阅读说明：本技术 用于制备具有降低的变应原性的gos的方法 (Process for the preparation of GOS with reduced allergenicity ) 是由 D·A·格罗恩韦尔德 B·J·H·凯珀斯 B·J·M·德尔辛 L·曹 于 2018-06-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及营养成分领域,特别是涉及用于生产低变应原性低聚半乳糖(GOS)的方法及其在食品和饮品中的用途。本发明提供了衍生自土生隐球菌(最近重命名为土生蝶孢银耳)的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)在生产低变应原性GOS制剂中的用途,该低变应原性GOS制剂在受试者中诱导过敏反应的能力降低。(The present invention provides the use of β -galactosidase (EC3.2.1.23) derived from Cryptococcus terrestris (recently renamed Tremella terrestris) for the production of hypoallergenic GOS preparations having a reduced ability to induce allergic reactions in a subject.)

用于制备具有降低的变应原性的GOS的方法

技术领域

本发明涉及营养成分领域。更特别地，本发明涉及用于生产低变应原性低聚半乳糖的方法及其在食品和饮品中的用途。本发明特别地涉及衍生自土生隐球菌(Cryptococcus terrestris)(最近重命名为土生蝶孢银耳(Papiliotrema terrestris))的β-半乳糖苷酶在生产低变应原性GOS制剂中的用途。

背景技术

术语“GOS”代表低聚半乳糖(GOS)，其通常包含半乳糖单元和末端葡萄糖单元的链，这些半乳糖单元和末端葡萄糖单元通过由β-半乳糖苷酶催化的连续的转半乳糖基化反应(转半乳糖基化反应)产生。GOS组分中的一些天然存在于人母乳和牛初乳中。通常GOS制剂主要包含二糖至六糖。

已经报道了GOS的多种生理功能，包括刺激肠道中双歧杆菌细菌生长的能力[1-3]、支持正常肠道转运的能力[4]、促进天然防御的能力[5,6]、以及增强矿物质吸收的能力[7]。GOS因其促进双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Lactobacillus)和其他肠道细菌的生长的益生元作用而受到特别关注。因此，GOS通常用于婴儿配方制品、由乳杆菌发酵的饮料和酸奶中。这些含GOS的食品中的一些被日本消费者事务局(Consumer AffairsAgency)认证为“特定保健用食品(Food for Specified Health Uses)”，并且GOS被美国食品药品监督管理局(U.S.Food and Drug Administration)认证为公认的安全(GRAS)物质(GRAS公告：GRN 233、236、285、286、334、484、489、495、518和569)。

一般而言，通过用β-半乳糖苷酶(酶类别EC.3.2.1.23)的转糖基化反应(特别是转半乳糖基化反应)生产GOS。β-半乳糖苷酶是在许多微生物如环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、***克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、独特掷孢酵母(Sporobolomycessingularis)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)中产生的。β-半乳糖苷酶的三维结构不同，导致所形成的糖苷键具有立体选择性和区域选择性。例如，通常衍生自曲霉属(Aspergillus)的真菌β-半乳糖苷酶主要产生β1-6键(从而产生主要包含β1-6键的GOS制剂，其可以称为“6’-GOS”)，而衍生自芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌β-半乳糖苷酶主要产生β1-4键(产生主要包含β1-4键的GOS制剂，其也可以称为“4’-GOS”)。此外，由环状芽孢杆菌(B.circulans)生产的β-半乳糖苷酶具有特别强的转半乳糖基化活性，并且因此，由环状芽孢杆菌制备的GOS销往世界各地。

自进入市场(1999)以来，大约超过1亿的婴儿已消费由环状芽孢杆菌制备的含GOS的婴儿配方制品。它已被证明是一种安全成分，并且具有FDA承认的GRAS状态。

然而，在过去的几年中，东南亚地区已报告了少数非常罕见的GOS相关的过敏病例。研究已表明，存在于GOS中的某些低聚糖结构可能使非常敏感的受试者产生过敏反应[8]。

Jyo等人(Occup.Environ.Allergy[职业环境过敏]3,12-20(1992))确定了在摄入含6'-GOS(由真菌β-半乳糖苷酶产生)的乳杆菌饮料后的过敏症状。还观察到由细菌β-半乳糖苷酶产生的4’-GOS的过敏症状。在2014年，Kaneko等人(Biosc.Biotechnol.Biochem.[生物科学、生物技术和生物化学]78,100-108)观察到由通过用衍生自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶处理乳糖而产生的GOS可诱导***反应，并且揭示了过敏是由两种四糖[Galβ1-4(Galβ1-4Galβ1-6)Glc、Galβ1-4Galβ1-4Galβ1-3Glc]引起的。这些GOS过敏病例发生在已具有特应性史的受试者中。

诸位发明人旨在制造具有降低的变应原性的GOS制剂。特别地，他们试图鉴定用于在制造GOS制剂中使用的β-半乳糖苷酶，与通过环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶或通过米曲霉β-半乳糖苷酶获得的GOS制剂相比，该GOS制剂在受试者中诱导过敏反应的能力降低。

发明内容

令人惊讶地观察到，由衍生自隐球菌属(Cryptococcus)微生物的β-半乳糖苷酶产生的GOS制剂具有意料不到的低变应原性。更特别地，在口服激发测试中发现，使用土生隐球菌β-半乳糖苷酶获得的GOS不会在对由常规环状芽孢杆菌酶制备的GOS具有超敏性的人受试者中诱导过敏症状。

因此，本发明提供了衍生自土生隐球菌(C.terrestris)的β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)在生产低变应原性低聚半乳糖(GOS)制剂中的用途。与通过使用衍生自环状芽孢杆菌或米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂相比，所述低变应原性GOS制剂在受试者中诱导(IgE介导的)过敏反应的能力降低。更特别地，所述低变应原性GOS制剂在如下受试者中诱导(IgE介导的)过敏反应的能力降低，该受试者对通过使用衍生自环状芽孢杆菌或米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性的机会增加。

本发明还涉及可通过使用衍生自土生隐球菌(最近重命名为土生蝶孢银耳)的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)对乳糖进行转半乳糖基化而获得的低变应原性GOS制剂，用于在至少部分预防受试者中的(IgE介导的)过敏反应中使用。

本发明还涉及可通过使用衍生自土生隐球菌(最近重命名为土生蝶孢银耳)的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)对乳糖进行转半乳糖基化而获得的低变应原性GOS制剂，用于在至少部分预防受试者中的(IgE介导的)过敏反应中使用，已知该受试者对通过使用衍生自环状芽孢杆菌或衍生自米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性或对其具有超敏性的机会增加。

本发明进一步涉及可通过使用衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)对乳糖进行转半乳糖基化而获得的低变应原性GOS制剂，用于在营养组合物中使用，该营养组合物用于已知对通过使用环状芽孢杆菌或米曲霉对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加的受试者。

本发明还提供了用于至少部分预防受试者对GOS制剂具有超敏性的方法，该方法包括向该受试者施用(低变应原性)营养组合物，该营养组合物包含可通过使用衍生自土生隐球菌(最近重命名为土生蝶孢银耳)的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)对乳糖进行转半乳糖基化而获得的低变应原性GOS制剂。

本发明进一步提供了营养组合物，该营养组合物包含：(i)可通过使用衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)对乳糖进行转半乳糖基化而获得的低变应原性GOS制剂；和(ii)至少一种选自下组的其他成分，该组由以下组成：低变应原性或非变应原性蛋白质来源，优选蛋白质水解物，优选非变应原性蛋白质水解物，游离氨基酸，益生菌，LC-PUFA，和碳水化合物如乳糖、蔗糖、淀粉或麦芽糖糊精。

