阅读说明：本技术 半乳寡糖及其衍生物在作为SGLTs抑制剂中的应用 (Application of galactooligosaccharide and derivatives thereof as SGLTs inhibitor ) 是由 于广利 王学良 郝杰杰 蔡超 蒋昊 李国云 于 2019-10-22 设计创作，主要内容包括：本发明属于海洋药物领域,具体涉及一种含有D-半乳糖和L-半乳糖的寡糖及其衍生物在作为SGLTs抑制剂中的应用。以含有D-/L-半乳糖的红藻多糖为原料,经物理法、化学法、生物酶法或上述方法的任意组合进行降解,制备获得不同聚合度的半乳寡糖及其衍生物,其分子骨架中含有D-半乳糖和L-半乳糖及其衍生物。本发明产品的原料来源于红藻多糖,具有资源丰富、制备工艺简单、安全性高,靶点明确和易于产业化等优点,用作SGLT1和2抑制剂,在抗糖尿病、肥胖、糖尿病肾病、糖脂代谢紊乱等疾病药物以及改善非酒精性脂肪肝功能食品的开发中具有广阔的应用前景。(The invention belongs to the field of marine medicines, and particularly relates to application of D-galactose and L-galactose-containing oligosaccharide and derivatives thereof as SGLTs inhibitors. The preparation method comprises the steps of taking red algae polysaccharide containing D-/L-galactose as a raw material, and degrading by a physical method, a chemical method, a biological enzyme method or any combination of the methods to prepare galacto-oligosaccharides with different polymerization degrees and derivatives thereof, wherein the molecular skeleton of the galacto-oligosaccharides contains D-galactose, L-galactose and derivatives thereof. The raw materials of the product are derived from the red algae polysaccharide, the product has the advantages of rich resources, simple preparation process, high safety, definite target spot, easy industrialization and the like, is used as SGLT1 and 2 inhibitors, and has wide application prospect in the development of medicaments for resisting diseases such as diabetes, obesity, diabetic nephropathy, glycolipid metabolic disorder and the like and food for improving the function of nonalcoholic fatty liver.)

半乳寡糖及其衍生物在作为SGLTs抑制剂中的应用

技术领域

本发明属于海洋药物领域，具体涉及一种含有D-半乳糖和L-半乳糖的寡糖及其衍生物在作为SGLTs(SGLT1和SGLT2)抑制剂中的应用。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus)是以慢性高糖血症为特征、胰岛β细胞分泌胰岛素绝对或相对不足而产生的代谢性疾病。2017年全世界糖尿病患者已达到4.25亿，预计2045年将达到6.29亿，而中国糖尿病患者约1.144亿，已成为患者数量最多的国家；我国成年人患病率为9.7％，糖尿病前期的患病率更高达15.5％，其中，90％以上患者为2型糖尿病。长期慢性高血糖导致并发症发生，引起大、小血管及周围神经病变，造成心、脑、肾和眼等器官的损伤。血糖控制是治疗2型糖尿病、延缓并发症进程的关键。然而，仍约有一半糖尿病患者的血糖未达到理想水平，开发新型的降糖药物一直是抗糖尿病药物研发的热点。

钠-葡萄糖协同转运蛋白1(sodium-glucose cotransporter1，SGLT1)是一种高亲和力、低转运能力的转运体，主要分布于小肠刷状缘及肾脏分布于近曲小管较远的S3段，吸收由食物消化所产生的葡萄糖，供给生命活动所需。抑制该转运体可以减少肠道葡萄糖的吸收，降低餐后血糖。SGLT2蛋白是一种低亲和力、高容量的转运体，存在于肾脏，可以重吸收肾小球滤过液中的葡萄糖重新回到血液。当血液流经肾脏，由肾小球滤过，产生的滤过液流经肾小管，由位于肾小管S1和S2段的SGLT2将滤过液中的葡萄糖重新转运进入血液，防止葡萄糖随尿液排出。人体肾脏每天滤过约180g葡萄糖，其中大于90％的肾脏葡萄糖重吸收由SGLT2完成，其余由SGLT1完成。SGLT2抑制剂，通过阻断这一过程，抑制葡萄糖被SGLT2蛋白转运，使葡萄糖留在滤过尿液中，最终随尿液排出，从而降低血糖。

