)晚期凋亡细胞率、坏死细胞率、存活细胞率和早期凋亡细胞率的统计分析。标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P＞0.05)；

图4为本发明实施例的CGA对DON诱导的细胞炎症基因相对mRNA丰度的影响图，其中，标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P＞0.05)。

图5为本发明实施例的CGA对DON诱导的细胞凋亡基因相对mRNA表达丰度的影响图，其中，标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P＞0.05)。

图6为本发明实施例的CGA对DON诱导的紧密连接蛋白基因相对mRNA表达丰度的影响图，其中，标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P＞0.05)；

图7为本发明实施例的CGA对DON诱导的营养转运基因相对mRNA表达丰度的影响图，其中，标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P＞0.05)。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中，试验材料：CGA纯度＞98％(HPLC)，磷酸盐缓冲液(PBS)，0.25％胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)，青霉素-链霉素，二甲基亚砜(DMSO)和噻唑基溴化四唑鎓(MTT)购自北京索莱宝生物有限公司；DON纯度＞99％购自Sigma-Aldrich公司(美国)；高糖培养基(HGDMEM)和胎牛血清(FBS)购自Biological Industries公司(以色列)；乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒购自南京建城生物工程研究所(中国南京)。

本发明实施例中，IPEC-J2细胞系由江西农业大学动物科学与技术学院提供。IPEC-J2细胞培养液为含10％FBS和1％青霉素-链霉素的HGDMEM培养基，接种于25cm²培养瓶中，并放在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。将DON溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，配成1mg/mL母液，用0.22μm滤膜过滤。CGA和DON均采用不含血清和抗生素的培养液稀释成不同浓度，现配现用。

以下实施例中，试验中每种处理均进行六次重复实验，所有数据均以平均值±标准偏差表示，所有图均使用GraphPad Prism 7生成。所有数据均使用SPSS20.0一般线性模型通过单方差分析(ANOVA)进行统计分析，并使用Duncan检验进行多次比较。P<0.05为差异显著，P＞0.05为差异不显著。

实施例1、细胞活力测定

1、取对数生长期的IPEC-J2细胞，用胰酶消化后以1×10⁴cells/孔的密度接种到96孔板中，孵育24h后弃上清，用PBS洗两遍，然后分别加入不同浓度的DON(0、0.25、0.5、1、2和4μg/mL)和CGA(5、10、20、40和80μg/mL)孵育不同时间。之后向每孔中添加10μL MTT溶液(5mg/mL)，并孵育4h。此后，小心除去上清液，并向每孔中加入150μL DMSO溶解。在振荡器上震荡10min后用酶标仪检测490nm波长和参考波长630nm下的吸光度值(OD)。

2、不同浓度DON和时间对IPEC-J2细胞活力的影响

细胞分别采用DON浓度为0、0.25、0.5、1、2和4μg/mL处理6、12和24min后，评估DON对IPEC-J2的细胞毒性作用。如图1所示，用不同剂量DON处理6、12和24h后均会引起典型的剂量依赖性细胞增殖抑制作用，并且随着DON浓度和孵育时间的增加，细胞活力显著降低。此外，与对照组相比，用0.5μg/mL DON处理6h后，细胞活力从100％显著降低至92.58％(P<0.05)。因此，将0.5μg/mL DON和6h作为进一步研究的工作条件。

3、不同浓度CGA和时间对IPEC-J2细胞活力的影响

采用不同浓度的CGA(0、5、10、20、40、60、80和100μg/mL)分别处理细胞1、2、4、8和24h。结果如表2所示，CGA以剂量依赖和时间依赖的方式改变了细胞活力。当CGA浓度从10μg/mL增加到80μg/mL作用1h时，细胞活力显著增加(P<0.05)；但随着孵育时间的延长(2h到24h)，在不同浓度的CGA下，细胞活力呈现下降的趋势。尤其当用不同浓度的CGA处理细胞8h和24h时，与对照组相比，细胞活力显著降低，且当100μg/mL CGA处理24h后，细胞活力降低至89.78％。因此，后续实验的最佳CGA反应时间为1h。

表2.不同浓度CGA和时间对IPEC-J2细胞活力的影响(％)

注：同列标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P＞0.05)。

4、CGA缓解DON诱导IPEC-J2细胞的毒性

将IPEC-J2细胞与不同浓度的CGA(0、5、10、20、40、60、80和100μg/mL)预处理1h后，再使用0.5μg/mL DON孵育6h。结果如图2A所示，不同浓度的CGA减轻了DON造成的细胞损伤。与DON组相比，当采用40μg/mL CGA处理细胞时，细胞活力显著提高(P<0.05)。根据上述结果，选择40μg/mL CGA中孵育细胞1h用于后续实验。此外，采用0.5μg/mL DON处理后LDH释放率显著增加(P<0.05)，而与单一DON组相比，40μg/mL CGA和CGA+DON处理组的LDH释放率显著下降(P<0.05)(图2B)。由此可以看出CGA可以减轻DON引起的细胞毒性。