具体实施方式

本发明涉及衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)在生产低变应原性低聚半乳糖(GOS)制剂中的用途，其中与通过使用衍生自环状芽孢杆菌或衍生自米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂相比，所述GOS制剂在受试者中诱导(IgE介导的)过敏反应的能力降低。

要注意的是，生物体“土生隐球菌”最近重命名为“土生蝶孢银耳”。因此，名称“土生隐球菌(Cryptococcus terrestris、C.terrestris)”和“土生蝶孢银耳(Papiliotrematerrestris、P.terrestris)”是指相同生物体。在本说明书和权利要求书中，通篇使用名称土生隐球菌。然而，土生隐球菌生物体也能以名称土生蝶孢银耳提及。土生隐球菌是土生蝶孢银耳的基本异名(Liu等人,Towards an integrated phylogenetic classification ofthe Tremellomycetes[银耳纲的综合系统发育分类],Studies in Mycology[真菌学研究]81,85-147(2016))。

如本文所用的，术语“低变应原性GOS制剂”(缩写为HA-GOS)是指这样一种GOS组合物，当将该GOS组合物施用至患有至少一种类型的GOS相关的过敏(即，由环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶产生的GOS和/或由米曲霉β-半乳糖苷酶产生的GOS引起的过敏)的受试者时，与由环状芽孢杆菌或米曲霉β-半乳糖苷酶产生的GOS制剂相比时，其引起的过敏反应降低。

在一方面，术语“低变应原性GOS制剂”是指在患有环状芽孢杆菌衍生的GOS相关的过敏的受试者中至少引起降低的变应原性的GOS制剂。在这方面，与由环状芽孢杆菌产生的GOS制剂相比时，低变应原性GOS制剂引起的过敏反应降低。更特别地，与通过环状芽孢杆菌获得的GOS制剂相比时，低变应原性GOS制剂在该受试者的皮肤点刺测试中和/或在对从该受试者分离的血液样品进行的嗜碱性粒细胞活化测试中得分降低。

在另一方面，术语“低变应原性GOS制剂”是指在患有米曲霉衍生的GOS相关的过敏的受试者中至少降低的变应原性。在这方面，与由米曲霉产生的GOS制剂相比时，低变应原性GOS制剂引起的过敏反应降低。更特别地，与通过米曲霉获得的GOS制剂相比时，低变应原性GOS制剂在该受试者的皮肤点刺测试中和/或在对从该受试者分离的血液样品进行的嗜碱性粒细胞活化测试中得分降低。

在一个实施例中，本发明涉及衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)在生产低变应原性低聚半乳糖(GOS)制剂中的用途，其中与通过使用衍生自环状芽孢杆菌或衍生自米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂相比，所述GOS制剂在受试者中诱导(IgE介导的)过敏反应的能力降低。

在一个实施例中，本发明涉及衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)在生产低变应原性低聚半乳糖(GOS)制剂中的用途，其中与通过使用衍生自环状芽孢杆菌或衍生自米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂相比，所述GOS制剂在受试者(已知该受试者对通过使用环状芽孢杆菌或米曲霉对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性)中诱导(IgE介导的)过敏反应的能力降低。

例如，本发明涉及衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)在生产低变应原性低聚半乳糖(GOS)制剂中的用途，其中与通过使用衍生自环状芽孢杆菌或衍生自米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂相比，所述GOS制剂在受试者(该受试者对通过使用环状芽孢杆菌或米曲霉对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性的机会增加)中诱导(IgE介导的)过敏反应的能力降低。

在这些实施例中，该受试者是哺乳动物，特别是人。该受试者可以是任何年龄。在优选的实施例中，该受试者是青少年或成人。本文中，青少年定义为年龄为从13至20岁的人。本文中，成人定义为年龄为20岁或以上的人。在另一个优选的实施例中，该受试者是年龄为3岁(36个月)至13岁的儿童。在又另一个优选的实施例中，该受试者是年龄为0至3岁、优选年龄为18个月或以上、更优选年龄为24个月或以上的儿童。尚未报道年龄在18个月或以下的受试者中罕见的GOS相关的过敏。因此，在优选的实施例中，该受试者是年龄为18个月或以上、优选年龄为24个月或以上、更优选年龄为36个月或以上的成人、青少年或儿童。

考虑到在东南亚(例如新加坡、日本)4’-GOS相关的过敏和/或6’-GOS相关的过敏的局部发生率，该受试者优选是东南亚裔。

从天野公司(Amano)的专利申请PCT/JP 2016/089001本身已知用于在本发明中使用的用于制造低变应原性GOS的一种或多种β-半乳糖苷酶。基于日本专利申请号2015-257705，PCT/JP 2016/089001要求2015年12月29日为优先权日。

从耐热性、pH稳定性等观点出发，PCT/JP 2016/089001披露了针对β-半乳糖苷酶(其具有工业应用所需的特性)的多种微生物的筛选。这导致发现了隐球菌属的微生物(野生型菌株)，特别是产生具有高最适温度和超耐热性、此外还具有优异的转半乳糖基化活性的β-半乳糖苷酶的土生隐球菌(最近重命名为土生蝶孢银耳)。下文更详细地描述了PCT/JP2016/089001中所述的土生隐球菌衍生的β-半乳糖苷酶。PCT/JP2016/089001还描述了用于产生低聚糖的方法，该方法包括使β-半乳糖苷酶与具有β-1,3-、β-1,4-和β-1,6-键中至少一个的二糖、低聚糖或多糖反应的步骤。还披露了用于产生低聚糖的方法，该方法包括使β-半乳糖苷酶与乳糖反应的步骤。

此外，PCT/JP 2016/089001描述了通过其中披露的酶和方法获得的低聚糖混合物，特别是其中低聚糖混合物中所含的三糖的65％或更多由直链低聚糖组成的低聚糖混合物。此外，本发明涉及β-半乳糖苷酶用于产生低聚糖、产生低乳糖乳、以及产生针对乳糖不耐症患者的药物或补充剂的用途。特别地，PCT/JP 2016/089001教导了所产生的GOS可用作肠道双歧杆菌生长因子。

然而重要的是，PCT/JP 2016/089001并未解决使用其酶中任一种获得的GOS混合物的变应原性。因此，本领域中没有教导或建议本发现，即与由环状芽孢杆菌或由米曲霉(A.oryzae)制备的GOS相比，根据PCT/JP 2016/089001通过隐球菌酶获得的GOS具有令人惊讶的低变应原性。

本发明还涉及可通过使用衍生自土生隐球菌(最近重命名为土生蝶孢银耳)的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)对乳糖进行转半乳糖基化而获得的低变应原性GOS制剂，用于至少部分预防受试者中的(IgE介导的)过敏反应中使用。

本发明还提供了可通过使用衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)对乳糖进行转半乳糖基化而获得的低变应原性GOS制剂，用于在至少部分预防受试者中的(IgE介导的)过敏反应中使用，已知该受试者对通过使用衍生自环状芽孢杆菌或衍生自米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加。在一个实施例中，已知该受试者对通过使用衍生自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加。在另一个实施例中，已知该受试者对通过使用衍生自米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加。

还提供了可通过使用衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)对乳糖进行转半乳糖基化而获得的低变应原性GOS制剂，用于在营养组合物中使用，该营养组合物用于已知对通过使用环状芽孢杆菌或米曲霉β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加的受试者。在一个实施例中，已知该受试者对通过使用衍生自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加。在另一个实施例中，已知该受试者对通过使用衍生自米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加。

同样在这些实施例中，该受试者是哺乳动物，特别是人。该受试者可以是任何年龄。在优选的实施例中，该受试者是青少年或成人。在另一个优选的实施例中，该受试者是年龄为3岁(36个月)至13岁的儿童。在又另一个优选的实施例中，该受试者是年龄为0至3岁、优选年龄为18个月或以上的儿童。在另一个优选的实施例中，该受试者是年龄为18个月或以上、优选年龄为24个月或以上、更优选年龄为36个月或以上的成人、青少年或儿童。同样在这些实施例中，该受试者优选是东南亚裔。