近年来SGLT被认为是降糖药物开发的热门靶点之一，其中SGLT1和2抑制剂(SGLTinhibitor，SGLTi)通过减少小肠对葡萄糖的吸收以及肾脏对葡萄糖的重吸收，起到降低血糖的效果。与其他糖尿病治疗药物相比，SGLTi独特的非胰岛素依赖的作用方式使其不受患者β细胞功能以及胰岛素敏感性的影响。同时，SGLTi还具有减轻体重，降低内脏脂肪量，降低血压和降低血尿酸等优势。

作为研究最早的SGLTi，根皮苷(phloridzin)是SGLT1和SGLT2的双重抑制剂，其对SGLT1和2的选择性较差且易被人体分解。在此基础上开发出了SGLT2选择性抑制剂，目前国际已上市的依帕列净(empagliflozin)是选择性最好的SGLT2i(>2500:1)，其次是达格列净(dapagliflozin，>1200:1)和卡格列净(canagliflozin，>250:1)。SGLTi具有良好的开发和市场前景，受到越来越多的关注，开发的药物越来越多，但还未有海洋来源的SGLTi被报道。

海洋来源化合物储量丰富，化合物种类多样。研究表明，海藻多糖和寡糖具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗炎和增强免疫等功能。本团队在该领域作了大量研究工作，发现琼胶寡糖(公开号CN105168232A)具有降血脂等活性，岩藻糖硫酸酯具有抑制α-糖苷酶活性(公开号CN103288978A)，褐藻胶寡糖及其衍生物具有改善胰岛素抵抗及降血糖活性(公开号CN101649004A，公开号CN101691410A)等，但还没有发现含有D-半乳糖和L-半乳糖的寡糖及其衍生物具有靶向抑制SGLT1和SGLT2防治抗糖尿病相关疾病的报道。红藻来源的半乳聚糖主要有卡拉胶系列、琼胶系列和紫菜胶系列，其中：卡拉胶系列的多糖与寡糖均由D-半乳糖及其硫酸酯衍生物组成(公开号CN1513880A，公开号CN101012249A，公开号CN101279991A)，而琼胶和紫菜胶系列的多糖与寡糖则是由D-半乳糖和L-半乳糖二种糖残基及其硫酸酯衍生物组成，琼胶与紫菜胶的结构也存在差别，其不同点在于前者含有较多的L-AnG，而后者含有较多的6-硫酸-L-Gal，单糖组成不同则理化性质和生物学功能不同。虽然卡拉胶及其寡糖作为喷剂具有抗病毒活性(公开号CN102516323A，公开号CN104546895A)，但口服却有一定的安全隐患(Shang Q.，ToxicolLet.，2017,279:87-95)，琼胶和紫菜胶多糖与寡糖口服则安全性很高，是药物及功能食品开发的优质原料。由于多糖类化合物分子量高、溶解性较差，结构序列不明确，致使其质量难控制，所以寡糖的制备与应用是近年来研究开发的重点。在琼胶寡糖制备技术方面，主要有酸法降解、酶法降解与化学法降解，且不同降解方法能获得结构与活性不同的寡糖，例如：酸法降解可以得到奇数琼胶寡糖(公开号CN1513860A)，酶法降解得到偶数新琼胶寡糖(公开号CN102827899A；公开号CN109576328A)，还原酸降解得到偶数糖醇(公开号CN100999537A)，自由基降解则得到混合琼胶寡糖(公开号CN109400756A)；紫菜胶采用酸法降解(LiuY.,et al,Mar Drugs.2018,16(3).pii:E82)或者酶法降解(Zhang Y.,et al,J.Agr.Food Chem.2019,67,9307-9313)均能获得紫菜胶寡糖等，不同方法得到的寡糖结构序列不同。

发明内容

本发明的目的是提供一种半乳寡糖及其衍生物在作为SGLT1和2制剂中的应用，从海洋红藻多糖中获得系列半乳寡糖及其衍生物，并证明其具有降血糖，改善糖脂代谢，在防治2型糖尿病相关疾病中的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案：