实施例2、CGA减轻DON诱导的IPEC-J2细胞损伤

1、LDH释放率和Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测

取对数生长期的IPEC-J2细胞，用胰酶消化后以5×10⁵cells/孔的密度在6孔板中培养细胞，直到细胞融合率达80％，然后在四种不同的方法(对照，DON，CGA，CGA+DON)处理细胞，其中CGA组表示40μg/mL CGA处理细胞1h，DON组表示0.5μg/mL DON处理6h，CGA+DON组表示40μg/mL CGA预处理1h后，再用0.5μg/mL DON孵育6h。之后将收获的细胞用不含EDTA的胰酶消化5min，放入5mL离心管中，以800rpm离心5min。将细胞用PBS洗涤两次以去除死细胞，重悬于100μL 1×结合缓冲液中，然后在室温黑暗条件下用5μL Annexin V-FITC和5μLPI染色。最后，加入400μL 1×结合缓冲液，并在1h内通过流式细胞仪分析细胞凋亡水平。此外，采用LDH试剂盒检测各处理组LDH的释放率。

2、CGA减轻DON诱导的IPEC-J2细胞损伤

Annexin V/FITC/PI染色用于测量晚期凋亡细胞率(late apoptotic cellrates,Q1)、坏死细胞率(necrotic cell rates,Q2)、存活细胞率(viable cell rates,Q3)和早期凋亡细胞率(early apoptotic cell rates,Q4)。结果如图3所示：DON处理后，活细胞率显著低于其他3组(P<0.05)。与单独的DON组相比，DON处理后早期和晚期凋亡细胞均显著增加(P<0.05)，而CGA的添加显著增加了活细胞率并降低了凋亡率(P<0.05)。此外，与对照组相比，单独添加CGA可以减少坏死细胞(P<0.05)。综上所述，添加CGA可以减轻DON的细胞毒性，从而增加活细胞率并降低坏死和凋亡细胞率。

实施例3、CGA减轻DON诱导的IPEC-J2细胞炎症

1、实时荧光定量PCR

将IPEC-J2细胞以5×105cells/孔的密度接种在6孔板中，待细胞融合率达到80％，经过上述四个处理组(对照，DON，CGA，CGA+DON)后，采用使用Trizol提取总RNA，将RNA沉淀溶于50μL无RNase的水中，并保存在-80℃。通过NanoDrop ND-1000分光光度计测量RNA浓度，OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀，并通过琼脂糖凝胶验证RNA的完整性。使用TB GREEN试剂盒，将每个样品中约1μg的总RNA在42℃的条件下孕育2min便于去除gDNA，通过反转录生成cDNA。使用CFX Connect^TM实时PCR检测系统进行实时PCR。PCR条件为95℃预变性300s，之后95℃20s、60℃30s和72℃30s进行38个循环。以GAPDH作为内参基因，使用2^-ΔΔCT方法分析各个基因的相对表达量，所有基因的引物均列于表1中。

表1基因的引物序列

2、CGA减轻DON诱导的IPEC-J2细胞炎症

由图4可以看出：采用DON处理6h后，IPEC-J2细胞中IL-6、IL-8、TNF-α和COX-2基因的相对mRNA丰度显著上调；然而，通过加入CGA预处理1h后可以显著下调上述基因的表达(P<0.05)。与对照组相比，添加CGA可以增加IL-8基因mRNA的表达丰度，降低TNF-α基因mRNA的表达丰度(P<0.05)。以上结果初步推断CGA可以减轻DON的细胞毒性以缓解细胞炎症反应。

3、CGA减轻DON诱导的IPEC-J2细胞凋亡相关基因mRNA的丰度

如图5所示，DON处理显著上调了Bax和Caspase 3的相对mRNA表达。然而，通过加入CGA预处理1h后可以显著下调上述基因的表达(P<0.05)。与对照组相比，DON、CGA或DON+CGA的添加下调了Bcl-2基因mRNA的表达(P<0.05)。这些结果可以推论CGA可以减轻DON诱导的细胞凋亡。

4、CGA提高DON诱导的IPEC-J2细胞中紧密连接蛋白的mRNA丰度

图6表明，与其他组相比，CGA+DON组的IPEC-J2细胞中ZO-1，Occludin和Claudin-1的相对mRNA丰度显著上调(P<0.05)。与对照组相比，添加DON可以降低ZO-1和OccludinmRNA的丰度(P<0.05)，但是添加CGA能够增加Claudin-1mRNA的丰度(P<0.05)。结论是添加CGA可以使细胞结构紧密，并保护肠细胞免受DON攻击。

5、CGA改变DON诱导的IPEC-J2细胞中的营养转运蛋白基因mRNA丰度与对照组相比，钠依赖性葡萄糖共转运蛋白1(SGLT1)和肽转运蛋白1(PepT1)的相对mRNA丰度在其他3组中显著下调(P<0.05)。然而，与单一的DON处理相比，添加CGA可以上调PepT1并促进葡萄糖转运蛋白(GLUT2)mRNA的丰度(P<0.05)。DON处理显著上调了ASC氨基酸转运蛋白2(ASCT2)的相对mRNA丰度，但加入CGA却下调了其相对丰度(P<0.05)。推测CGA可以调节养分吸收和运输。

CGA可通过减少细胞凋亡和炎症、改善肠屏障功能、调节营养吸收和转运来保护IPEC-J2细胞免受DON诱导的损害。CGA作为减轻DON诱导细胞损伤，其可用于制备治疗由DON诱导的肠道炎症。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 河南普爱饲料股份有限公司 河南农业大学

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