在另一个实施例中，本发明提供了用于至少部分预防受试者对GOS制剂具有超敏性的方法，该方法包括向该受试者施用(优选低变应原性)营养组合物，该营养组合物包含可通过使用衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)对乳糖进行转半乳糖基化而获得的HA-GOS制剂。

如本文所用的，营养组合物是指出于营养目的进入消化道的任何组合物或配制品，无论是固态、液态还是气态。因此，营养组合物可以是食品或饮品。

同样在这一实施例中，该受试者是哺乳动物，特别是人，并且可以是任何年龄。在优选的实施例中，该受试者是青少年或成人。在另一个优选的实施例中，该受试者是年龄为3岁(36个月)至13岁、优选年龄为18个月或以上的儿童。在另一个优选的实施例中，该受试者是年龄为18个月或以上、优选年龄为24个月或以上、更优选年龄为36个月或以上的成人、青少年或儿童。同样在这些实施例中，该受试者优选是东南亚裔。

本发明还提供了营养组合物，该营养组合物包含：(i)可通过使用衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)对乳糖进行转半乳糖基化而获得的低变应原性GOS制剂；和(ii)至少一种选自下组的其他成分，该组由以下组成：低变应原性或非变应原性蛋白质来源，优选非变应原性乳蛋白水解物，游离氨基酸，益生菌，脂质来源和碳水化合物如乳糖、蔗糖、淀粉或麦芽糖糊精。

低变应原性或非变应原性蛋白质来源是本领域已知的，特别是用于婴儿配方制品中。如本文所用的，术语非变应原性水解物和基本上不含变应原性蛋白质的水解物是可互换的。它们是指可施用至对膳食蛋白质(更特别是牛乳蛋白)不耐受的婴儿而不会诱导***反应的蛋白质水解物。在一个实施例中，该至少一种其他低变应原性或非变应原性成分选自非变应原性蛋白质水解物和基本上不含变应原性蛋白质的水解物、低变应原性蛋白质来源和水解的乳清蛋白质。例如，US 5,039,532披露了这样一种水解的乳清蛋白质材料，其中由α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白组成的过敏原尚未从中去除，并且其中水解的蛋白质材料(包括水解的过敏原)呈分子量不大于10,000Da的水解残余物形式，使得该水解的材料基本上不含变应原性蛋白质和蛋白质来源的过敏原。在一个实施例中，包括具有最大3000Da的肽的低变应原性酪蛋白水解物。

任何类型的碳水化合物或不同碳水化合物的混合物都可以充当通常用于儿童食品配制品中的碳水化合物来源。合适的碳水化合物来源是二糖如乳糖和蔗糖，单糖如葡萄糖和麦芽糖糊精，淀粉，以及具有益生元作用的碳水化合物源。在一个实施例中，使用人乳低聚糖。

根据本发明的组合物中的脂质来源可以是适用于在(儿童)营养产品中使用的任何类型的脂质或脂质的组合。合适的脂质来源的实例是甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯、磷脂、鞘脂、脂肪酸、及其酯或盐。这些脂质可具有动物、植物、微生物或合成来源。特别令人感兴趣的是多不饱和脂肪酸(PUFA)，如γ亚麻酸(GLA)、二高γ亚麻酸(DHGLA)、花生四烯酸(AA)、硬脂酸(SA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPA)和共轭亚油酸(CLA)。CLA对于预防儿童的湿疹和呼吸道疾病很重要。这特别涉及CLA的顺式9、反式11和顺式12异构体。合适的植物脂质来源的实例包括葵花油、高油酸葵花油、椰子油、棕榈油、棕榈仁油、大豆油等。动物来源的合适的脂质来源的实例包括乳脂，例如无水乳脂(AMF)、奶油等。在优选的实施例中，使用乳脂和植物来源的脂质的组合。

在实施例中，根据本发明的组合物包含益生菌。在本发明的上下文中，术语“益生菌”是指益生细菌的菌株。益生细菌是本领域已知的。合适地，益生细菌不经基因修饰。合适的益生细菌包括双歧杆菌属(例如，短双歧杆菌(B.breve)、长双歧杆菌(B.longum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、两歧双歧杆菌(B.bifidum))的细菌，乳杆菌属(例如，嗜酸乳杆菌(L.Acidophilus)、类干酪乳杆菌(L.paracasei)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、植物乳杆菌(L.plantarum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、干酪乳杆菌(L.casei)、乳酸乳杆菌(L.lactis))的细菌，以及链球菌属(例如，嗜热链球菌(S.thermophilus))的细菌。短双歧杆菌和长双歧杆菌是尤其合适的益生菌。合适的短双歧杆菌菌株可以例如从健康的人乳喂养婴儿的粪便中分离。

益生元和益生菌的组合也称为“合生元”。在本发明的上下文中，益生菌能以任何合适的浓度，合适地以治疗有效量或“有效治疗量”存在于组合物中。合适地，益生菌以10exp2-10exp13cfu/g组合物干重、合适地10exp5-10exp12cfu/g、最合适地10exp7-10exp10cfu/g的量包括在本发明的组合物中。

此外，该组合物可含有一种或多种常规微量成分，如维生素、抗氧化剂、矿物质、游离氨基酸、核苷酸、牛磺酸、肉碱和多胺。合适的抗氧化剂的实例是BHT、抗坏血酸棕榈酸酯、维生素E、α和β胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、番茄红素和磷脂。

此外提供了用于提供低变应原性营养组合物的方法，该方法包括：(i)使乳糖饲料与衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)接触以提供低变应原性低聚半乳糖(GOS)制剂，和(ii)将所述低变应原性GOS制剂与至少一种其他低变应原性或非变应原性成分一起配制成低变应原性营养组合物。还提供了可通过本发明的方法获得的低变应原性营养组合物。

根据本发明的组合物可以用作营养组合物、营养疗法、营养支持，用作医疗食品，用作用于特殊医疗目的的食品或用作营养补充剂。合适地，本发明的组合物是肠内组合物。将该组合物施用至或旨在施用至对其有需要的受试者。该受试者是哺乳动物，特别是人，并且该受试者可以是任何年龄。在优选的实施例中，该受试者是成人。该受试者可以是例如老年人或绝经后妇女。该受试者也可以是孕妇。因此，在一些实施例中，本发明的组合物是用于孕妇的MUM组合物。在另一个优选的实施例中，该受试者是青少年。

在另一个优选的实施例中，该受试者是年龄为3岁(36个月)至13岁的儿童。在这一实施例中，优选的是，儿童的年龄为3岁至6岁。因此，在一些实施例中，本发明的组合物是用于年龄为36个月或更大的儿童的成长型奶粉(growing-up milk)。

在又另一个优选的实施例中，该受试者是年龄为0至3岁、优选年龄为18个月或以上、更优选年龄为24个月或以上的儿童。在这一实施例中，该受试者选自由以下组成的组：儿童和婴儿，包括年龄不超过3岁的幼儿。因此，在一些实施例中，本发明的组合物是婴儿配方制品、较大婴儿配方制品或成长型奶粉。

在特别的实施例中，该组合物用于施用至处于发展过敏(尤其是牛乳蛋白过敏(CMA))风险的受试者，特别是婴儿。已知处于发展过敏风险的婴儿包括由至少一位患有或已患有特应性病症(例如湿疹)和/或过敏(最特别是CMA)的父母所生的婴儿。