一种半乳寡糖及其衍生物在作为SGLTs抑制剂中的应用，寡糖结构通式如下：

式中，R＝-H或-SO₃Na，n＝0～30；

具有这些结构特征的半乳寡糖及其衍生物可靶向抑制SGLT1和SGLT2活性，作为防治抗糖尿病、抗糖尿病肾病、抗心血管疾病的药物或保健品。

所述的半乳寡糖及其衍生物在作为SGLTs抑制剂中的应用，该半乳寡糖及其衍生物可靶向与SGLTs蛋白结合抑制其葡萄糖转运活性并调节糖脂代谢。

所述的半乳寡糖及其衍生物在作为SGLTs抑制剂中的应用，该半乳寡糖及其衍生物能显著降低血糖，用做制备降血糖、缓解胰岛素抵抗、抗2型糖尿病、抗代谢综合征、抗非酒精性脂肪肝、抗高脂血症、保护肝脏、降血脂的药物。

所述的半乳寡糖及其衍生物在作为SGLTs抑制剂中的应用，该SGLTs抑制剂中的应用于抗糖尿病、抗糖尿病肾病、抗心血管疾病的药物或保健品；或者，用于饮料、啤酒、饮食补充剂，或者与其它抗糖尿病的药物联用，或者与降血脂的药物联用；或者与抗糖尿病肾病的药物联用；或者包含该半乳寡糖及其衍生物的复配制剂；或者与抗心血管疾病的药物联用；或以该系列寡糖为母核制备的衍生物作为制剂，用于SGLTs抗糖尿病、抗糖尿病肾病、抗心血管疾病的药物或者功能制剂中。

所述的半乳寡糖及其衍生物在作为SGLTs抑制剂中的应用，该半乳寡糖及其衍生物与二甲双胍、达格列净、卡格列净或阿卡波糖相关临床降血糖药物形成复配制剂，作为SGLTs抑制剂应用于防治抗糖尿病、抗糖尿病肾病、抗心血管相关疾病药物中。

所述的半乳寡糖及其衍生物在作为SGLTs抑制剂中的应用，半乳寡糖及其衍生物的制备过程如下：

以富含D-/L-半乳糖及其衍生物的红藻多糖为原料，经物理降解、化学降解、酶法降解之一种或两种以上降解方法的组合，制备不同聚合度的寡糖及其衍生物，所制备的化合物结构中同时含有β-1,3-D-半乳糖(D-Gal)残基和α-1,4-L-半乳糖(L-Gal)残基，或同时含有D-Gal与α-1,4-L-3,6-内醚半乳糖(L-AnG)残基；在D-Gal与L-Gal糖残基的C6位羟基含有不同程度的硫酸酯化(Gal6S)修饰；所制备寡糖的非还原端是Gal，Gal6S或AnG，还原端是Gal或糖醇(Gal-OH)与糖酸(Gal-OOH)或AnG糖醇(AnG-OH)，或Gal6S及其糖醇(Gal6S-OH)与糖酸(Gal6S-OOH)。

所述的半乳寡糖及其衍生物在作为SGLTs抑制剂中的应用，该半乳寡糖及其衍生物采用下述的具体制备工艺：

将琼脂糖溶于60℃热水，用缓冲液配成10mg/mL溶液，放置于30℃水浴锅内添加β-琼胶酶(CAS#37288-57-6)并搅拌降解4小时，冷却后离心，收集上清液，加2倍体积95％医用乙醇于4℃过夜，离心，收集上清，旋蒸去除乙醇，用200Da透析袋透析脱盐，旋蒸浓缩并冷冻干燥，得到新琼寡糖混合物，并进一步采用硼氢化钠还原得到新琼胶寡糖醇，或者用本尼迪克试剂氧化得到新琼胶寡糖酸；或者，将琼脂糖用80℃热水溶解，采用0.1M稀盐酸配成10mg/mL溶液，于80℃搅拌降解0.5小时，冷却后用2M的NaOH水溶液中和，离心收集上清液，然后加2倍体积95％医用乙醇于4℃过夜，离心收集上清，旋蒸去除乙醇，用200Da透析袋透析脱盐，旋蒸浓缩并冷冻干燥得到寡糖混合物，进一步采用硼氢化钠还原得到琼胶寡糖醇，或者采用本尼迪克试剂氧化得到琼胶寡糖酸；或者，将硫琼胶用0.1M稀硫酸配成10mg/mL水溶液，加热到60℃后搅拌降解1.5小时，冷却后用2M的NaOH水溶液中和，离心收集上清液，然后加入3倍体积95％医用乙醇于4℃过夜，离心收集上清，旋蒸去除乙醇，用200Da透析袋透析脱盐，之后旋蒸浓缩并冷冻干燥得到寡糖混合物，然后进一步经硼氢化钠还原得到硫琼胶寡糖醇，或者采用本尼迪克试剂氧化得到硫琼胶寡糖酸；或者，将紫菜胶用0.1M稀硫酸配成10mg/mL水溶液，加热到80℃后搅拌降解2小时，冷却后用2M的NaOH水溶液中和，离心收集上清液，然后加入3倍体积95％医用乙醇于4℃过夜，离心收集上清，旋蒸去除乙醇，用200Da透析袋透析脱盐，之后旋蒸浓缩并冷冻干燥得到寡糖混合物，进一步采用硼氢化钠还原得到紫菜胶寡糖醇，或者采用本尼迪克试剂氧化得到紫菜胶寡糖酸。