考虑到在东南亚(例如新加坡、日本)4’-GOS相关的过敏和/或6’-GOS相关的过敏的局部发生率，该受试者优选是东南亚裔。

根据本发明使用的酶是衍生自酵母土生隐球菌的β-半乳糖苷酶。如上所述，生物体土生隐球菌最近重命名为土生蝶孢银耳，并且因此名称“土生隐球菌(Cryptococcusterrestris、C.terrestris)”和“土生蝶孢银耳(Papiliotrema terrestris、P.terrestris)”是指相同生物体。在本说明书和权利要求书中，通篇使用名称土生隐球菌，但土生隐球菌生物体也能以名称土生蝶孢银耳提及。本文中，“衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶”意指由被分类为土生隐球菌的(野生型菌株或突变体菌株的)微生物产生的β-半乳糖苷酶，或者通过基因工程程序使用β-半乳糖苷酶基因从被分类为土生隐球菌的(野生型菌株或突变体菌株的)微生物获得的β-半乳糖苷酶。因此，术语“衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶”还涵盖由宿主微生物产生的重组酶，该宿主微生物中已引入获得自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶基因(或其经修饰的基因)。

一般而言，β-半乳糖苷酶显示乳糖水解活性(通过作用于β-1,4键水解乳糖的活性)和转半乳糖基化活性(转移半乳糖的活性)。因此，如本文所用的，表述“β-半乳糖苷酶活性”旨在包括这两种活性。

如实例部分所示，PCT/JP 2016/089001的发明人成功地从土生隐球菌菌株MM13-F2171及其突变体菌株M2和M6中分离和纯化了具有上述特性的β-半乳糖苷酶。突变体菌株(M2和M6)是通过用UV处理进行诱变的方式从土生隐球菌菌株MM13-F2171获得的。土生隐球菌菌株MM13-F2171和M2已按如下所述保藏在保藏机构，并且易于获得。

<土生隐球菌菌株MM13-F2171>

保藏机构：专利微生物保藏机构(Patent Microorganisms Depositary)，日本技术与评价研究所(National Institute of Technology and Evaluation)(122室，2-5-8，千叶县木更津市上总镰足(Kazusa Kamatari,Kisarazu-shi,Chiba)，292-0818，日本)。识别参考：土生隐球菌MM13-F2171。保藏日期：2015年12月10日。登录号：NITE BP-02177；

<土生隐球菌菌株M2>

保藏机构：专利微生物保藏机构(Patent Microorganisms Depositary)，日本技术与评价研究所(National Institute of Technology and Evaluation)(122室，2-5-8，千叶县木更津市上总镰足(Kazusa Kamatari,Kisarazu-shi,Chiba)，292-0818，日本)。识别参考：土生隐球菌APC-6431。保藏日期：2015年12月10日。登录号：NITE BP-02178

因此，在一个实施例中，用于本发明的酶衍生自土生隐球菌菌株MM13-F2171(登录号：NITE BP-02177)或APC-6431(登录号：NITE BP-02178)。

因此，本发明还涉及衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)在生产低变应原性低聚半乳糖(GOS)制剂中的用途，其中与通过使用衍生自环状芽孢杆菌或衍生自米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂相比，所述GOS制剂在受试者中诱导(IgE介导的)过敏反应的能力降低，并且其中该β-半乳糖苷酶衍生自土生隐球菌菌株MM13-F2171(登录号：NITE BP-02177)或APC-6431(登录号：NITE BP-02178)。合适地，已知该受试者对通过使用环状芽孢杆菌或米曲霉对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加。在一个实施例中，已知该受试者对通过使用环状芽孢杆菌对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加，并且与通过使用衍生自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂相比，所述GOS制剂在受试者中诱导(IgE介导的)过敏反应的能力降低。在另一个实施例中，已知该受试者对通过使用米曲霉对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加，并且与通过使用衍生自米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂相比，所述GOS制剂在受试者中诱导(IgE介导的)过敏反应的能力降低。

本发明进一步涉及可通过使用衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)对乳糖进行转半乳糖基化而获得的低变应原性GOS制剂，用于在至少部分预防受试者中的(IgE介导的)过敏反应中使用，其中该β-半乳糖苷酶衍生自土生隐球菌菌株MM13-F2171(登录号：NITE BP-02177)或APC-6431(登录号：NITE BP-02178)。本发明进一步涉及可通过使用衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)对乳糖进行转半乳糖基化而获得的低变应原性GOS制剂，用于在至少部分预防受试者中的(IgE介导的)过敏反应中使用，已知该受试者对通过使用衍生自环状芽孢杆菌或衍生自米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加，其中该β-半乳糖苷酶衍生自土生隐球菌菌株MM13-F2171(登录号：NITE BP-02177)或APC-6431(登录号：NITEBP-02178)。在一个实施例中，已知该受试者对通过使用衍生自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加。在另一个实施例中，已知该受试者对通过使用衍生自米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加。

此外，本发明涉及可通过使用衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)对乳糖进行转半乳糖基化而获得的低变应原性GOS制剂，用于在营养组合物中使用，该营养组合物用于已知对通过使用环状芽孢杆菌或米曲霉对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加的受试者，其中该β-半乳糖苷酶衍生自土生隐球菌菌株MM13-F2171(登录号：NITE BP-02177)或APC-6431(登录号：NITE BP-02178)。在一个实施例中，已知该受试者对通过使用环状芽孢杆菌对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加。在另一个实施例中，已知该受试者对通过使用米曲霉对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加。

本发明还涉及用于至少部分预防受试者对GOS制剂具有超敏性的方法，该方法包括向该受试者施用(低变应原性)营养组合物，该营养组合物包含可通过使用衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)对乳糖进行转半乳糖基化而获得的低变应原性GOS制剂，其中该β-半乳糖苷酶衍生自土生隐球菌菌株MM13-F2171(登录号：NITE BP-02177)或APC-6431(登录号：NITE BP-02178)。

同样在这些实施例中，该受试者是哺乳动物，特别是人。该受试者可以是任何年龄。在优选的实施例中，该受试者是青少年或成人。在另一个优选的实施例中，该受试者是年龄为3至13岁的儿童。在又另一个优选的实施例中，该受试者是年龄为0至3岁、优选年龄为18个月或以上的儿童。在另一个优选的实施例中，该受试者是年龄为18个月或以上、优选年龄为24个月或以上的成人、青少年或儿童。同样在这些实施例中，该受试者优选是东南亚裔。

此外，PCT/JP 2016/089001描述了由衍生自隐球菌属微生物的突变体菌株(突变体菌株酶1、2和3)产生的三种类别的β-半乳糖苷酶，并确定了它们的氨基酸序列。发现这三种β-半乳糖苷酶具有野生型菌株酶(该野生型菌株酶如图1A所示；SEQ ID NO:1)的全长氨基酸序列的部分序列，该部分序列是从其基因序列推导的。特别地，这些突变体酶是：具有其中缺失该野生型菌株酶的全长氨基酸序列的N末端130个氨基酸残基的氨基酸序列的酶，出于描述的目的，该酶被称为“突变体菌株酶1”(参见图1B；SEQ ID NO:2)；具有其中缺失该野生型菌株酶的全长氨基酸序列的N末端136个氨基酸残基的氨基酸序列的酶(参见图1C；SEQ ID NO:3)，出于描述的目的，该酶被称为“突变体菌株酶2”；以及具有其中缺失该野生型菌株酶的全长氨基酸序列的N末端141个氨基酸残基的氨基酸序列的酶(参见图1D；SEQID NO:4)，该酶被称为“突变体菌株酶3”。

因此，用于在本发明的优选的实施例中使用的衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶包含SEQ ID NO:1、2、3或4中任一项所述的氨基酸序列，或者与所述氨基酸序列等同的氨基酸序列。