本发明的设计思想是制备一种安全性高，能多靶点、多途径发挥降血糖作用的寡糖化合物，本发明的寡糖及其衍生物不仅能直接抑制肠道SGLT1活性，而且还能经血进入肾脏抑制SGLT2活性。

本发明在已有的降解技术基础上，进一步对所制备的各种寡糖进行定向还原和氧化反应，得到了结构与序列不同且还原端含有糖醇或糖酸结构的寡糖衍生物，并通过实验证明了这些寡糖及其衍生物具有显著靶向抑制SGLT1和SGLT2活性，可用做制备防治抗糖尿病、抗糖尿病肾病、抗心血管疾病的药物及其功能制品。

本发明的优点及有益效果是：

1、本发明含D-和L-半乳糖残基的寡糖及其衍生物能靶向SGLT1和2，并抑制其葡萄糖转运功能，进而缓解胰岛素抵抗。

2、本发明含D-和L-半乳糖残基的寡糖及其衍生物具有显著的降血脂和保肝效果，可用于高血脂症、脂肪肝的防治。

3、本发明产品原料来源于海洋多糖，具有资源丰富、制备工艺简单、产品稳定性好，易于产业化，安全有效等优点，用于降血糖功能，在防治2型糖尿病新药及在降血糖、降血脂和改善脂肪肝等特医食品的开发领域，具有广阔的开发应用前景。

4、本发明寡糖具有抑制高脂饮食引起的高血糖，肥胖、脂质积累，胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝的作用。

5、本发明采用人源SGLT1和2稳转细胞株以及高脂饮食诱构建的2型糖尿病动物模型对所制备的系列寡糖进行SGLT1和2抑制活性等相关功能评价。研究结果表明，含D-和L-半乳糖残基及其衍生物的寡糖能靶向抑制SGLT1和2葡萄糖转运活性，进而对起到降血糖作用，具有明显降低体重、高血脂、高血糖，改善氧化应激状态和炎症，显著增加胰岛素敏感性，从而改善胰岛素抵抗，具有治疗糖尿病、脂肪肝和高血脂症及心脑血管疾病的作用。

附图说明

图1为新琼四糖(a)及其糖醇(b)、糖酸(c)高分辨质谱图及结构式。图中，横坐标m/z代表质荷比，纵坐标RelativeAbundance代表相对丰度。

图2为人源SGLT1和2稳转细胞株的构建及验证。图中，Control代表未转染空白对照组，EP(Empty plasmid)代表空质粒转染组，SGLT1P代表SGLT1重组质粒转染组，SGLT1代表SGLT1蛋白表达量，SGLT2P代表SGLT2重组质粒转染组，SGLT2代表SGLT2蛋白表达量，β-actin代表β-肌动蛋白，HEK293代表未转染组，HEK293-SGLT1代表SGLT1稳转细胞组，HEK293-SGLT2代表SGLT2稳转细胞组。*P<0.05，与未转染空白对照组相比；#P<0.05，与空质粒转染组相比。其中，(a)图为SGLT1稳转细胞株蛋白表达western blot(左图)及灰度积分图(右图)，灰度积分图中，横坐标代表不同处理组，纵坐标SGLT1(Fold change)代表与对照组相比各组的SGLT1表达量改变；(b)图为SGLT2稳转细胞株蛋白表达westernblot(左图)及灰度积分图(右图)，灰度积分图中，横坐标代表不同处理组，纵坐标SGLT2(Fold change)代表与对照组相比各组的SGLT2表达量改变；(c)图为SGLT1和SGLT2稳转细胞株转运荧光葡萄糖类似物2-NBDG相对含量结果图，横坐标代表不同处理组，纵坐标Fold change fromControl代表与未转染组相比SGLT1和SGLT2组在Ex488/Em530的荧光强度。