而且，可以使用两种或更多种衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶的组合，其中每种酶包含SEQ ID NO:1、2、3或4中任一项所述的氨基酸序列，或者与所述氨基酸序列中任一种等同的氨基酸序列。在一个实施例中，使用至少一种突变体酶(SEQ ID NO 2、3或4，或其等同物)。优选地，使用两种或更多种突变体酶，任选地与野生型酶组合。例如，使用两种或更多种酶的组合，每种酶包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者与所述氨基酸序列等同的氨基酸序列。在特定方面，该酶组合包含三种不同的突变体酶和野生型酶。

在这种情况下，术语“等同的氨基酸序列”意指与参考氨基酸序列(即，SEQ ID NO:1至4中任一项所述的氨基酸序列)部分不同但该差异基本上不影响蛋白质功能(β-半乳糖苷酶活性)的氨基酸序列。因此，具有等同的氨基酸序列的多肽链的酶显示β-半乳糖苷酶活性。

只要可以呈现β-半乳糖苷酶的功能，活性程度就没有特别限制，但优选等同于或高于具有参考序列的多肽链的酶的活性程度。优选地，等同的氨基酸序列的长度不大于SEQID NO:1的序列的长度。

通常，术语“氨基酸序列的部分差异”意指由一个至若干个(至多例如3、5、7或10个)包含氨基酸序列的氨基酸的缺失或取代，或者一个至若干个(至多例如3、5、7或10个)氨基酸的添加、***或其组合导致的氨基酸序列中的突变(改变)。只要维持β-半乳糖苷酶活性(该活性会在一定程度上变化)，氨基酸序列的差异就是可接受的。只要满足条件，氨基酸序列的差异的位置就没有特别限制，并且该差异可出现在多个位置。术语“多个”意指例如对应于总氨基酸的小于约20％、优选小于约15％、更优选小于约10％、甚至更优选小于约5％、并且最优选小于约1％的数目。更特别地，等同的蛋白质具有与参考氨基酸序列例如约80％或更多、优选约85％或更多、更优选约90％或更多、非常优选约95％或更多、甚至更优选约97％或更多、并且最优选约99％或更多的同一性。

氨基酸序列的差异可出现在多个位置。优选地，通过在对于β-半乳糖苷酶活性不是必需的氨基酸残基中进行保守的氨基酸取代来获得等同蛋白质。术语“保守的氨基酸取代”意指一个氨基酸残基被具有类似特性的侧链的另一个氨基酸残基取代。

氨基酸残基根据其侧链分为若干个家族，如碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸和谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)，β支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)，以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。优选地，保守的氨基酸取代是一个家族中氨基酸残基之间的取代。

可以通过以下程序确定两个氨基酸序列或两个核酸序列(下文中，术语“两个序列”用于表示两个序列中的任一个)之间的同一性(％)。首先，对两个序列进行比对，以最佳地比较这两个序列(例如，可以将空位引入第一序列以优化相对于第二序列的比对)。当第一序列中特定位置处的分子(氨基酸残基或核苷酸)与第二序列中对应位置处的分子彼此相同时，将这些位置处的分子定义为是相同的。两个序列之间的同一性是由这两个序列共有的相同位置的数目的函数(即，同一性(％)＝相同位置的数目/位置的总数％100)。优选地，考虑了优化这两个序列的比对所需的空位的数目和大小。

两个序列之间的同一性的比较和确定可以通过使用数学算法来进行。可用于比较序列的数学算法的特定实例包括描述于Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]87:2264-68中并且由Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-77修改的算法。然而，算法不一定限于此。将这种算法并入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10描述的NBLAST程序和XBLAST程序(2.0版)中。为了获得等同的核酸序列，例如，可以通过NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索(其中得分＝100且字长＝12)。为了获得等同的氨基酸序列，例如，可以通过XBLAST程序进行BLAST多肽搜索(其中得分＝50且字长＝3)。为了获得用于比较的空位比对，可以使用Altschul等人,(1997)Amino Acids Research[氨基酸研究]25(17):3389-3402所述的空位BLAST。在使用BLAST和空位BLAST时，可以使用对应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。详情参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。可用于比较序列的数学算法的另一个实例包括描述于Meyers和Miller(1988)Comput.Appl.Biosci.[计算机在生物科学中的应用]4:11-17中的算法。将此类程序并入可用于例如GENESTREAM网络服务器(IGH蒙彼利埃(Montpellier)，法国)或ISREC服务器的ALIGN程序中。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，例如，可以使用PAM120权重残基表，其中空位长度罚分为12且空位罚分为4。

可以通过使用GCG软件包中的GAP程序，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵(其中空位权重为12、10、8、6或4且空位长度权重为2、3或4)来确定两个氨基酸序列之间的同一性。可以通过使用GCG软件包中的GAP程序(可在http://www.gcg.com处获得)(其中空位权重为50且空位长度权重为3)来确定两个核酸序列之间的同一性。该酶可以是更大的蛋白质(例如，融合蛋白质)的一部分。添加至融合蛋白质的序列的实例包括可用于纯化多个组氨酸残基的序列/标签，以及确保在重组产生中的稳定性的添加序列。

本发明还涉及β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)在生产低变应原性低聚半乳糖(GOS)制剂中的用途，其中与通过使用衍生自环状芽孢杆菌或衍生自米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂相比，所述GOS制剂在受试者中诱导(IgE介导的)过敏反应的能力降低，并且其中该β-半乳糖苷酶包含根据SEQ ID NO:1、2、3或4中任一项所述的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1、2、3或4中任一项是至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、还甚至更优选至少97％、并且最优选至少99％相同的氨基酸序列。

本发明还涉及衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)在生产低变应原性低聚半乳糖(GOS)制剂中的用途，其中与通过使用衍生自环状芽孢杆菌或衍生自米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂相比，所述GOS制剂在受试者中诱导(IgE介导的)过敏反应的能力降低，并且其中该β-半乳糖苷酶包含根据SEQ ID NO:1、2、3或4中任一项所述的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1、2、3或4中任一项是至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、还甚至更优选至少97％、并且最优选至少99％相同的氨基酸序列。合适地，已知该受试者对通过使用环状芽孢杆菌或米曲霉对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加。在一个实施例中，已知该受试者对通过使用环状芽孢杆菌对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加，并且与通过使用衍生自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂相比，所述GOS制剂在受试者中诱导(IgE介导的)过敏反应的能力降低。在另一个实施例中，已知该受试者对通过使用米曲霉对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加，并且与通过使用衍生自米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂相比，所述GOS制剂在受试者中诱导(IgE介导的)过敏反应的能力降低。

本发明进一步涉及可通过使用β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)对乳糖进行转半乳糖基化而获得的低变应原性GOS制剂，用于在至少部分预防受试者中的(IgE介导的)过敏反应中使用，其中该β-半乳糖苷酶包含根据SEQ ID NO:1、2、3或4中任一项所述的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1、2、3或4中任一项是至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、还甚至更优选至少97％、并且最优选至少99％相同的氨基酸序列。在另外的实施例中，已知所述受试者对通过使用衍生自环状芽孢杆菌或衍生自米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加。本发明进一步涉及可通过使用衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)对乳糖进行转半乳糖基化而获得的低变应原性GOS制剂，用于在至少部分预防受试者中的(IgE介导的)过敏反应中使用，已知该受试者对通过使用衍生自环状芽孢杆菌或衍生自米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加，其中该β-半乳糖苷酶包含根据SEQ ID NO:1、2、3或4中任一项所述的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1、2、3或4中任一项是至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、还甚至更优选至少97％、并且最优选至少99％相同的氨基酸序列。在一个实施例中，已知该受试者对通过使用衍生自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加。在另一个实施例中，已知该受试者对通过使用衍生自米曲霉的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加。

此外，本发明涉及可通过使用衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)对乳糖进行转半乳糖基化而获得的低变应原性GOS制剂，用于在营养组合物中使用，该营养组合物用于已知对通过使用环状芽孢杆菌或米曲霉对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加的受试者，其中该β-半乳糖苷酶包含根据SEQ ID NO:1、2、3或4中任一项所述的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1、2、3或4中任一项是至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、还甚至更优选至少97％、并且最优选至少99％相同的氨基酸序列。在一个实施例中，已知该受试者对通过使用环状芽孢杆菌对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加。在另一个实施例中，已知该受试者对通过使用米曲霉对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏性、或对其具有超敏性的机会增加。

本发明还涉及用于至少部分预防受试者对GOS制剂具有超敏性的方法，该方法包括向该受试者施用(低变应原性)营养组合物，该营养组合物包含可通过使用衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)对乳糖进行转半乳糖基化而获得的低变应原性GOS制剂，其中该β-半乳糖苷酶包含根据SEQ ID NO:1、2、3或4中任一项所述的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1、2、3或4中任一项是至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、还甚至更优选至少99％、并且最优选至少98％相同的氨基酸序列。

同样在这些实施例中，该受试者是哺乳动物，特别是人。该受试者可以是任何年龄。在优选的实施例中，该受试者是青少年或成人。在另一个优选的实施例中，该受试者是年龄为3至13岁的儿童。在又另一个优选的实施例中，该受试者是年龄为0至3岁、优选年龄为18个月或以上的儿童。在另一个优选的实施例中，该受试者是年龄为18个月或以上、优选年龄为24个月或以上的成人、青少年或儿童。同样在这些实施例中，该受试者优选是东南亚裔。

具有上述氨基酸序列的用于在本发明中使用的酶也可以通过基因工程技术来制备。例如，通过编码本发明的酶的DNA转化适当的宿主细胞(例如，大肠杆菌(Escherichiacoli))，并收集在转化体中表达的蛋白质，从而制备本发明的酶。根据预期用途对收集的蛋白质进行适当处理。对由此获得的作为重组蛋白质的酶进行多种修饰。例如，可以通过使用载体产生重组蛋白质来获得由与任何肽或蛋白质连接的重组蛋白质组成的酶，该载体中已***编码该酶的DNA连同其他适当的DNA。另外，可以进行修饰以引起糖链和/或脂质的添加，或者N末端或C末端处理。这些修饰允许例如提取重组蛋白质、简化纯化或添加生物学功能。

PCT/JP 2016/089001的发明人还表征了已获得的新颖的β-半乳糖苷酶的酶促特性。因此，如在PCT/JP 2016/089001中所述的，用于在本发明中使用的酶的特征在于以下(1)至(3)中所述的酶促特性。

(1)酶促作用

该酶具有乳糖水解活性和转半乳糖基化活性，其中该酶经由β-1,4-键转移半乳糖基残基的活性优于经由β-1,6-键、β-1,3-键或β-1,2-键转移半乳糖基残基的活性。即，该酶具有优异的经由β-1,4-键转移半乳糖基残基的活性。因此，使用该酶允许有效产生具有经由β-1,4-链附接的转移的糖残基的(低变应原性)产品。例如，酶与乳糖(其是该酶的底物)反应生成富含直链低聚糖的三糖低聚糖的混合物。在将乳糖用作在PCT/JP2016/089001的实例部分(在标题为“低聚糖产生能力1的检查”部分中)所述的反应条件下与本发明的酶反应的底物时获得的三糖低聚糖的情况下，65％或更多、优选70％或更多、进一步优选72％或更多、仍进一步优选73％或更多、更优选75％或更多的所得三糖低聚糖由仅具有β-1,4-糖苷键(O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-D-葡萄糖)的低聚糖组成。

在这些情况下，由该酶产生的直链低聚糖是低聚半乳糖。一般而言，该低聚半乳糖由Gal-(Gal)n-Glc表示，其中n为1至5左右，Gal为半乳糖残基，并且Glc为葡萄糖残基。糖残基之间的连接类型包括β-1,4、β-1,6、β-1,3和β-1,2，并且除了这些之外，还包括α-1,3、α-1,6等等。

因此，如本文所用的，“低聚半乳糖(GOS)”意指两个或更多个糖残基的低聚半乳糖，即具有(除乳糖之外)聚合度为2或更高的低聚半乳糖。

(2)最适温度

该酶的最适温度为70℃。该酶的如此高的最适温度有利于用作用于产生低聚糖的酶。当该酶用于产生低聚糖时，可以将过程(反应)温度设定至更高。本文中，该最适温度可以通过使用乙酸盐缓冲液(pH 6.0)并以乳糖作为底物进行测量的方法来确定。

(3)分子量

PCT/JP 2016/089001中披露的野生型菌株酶和突变体菌株酶1至3各自包含一种或多种糖链；当去除N连接的糖链和O连接的糖链后通过SDS-PAGE确定这些酶的分子量时，发现它们的分子量为104kDa(针对野生型菌株酶)、64kDa(针对突变体菌株酶1)、61kDa(针对突变体菌株酶2)、和61kDa(针对突变体菌株酶3)。基于这些发现，根据一个实施例，用于在本发明中使用的不含糖链的酶具有104kDa的分子量(通过SDS-PAGE)。根据另一个实施例，用于本发明的不含糖链的酶具有64kDa的分子量(通过SDS-PAGE)。根据另外的另一个实施例，不含糖链的酶具有61kDa的分子量(通过SDS-PAGE)。当上述酶没有进行用于去除糖链的处理时，发现它们的分子量为120kDa(针对野生型菌株酶)、71kDa(针对突变体菌株酶1)、66kDa(针对突变体菌株酶2)、和66kDa(针对突变体菌株酶3)。

根据本发明使用的酶的特征进一步在于以下(4)至(6)中所述的酶促特性。

(4)最适pH

该酶的最适pH为4至5。例如，基于使用pH范围为pH 2至3的0.1M甘氨酸缓冲液、pH范围为pH 3至6的0.1M柠檬酸盐缓冲液、pH范围为pH 5至6的0.1M乙酸盐缓冲液、pH范围为pH 7至8的0.1M磷酸盐缓冲液、以及pH范围为pH 9至10的0.1M碳酸钠缓冲液进行的测量结果来确定最适pH。

(5)pH稳定性

在一个实施例中，本发明的酶在pH 2至8的pH范围内呈现稳定的酶促活性，并且在另一个实施例中，本发明的酶在pH 2至9的pH范围内呈现稳定的酶促活性。换言之，如果待处理的酶溶液的pH在该pH范围内，那么在40℃下进行30分钟的pH处理后的酶显示出最大活性的80％或更多的活性。例如，基于使用pH范围为pH 2至3的0.1M甘氨酸缓冲液、pH范围为pH 3至6的0.1M柠檬酸盐缓冲液、pH范围为pH 5至6的0.1M乙酸盐缓冲液、pH范围为pH 7至8的0.1M磷酸盐缓冲液、以及pH范围为pH 9至10的0.1M碳酸钠缓冲液进行的测量结果来确定pH稳定性。

(6)热稳定性

在一个实施例中，即使将该酶在30℃至60℃的温度条件下在乙酸盐缓冲液(pH6.0)中处理30分钟，如本文披露的使用的酶仍保留最大活性的80％或更多的活性。在另一个实施例中，即使将该酶在30℃至65℃的温度条件下在乙酸盐缓冲液(pH 6.0)中处理30分钟，该酶仍保留该活性的80％或更多的活性。

PCT/JP 2016/089001还披露了编码用于在本发明中使用的酶的基因。在一个实施例中，该基因包括编码SEQ ID NO:1至4中任一项所述的氨基酸序列的DNA。该实施例的特定实例是由SEQ ID NO:5的核酸序列组成的cDNA(编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列)、由SEQ IDNO:6的核酸序列组成的cDNA(编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列)、由SEQ ID NO:7的核酸序列组成的cDNA(编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列)、以及由SEQ ID NO:8的核酸序列组成的cDNA(编码SEQ ID NO:4的氨基酸序列)。另外的实例是由SEQ ID NO:16组成的基因组DNA。该基因组DNA对应于SEQ ID NO:5的cDNA。