图3为硫琼胶三糖靶向SGLT1和2抑制其葡萄糖转运活性。GF3代表硫琼胶三糖，SGLT1 IC50代表硫琼胶三糖对SGLT1活性的半抑制浓度，SGLT2 IC50代表硫琼胶三糖对SGLT2活性的半抑制浓度，％inhibition代表不同浓度GF3对SGLT活性的抑制率。其中，(a)图为GF3对SGLT1的抑制率结果图；(b)图为GF3对SGLT2的抑制率结果图。

图4为系列半乳寡糖降低餐后血糖的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)实验结果图。Control代表空白对照组，SAOs代表硫琼胶寡糖处理组，AOs代表琼胶寡糖处理组，POs代表紫菜胶寡糖处理组。其中，(a)图为OGTT实验不同时间点血糖水平结果图，横坐标代表测试时间(min)，纵坐标Blood glucose(mmol/L)代表血糖水平；(b)图为OGTT实验曲线下面积积分结果图，横坐标代表不同处理组，纵坐标Area under curve代表曲线下面积(mmol/L·min)。

图5为SAOs降低2型糖尿病(T2DM)小鼠血糖及增加胰岛素敏感性和尿糖结果图。*P<0.05，与正常组小鼠相比；#P<0.05，与T2DM组相比。Control代表低脂饲料处理组，Model代表高脂饲料处理组，Metf代表高脂饲料加二甲双胍处理组，Cana代表高脂饲料加卡格列净处理组，SAOs-L代表高脂饲料加100mg/kg/d硫琼胶寡糖处理组，SAOs-H代表高脂饲料加300mg/kg/d硫琼胶寡糖处理组。其中，(a)图为不同处理组口服葡萄糖耐量试验结果图，横坐标代表测试时间(min)，纵坐标Blood glucose(mmol/L)代表不同时间点血糖值；(b)图为腹腔胰岛素耐量实验结果图，横坐标代表测试时间(min)，纵坐标Blood glucose(mmol/L)代表不同时间点血糖值；(c)图为灌喂寡糖六周后空腹血糖测定结果图，横坐标代表不同处理组，纵坐标Fasting blood glucose(mmol/L)代表空腹血糖值；(d)图为尿液葡萄糖含量测定结果图，横坐标代表不同处理组，纵坐标Urine glucose(mmol/L)代表尿液葡萄水平数值。

图6为SAOs降低T2DM小鼠体重图。*P<0.05，与正常组小鼠相比；#P<0.05，与T2DM组相比。Control代表低脂饲料处理组，Model代表高脂饲料处理组，Metf代表高脂饲料加二甲双胍处理组，Cana代表高脂饲料加卡格列净处理组，SAOs-L代表高脂饲料加100mg/kg/d硫琼胶寡糖处理组，SAOs-H代表高脂饲料加300mg/kg/d硫琼胶寡糖处理组。其中，(a)图为试验结束时小鼠体态图；(b)图为小鼠体重变化图，横坐标代表不同处理组，纵坐标Bodyweight(g)代表小鼠体重，无斜杠柱状图代表造模前体重，斜杠柱状图代表实验结束时体重；(c)图为实验期间小鼠体重增加结果图，横坐标代表不同处理组，纵坐标Weight gain(g)代表小鼠体重增加量。

图7为SAOs改善T2DM非酒精性脂肪肝图。Control代表低脂饲料处理组，Model代表高脂饲料处理组，Metf代表高脂饲料加二甲双胍处理组，Cana代表高脂饲料加卡格列净处理组，SAOs-L代表高脂饲料加100mg/kg/d硫琼胶寡糖处理组，SAOs-H代表高脂饲料加300mg/kg/d硫琼胶寡糖处理组。其中，(a)图为不同处理组肝脏组织冰冻切片油红O染色结果；(b)图为不同处理组肝脏组织切片苏木精—伊红染色结果。

图8为SAOs改善T2DM高血脂图。Control代表低脂饲料处理组，Model代表高脂饲料处理组，Metf代表高脂饲料加二甲双胍处理组，Cana代表高脂饲料加卡格列净处理组，SAOs-L代表高脂饲料加100mg/kg/d硫琼胶寡糖处理组，SAOs-H代表高脂饲料加300mg/kg/d硫琼胶寡糖处理组。其中，(a)图为不同处理组血清甘油三脂含量结果图，横坐标代表不同处理组，纵坐标Serum TG代表血清甘油三酯含量(mmol/L)；(b)图为不同处理组血清总胆固醇含量结果图，横坐标代表不同处理组，纵坐标Serum TC代表血清总胆固醇含量(mmol/L)；(c)图为不同处理组血清低密度脂蛋白含量结果图，横坐标代表不同处理组，纵坐标SerumLDL-C代表血清低密度脂蛋白含量(mmol/L)；(d)图为不同处理组血清高密度脂蛋白含量结果图，横坐标代表不同处理组，纵坐标Serum HDL-C代表血清高密度脂蛋白含量(mmol/L)。

具体实施方式

下面，结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例1：含有6-O-硫酸-β-1,3-D-半乳糖(Gal6S)和α-1,4-L-3,6-内醚半乳糖(AnG)硫琼胶寡糖(SAOs)、寡糖醇(SAOs-OH)及寡糖酸(SAOs-OOH)的制备。

将1000mg硫琼胶多糖用摩尔浓度0.1M的稀硫酸配成10mg/mL水溶液，加热到60℃，搅拌降解1.5小时，冷却后用摩尔浓度2M的NaOH水溶液中和，离心收集上清液，然后加入3倍体积95％医用乙醇(浓度95wt％)于4℃过夜，离心收集上清，减压旋蒸去除乙醇后，用200Da透析袋透析脱盐，经旋蒸浓缩、冷冻干燥得到SAOs。取100mg SAOs，将其溶于10毫升摩尔浓度100mM的NaBH₄水溶液(含摩尔浓度100mM的NaOH)于4℃过夜反应，加入醋酸调pH至7.0，经透析脱盐，冷冻干燥得寡糖醇SAOs-OH。再取200mg SAOs，将其溶于5毫升新配制的本尼迪克试剂中，55℃加热反应至无砖红色沉淀产生，离心取上清液，经阳离子交换树脂去除残余铜离子，调pH至中性，经透析脱盐，冷冻干燥，得到寡糖酸SAOs-OOH。

所制得的SAOs系列硫琼胶寡糖醇、寡糖酸和寡糖的结构式如下：

式中，R＝-SO₃Na；n＝0-30；

实施例2：含有β-1,3-D-半乳糖(Gal)和6-O-硫酸-α-1,4-半乳糖(Gal6S)的紫菜胶寡糖(POs)、寡糖醇(POs-OH)和寡糖酸(POs-OOH)的制备。

将紫菜胶用摩尔浓度0.1M的稀硫酸配成10mg/mL水溶液，加热到80℃，搅拌降解2.0小时，冷却后用摩尔浓度2M的NaOH水溶液中和，离心收集上清液，加入4倍体积95％医用乙醇于4℃过夜，离心收集上清，减压旋蒸去除乙醇后，用200Da透析袋脱盐，经旋蒸浓缩、冷冻干燥得到紫菜胶寡糖POs。取POs寡糖150mg，将其溶于15毫升摩尔浓度150mM的NaBH₄水溶液(含摩尔浓度150mM的NaOH)于4℃过夜反应，加入醋酸调pH至7.0，经透析脱盐，冷冻干燥，得紫菜胶寡糖醇POs-OH。再取100mg的POs，将其溶于3mL新配制的本尼迪克试剂中，55℃加热搅拌反应，至无转红色沉淀产生后，离心取上清液，经阳离子交换树脂去除残余铜离子，调pH至中性，经透析脱盐，冷冻干燥，得到紫菜胶寡糖酸POs-OOH。

所制备的紫菜胶POs寡糖醇、寡糖酸及其寡糖的结构式如下：

式中，R＝-H,或-SO₃Na；n＝0-30；

实施例3：含有β-1,3-D-半乳糖(Gal)和α-1,4-L-3,6-内醚半乳糖(AnG)的琼胶寡糖及其寡糖醇和寡糖酸的制备。

将琼脂糖用热水溶解，采用摩尔浓度0.1M的稀盐酸配成10mg/mL溶液，于80℃搅拌降解0.5小时，冷却后用摩尔浓度2M的NaOH水溶液中和，离心收集上清液，然后加2.5倍体积95％医用乙醇于4℃过夜，离心收集上清，旋蒸去除乙醇，用200Da透析袋透析脱盐，旋蒸浓缩并冷冻干燥得到琼寡糖AOs，进一步采用硼氢化钠还原得到琼胶寡糖醇AOs-OH，或者采用本尼迪克试剂氧化得到琼胶寡糖酸AOs-OOH。琼胶寡糖醇、寡糖酸及其寡糖的化学结构式如下：