通常，该基因用于制备PCT/JP 2016/089001中披露的且在本发明中使用的衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶。根据使用编码酶的基因的基因工程程序，能以更均一的状态获得该酶。此外，在制备大量酶的情况下，该方法也可以是优选的方法。还考虑了密码子的简并性。

如PCT/JP 2016/089001中所披露的，参照所附序列表中披露的序列信息，可以通过使用标准基因工程技术、分子生物学技术、生物化学技术、化学合成、PCR方法(例如，重叠延伸PCR)或其组合以分离的状态制备用于在制备衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶中使用的基因。

一般而言，并且也如PCT/JP 2016/089001中所述的，当编码某种蛋白质的DNA的一部分被修饰时，由经修饰的DNA编码的蛋白质有时可能具有与修饰前的DNA编码的蛋白质相同的功能。也就是说，DNA序列的修饰对编码蛋白质的功能没有实质性影响，使得在修饰之前和之后，可以维持该编码蛋白质的功能。因此，编码蛋白质的DNA可以具有与参考碱基序列(即，SEQ ID NO:5至8、16中的任一个)等同的核酸序列，并且具有β-半乳糖苷酶活性(下文也称为“等同的DNA”)。

本文中“等同的核酸序列”是指与参考核酸序列部分地不同，但是其中由该序列编码的蛋白质的功能(本文中，β-半乳糖苷酶活性)基本上不受该差异影响的核酸序列。

等同的DNA的特定实例包括在严格条件下与参考核酸序列的互补碱基序列杂交的DNA。本文中，“严格条件”是指其中形成所谓的特异性杂交体但不形成非特异性杂交体的条件。此类严格条件是本领域技术人员已知的。此类严格条件可以参考例如MolecularCloning[分子克隆](第三版,Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室出版社],纽约)和Current protocols in molecular biology[当代分子生物学方案](由FrederickM.Ausubel等人编辑,1987)来设定。严格条件的实例可包括使用杂交溶液(50％甲酰胺，10×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.0)，5×Denhardt溶液，1％SDS，10％硫酸葡聚糖，10μg/ml变性的鲑鱼***DNA，以及50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5))并将其在约42℃至约50℃下孵育，随后在约65℃至约70℃下用0.1×SSC和0.1％SDS洗涤的条件。进一步优选的严格条件可包括例如使用杂交溶液(50％甲酰胺，5×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.0)，1×Denhardt溶液，1％SDS，10％硫酸葡聚糖，10μg/ml变性的鲑鱼***DNA，以及50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5))的条件。

如PCT/JP2016/089001中所披露的，等同的DNA的另一个特定实例可包括具有如下核酸序列的编码蛋白质的DNA，该核酸序列包括在参考序列的一个或多个核酸(优选一个至若干个核酸)中的取代、缺失、***、添加或倒位，并且具有β-半乳糖苷酶活性。该核酸的取代、缺失等可发生在多个位点。尽管取决于由DNA编码的蛋白质的三维结构中氨基酸残基的位置或类型，但是本文中“多个”是指例如2至40个碱基、优选2至20个核酸、并且更优选2至10个核酸。等同的DNA显示出与参考核酸序列60％或更多的同一性，例如，优选70％或更多的同一性、更优选80％或更多的同一性、更加优选85％或更多的同一性、再更优选90％或更多的同一性，甚至更优选95％或更多的同一性、并且最优选99％或更多的同一性。上述等同的DNA可以通过以下获得：使用限制酶处理通过修饰参考DNA以包括核酸的取代、缺失、***、添加和/或倒位；用核酸外切酶、DNA连接酶等处理；通过定点诱变(Molecular Cloning[分子克隆],第三版,第13章,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约)和随机诱变(Molecular Cloning[分子克隆],20第三版,第13章,Cold SpringHarbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约)等引入突变。此外，该等同的DNA也可以通过其他方法如用紫外线照射来获得。等同的DNA的另外的实例可包括由于以SNP(单核苷酸多态性)表示的多态性而具有如上所述核酸差异的DNA。

因此，该核酸也可以是具有如下碱基序列的核酸，该碱基序列与编码在本发明中使用的酶的基因的碱基序列互补。例如，该核酸可以具有如下碱基序列，该碱基序列与编码在本发明中使用的酶的基因的碱基序列或与其互补的碱基序列具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％的同一性。该DNA也可以是含有编码在本发明中使用的酶的基因的重组DNA。

合适地，该重组DNA以例如载体的形式提供。在本说明书中，术语“载体”是指可以将***该载体中的核酸转移至靶标(如细胞)的核酸分子。根据其预期用途(克隆、蛋白质表达)并考虑宿主细胞的种类来选择合适的载体。

实例包括M13噬菌体或其改变形式，λ噬菌体或其改变形式，以及pBR322或其改变形式(例如，pB325、pAT153、pUC8)等作为以大肠杆菌为宿主的载体，pYepSec1、pMFa和pYES2作为以酵母为宿主的载体，pAc、pVL等作为以昆虫细胞为宿主的载体，并且pCDM8、pMT2PC等作为以哺乳动物细胞为宿主的载体。该载体优选是表达载体。“表达载体”是指能够将***该表达载体中的核酸引入至靶细胞(宿主细胞)并在该细胞中表达它的载体。该表达载体通常含有表达所***的核酸所必需的启动子序列、用于促进表达的增强子序列等。

也可以使用含有选择性标记物的表达载体。当使用这种表达载体时，可以使用选择性标记物来确认存在或不存在该表达载体的引入(及其程度)。

可以通过使用标准重组DNA技术(例如，使用限制酶和DNA连接酶的已知方法，其可以参考Molecular Cloning[分子克隆],第三版,1.84,Cold Spring Harbor LaboratoryPress[冷泉港实验室出版社],纽约)将DNA***至载体、***选择性标记物基因(如果需要的话)、***启动子(如果需要的话)等。

如在PCT/JP 2016/089001中所述的，用于在本发明中使用的酶有利地通过转化体产生，该转化体中引入了编码衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)的重组DNA，使得该基因作为外源分子存在。优选地，使用上述载体通过转染或转化制备该转化体。可以使用本领域已知的方法进行转染和转化，例如通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔、脂质转染、显微注射、Hanahan法(Hanahan,D.,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166,557-580(1983))、乙酸锂法(Schiestl,R.H.等人,Curr.Genet.[当代遗传学]16,339-346(1989))、原生质体-聚乙二醇法(Yelton,M.M.等人,Proc Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]81,1470-1474(1984))等。

只要可以表达本发明的酶，宿主细胞就没有特别限制，并且它可以选自例如，芽孢杆菌属细菌(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、环状芽孢杆菌等)，乳酸菌(例如乳球菌(Lactococcus)、乳杆菌、链球菌(Streptococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、双歧杆菌等)，其他细菌(例如埃希氏菌(Escherichia)、链霉菌(Streptomyces)等)，酵母(例如酵母菌(Saccharomyces)、克鲁维酵母菌(Kluyveromyces)、念珠菌(Candida)、圆酵母菌(Torula)、球拟酵母菌(Torulopsis)、毕赤酵母菌(Pichia)、裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces)等)，以及丝状真菌(真菌纲)(例如曲霉属真菌如米曲霉和黑曲霉(Aspergillus niger)、青霉属真菌、木霉属真菌、镰刀菌属真菌等)。