式中，n＝0-30；

实施例4：含有α-1,4-L-3,6-内醚半乳糖(AnG)和β-1,3-D-半乳糖(Gal)新琼胶寡糖及其糖醇和寡糖酸的制备。

将琼脂糖用60℃热水溶解，配成10mg/mL水溶液，放置30℃水浴锅内，加入β-琼胶酶，恒温搅拌酶解4小时，立即置于95℃水浴锅使酶变性10分钟后冷却到室温，离心收集上清液，然后加3倍体积95％医用乙醇于4℃过夜，离心收集上清，旋蒸去除乙醇，用200Da透析袋透析脱盐，旋蒸浓缩并冷冻干燥得到新琼寡糖NAOs，进一步采用硼氢化钠还原得到新琼胶寡糖醇NAOs-OH，或者采用本尼迪克试剂氧化得到新琼胶寡糖酸NAOs-OOH。所制备的新琼胶寡糖醇、寡糖酸及寡糖的化学结构式如下：

式中，n＝0-30；

为了验证所得寡糖醇的序列结构，将酶解得到的新琼胶寡糖用Superdex 30柱分离纯化，得到新琼四糖纯品(图1a)，进一步采用碱性硼氢化钠还原方法制得新琼四糖醇，所得产品的高分辨质谱(ESI-MS)分析结果如图1b所示。同样，将所得新琼四糖采用本尼迪克定向氧化方法获得新琼四糖酸产品，其高分辨质谱(ESI-MS)分析结果如图1c所示。

实施例5：人源SGLT1和2稳转细胞株的构建

为了研究化合物对人源SGLT抑制效果，利用Lipofectamine 2000将含有含有全长人源SGLT1或SGLT2的重组质粒转入HEK293细胞，并用G418进行筛选得到能稳定表达SGLT或SGLT2的稳转细胞株。通过western blot结果验证可知，成功构建了SGLT1(图2a)和SGLT2(图2b)稳转细胞株。利用流式细胞术，进一步验证了筛选得到的稳转细胞株与未转染组相比能显著提高转运葡萄糖活性(图2c)，可用于SGLT1和SGLT2抑制剂的筛选。

实施例6：硫琼胶三糖(GF3)靶向SGLT1和2抑制其葡萄糖转运活性

为了研究GF3对SGLT1和2的葡萄糖转运活性抑制效果，利用流式细胞术分析系列浓度GF3对SGLT1和2转运荧光D-葡萄糖同系物(2-NBDG)的抑制率。如图3所示，硫琼胶三糖靶向SGLT1和2抑制其葡萄糖转运活性曲线。实验结果表明，随着GF3浓度的升高其对SGLT1和SGLT2葡萄糖转运活性抑制率显著提高。利用Graphpadprism软件计算出GF3对SGLT1和SGLT2葡萄糖转运活性的半抑制浓度分别为1363nmol/L和12.58nmol/L。因此，GF3是一种SGLT2选择性抑制剂，选择性为SGLT1/SGLT2＝108.34。

实施例7：口服葡萄糖耐量试验(OGTT)表征系列半乳寡糖降低餐后血糖作用

为了在动物水平证实系列半乳寡糖的抑制SGLT1的作用，选取18-22g雄性昆明小鼠在禁食12h后按2g/kg体重灌喂葡萄糖溶液，在0min、30min、60min、90min和120min分别测定血糖并计算其曲线下面积。如图4所示，半乳寡糖降低餐后血糖的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)结果图。实验结果表明，与对照组性比SAOs、AOs和POs均能显著降低小鼠餐后血糖提高葡萄糖耐量，这表明系列半乳寡糖均能显著降低SGLT1活性进而起到降低餐后血糖的效果。

实施例8：2型糖尿病(T2DM)动物模型表征SAOs降血糖增加胰岛素敏感性实验

为了进一步在动物水平证实系列半乳寡糖的抑制SGLT1和SGLT2进而起到降低高血糖的作用，选取20～22g雄性昆明小鼠适应一周后进行不同饲料喂养。其中Control组用低脂饲料进行喂养，其他组用高脂饲料进行喂养。喂养6个月后造模成功后，用不同化合物灌喂一个月，之后测定其口服葡萄糖敏感性、腹腔注射胰岛素敏感性以及尿糖水平。如图5所示，SAOs降低2型糖尿病(T2DM)小鼠口服葡糖耐受性、血糖及增加胰岛素敏感性和尿糖结果图。实验结果表明，与Model组相比SAOs能够显著增强T2DM小鼠的口服葡糖耐受性(图5a)、胰岛素敏感性(图5b)，降低空腹血糖(图5c)并增加尿液葡萄糖(图5d)水平。可见，SAOs能抑制SGLT1和SGLT2葡萄糖转运活性，从而降低血糖并增加尿糖水平。

实施例9：SAOs降低T2DM小鼠体重实验

利用实施例8中所造的T2DM动物模型进一步评价了SAOs的减肥效果。实验结果表明，与Model组相比SAOs灌喂后小鼠体型和腰围显著减小(图6a)，且体重增加量显著降低(图6b和图6c)。可见，SAOs能显著降低T2DM小鼠的体重，具有良好的减肥效果。

实施例10：SAOs改善T2DM小鼠非酒精性脂肪肝实验

利用实施例8中所造的T2DM动物模型进一步评价了SAOs缓解非酒精性脂肪肝的效果。如图7所示，油红O染色(图7a)和苏木精—伊红染色(图7b)结果表明与Model组相比SAOs灌喂后小鼠肝脏细胞分布均匀，形态结构清晰，脂滴积累和细胞变性显著减少且肝气球样改变和脂肪泡数量均减少。以上结果表明，SAOs可调节T2DM小鼠的肝脏脂质代谢和脂质积累从而缓解非酒精性脂肪肝。

实施例11：SAOs改善T2DM小鼠高血脂实验

利用实施例8中所造的T2DM动物模型进一步评价了SAOs改善高血脂症效果。如图8所示，与Model组相比SAOs灌喂后小鼠血清甘油三酯(图8a)、总胆固醇(图8b)和低密度脂蛋白含量显著降低(图8c)，高密度脂蛋白含量显著增加(图8d)且呈现一定的剂量依赖性。以上结果表明SAOs可缓解T2DM小鼠的高脂血症因此对心脑血管有一定的保护作用。

以上实验结果表明，半乳寡糖能靶向抑制SGLT1和2的活性并且具有一定的SGLT2选择性。通过高脂饲料喂养造T2DM小鼠模型动物实验结果可知，系列半乳寡糖能明显改善T2DM小鼠高血糖、改善葡萄糖耐受性以及胰岛素敏感性。同时具有减肥功效，且能显著改善高脂饮食引起的非酒精性脂肪肝和高血脂和心脑血管疾病。

综上，本发明的寡糖能靶向抑制SGLT1和2葡萄糖转运活性，且具有一定的SGLT2选择性，通过抑制葡萄糖的转运和肾脏重吸收而起到降血糖、缓解胰岛素抵抗、抗2型糖尿病、抗代谢综合征、抗高血脂症缓解非酒精性脂肪肝的效果，宜于作为缓解胰岛素抵抗、防治脂肪肝、降血糖、防治2型糖尿病、防治代谢综合征、治疗高血脂候选药物或保健品或复配制剂应用。实施例结果表明，本发明的系列半乳寡糖化合物对SGLT1和2具有显著的靶向抑制活性，进而发挥缓解胰岛素抵抗、对脂肪肝的保护作用以及对糖脂代谢的调节作用效果明显。半乳寡糖及其衍生物能够显著增强胰岛素敏感性、缓解细胞脂质积累以及增加细胞糖脂代谢功能，从而实现对胰岛素抵抗、2型糖尿病、代谢综合征、脂肪肝、高脂血症的治疗作用。本发明产品来源于海洋红藻寡糖，具有资源丰富、易于产业化，安全有效等诸多优点，在防治胰岛素抵抗、2型糖尿病、代谢综合征、脂肪肝、高脂血症、高血压等方面具有广阔的开发应用前景。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例中所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。