PCT/JP 2016/089001还描述了用于产生β-半乳糖苷酶的方法，该方法有利地用于本发明中。披露了如下方法，该方法包括培养土生隐球菌的细胞的步骤(步骤(1))；以及从培养基和/或细胞收集β-半乳糖苷酶的步骤(步骤(2))。优选地，对于土生隐球菌，使用土生隐球菌菌株MM13-F2171或其突变体菌株，例如土生隐球菌APC-6431(菌株M2)及其另外的突变体菌株。

只要产生酶，用于培养土生隐球菌的细胞的条件和方法就没有特别限制。因此，可以适当地(条件是产生酶)设定适于培养待使用的微生物的方法和培养条件。该细胞培养物可包含两种或更多种土生隐球菌菌株的混合物，例如，野生型菌株MM13-F2171及其一种或多种突变体菌株，例如，土生隐球菌APC-6431(菌株M2)和/或土生隐球菌菌株M6。在这些情况下，可以同时分离和纯化两种或更多种酶。

尽管可以通过液体培养或固体培养进行培养，但优选采用液体培养。至于培养基，只要待使用的微生物可以生长，就可以使用任何培养基。例如，可以使用补充有碳源如葡萄糖、蔗糖、龙胆二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜和有机酸，以及氮源如硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、乙酸铵或蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、糠和肉提取物，以及还有无机盐如钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐和锌盐等的培养基。

为了促进待使用的转化体的生长，可以将维生素、氨基酸等添加至该培养基中。可以在有氧条件下培养该培养基，使得该培养基的pH调节至例如约3至8(优选约4至7)，并且培养温度通常为约20℃至40℃(优选约25℃至35℃)，持续1至10天(优选3至6天)。培养方法的实例可包括振荡培养方法和通过使用广口发酵罐的有氧浸没培养方法。

在上述条件下培养后，从培养液或细胞体中收集一种或多种靶蛋白(步骤(2))。当从培养液收集酶时，可以通过去除不溶性物质(通过例如过滤培养上清液、离心等)，随后进行例如通过超滤膜的浓缩、通过硫酸铵沉淀的盐析、透析、离子交换树脂的多种类型的色谱法、或其适当组合而通过分离和纯化来获得该酶。另一方面，当从细胞体收集一种或多种靶蛋白时，可以通过加压处理、超声处理等将细胞体粉碎，随后通过类似于上述的其分离和纯化来获得该一种或多种靶蛋白。

通过过滤、离心等从培养液收集细胞体后，可以进行上述一系列的处理(细胞体的粉碎、分离和纯化)。用于在本发明中使用的一种或多种β-半乳糖苷酶也可以通过使用上述转化体来产生。然后在使得产生由引入其中的基因编码的蛋白质的条件下培养该转化体(步骤(i))。

转化体的培养条件对于多种载体-宿主系统是已知的，并且本领域技术人员可以容易地设定适当的培养条件。培养步骤后，收集产生的蛋白质(β-半乳糖苷酶)(步骤(ii))。收集和随后的纯化可以按与上述实施例相同的方式进行。一种或多种β-半乳糖苷酶的纯化度没有特别限制。此外，一种或多种β-半乳糖苷酶的最终形式可以是液态或固态(包括粉末形式)。

一种或多种纯化的酶能以粉末形式提供，例如通过冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥。例如，一种或多种纯化的酶可以预先溶解在磷酸缓冲溶液、三乙醇胺缓冲溶液、三盐酸溶液、或GOOD缓冲溶液中。优选地，可以使用磷酸缓冲溶液和三乙醇胺缓冲溶液。注意，对于本文的GOOD缓冲溶液，例示了PIPES、MES或MOPS。

附图说明

图1：衍生自土生隐球菌的示例性β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)的氨基酸序列。A)SEQ ID NO:1：野生型酶；B)SEQ ID NO:2：突变体菌株酶1；C)SEQ ID NO:3：突变体菌株酶2；D)SEQ ID NO:4：突变体菌株酶3。

图2：如通过嗜碱性粒细胞活化标记物CD203c的表达(图2a，MFl＝平均荧光)以及表达嗜碱性粒细胞活化标记物CD63的细胞百分比(图2b)所测量的测试受试者#1中的嗜碱性粒细胞活化。正方形表示HA-GOS(图中的实线)。菱形表示REF-GOS(图中的虚线)。有关细节，参见实例2。

图3：如通过嗜碱性粒细胞活化标记物CD203c的表达(图3a，MFl＝平均荧光)以及表达嗜碱性粒细胞活化标记物CD63的细胞百分比(图3b)所测量的测试受试者#2中的嗜碱性粒细胞活化。正方形表示HA-GOS(图中的实线)。菱形表示REF-GOS(图中的虚线)。有关细节，参见实例2。

图4：如通过嗜碱性粒细胞活化标记物CD203c的表达(图4a，MFl＝平均荧光)以及表达嗜碱性粒细胞活化标记物CD63的细胞百分比(图4b)所测量的测试受试者#3中的嗜碱性粒细胞活化。正方形表示HA-GOS(图中的实线)。菱形表示REF-GOS(图中的虚线)。有关细节，参见实例2。

图5：如通过嗜碱性粒细胞活化标记物CD203c的表达(图5a，MFl＝平均荧光)以及表达嗜碱性粒细胞活化标记物CD63的细胞百分比(图5b)所测量的测试受试者#4中的嗜碱性粒细胞活化。正方形表示HA-GOS(图中的实线)。菱形表示REF-GOS(图中的虚线)。有关细节，参见实例2。

图6：如通过嗜碱性粒细胞活化标记物CD203c的表达(图6a，MFl＝平均荧光)以及表达嗜碱性粒细胞活化标记物CD63的细胞百分比(图6b)所测量的测试受试者#5中的嗜碱性粒细胞活化。正方形表示HA-GOS(图中的实线)。菱形表示REF-GOS(图中的虚线)。有关细节，参见实例2。

实验部分

衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶

如本发明中所用的衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶是从天野酶公司(AmanoEnzyme Inc.)(日本名古屋)获得的。这些β-半乳糖苷酶及其制备方法披露于天野公司的PCT/JP2016/089001中。下文段落1至8中描述了如PCT/JP2016/089001中所披露的用于制备衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶的方法以及酶特性。

1.从土生隐球菌获得野生型β-半乳糖苷酶

为了获得适合于产生低聚半乳糖的β-半乳糖苷酶，筛选了多种微生物。结果是，发现2013年10月在缅甸海霍机场(Heho Airport)附近收集的土壤样品中所含的土生隐球菌微生物是针对β-半乳糖苷酶的有前途的产生菌株。尝试从该微生物菌株(土生隐球菌菌株MM13-F2171)纯化β-半乳糖苷酶。土生隐球菌菌株MM13-F2171于2015年12月10日保藏在日本技术与评价研究所的专利微生物保藏机构，名称为土生隐球菌MM13-F2171，其指定的登录号为NITE BP-02177。

将土生隐球菌菌株MM13-F2171在液体培养基(2.0％乳糖，2.0％酵母提取物，0.1％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄·7H₂O，pH 5.0)中于30℃培养4天，伴随振荡(200转/分钟)。培养完成后，通过离心收集约3L上清液，并且然后用超滤膜(膜内部尺寸为0.8mm的AIP-1013D；旭化成化学株式会社(Asahi Kasei Chemicals Corp.))进行浓缩和脱盐处理。在脱盐处理中，使用20mM乙酸盐缓冲液(pH 6.0)。

将浓缩的溶液上样到阴离子交换柱HiTrap DEAE FF(通用电气医疗生物科学公司(GE Healthcare Biosciences))上，该柱已用20mM乙酸盐缓冲液(pH 6.0)平衡。使用含有1M NaCl的20mM乙酸盐缓冲液(pH 6.0)用梯度洗脱吸收的级分，并测量酶活性。合并具有酶活性的级分，并且然后针对含有1.8M硫酸铵的20mM乙酸盐缓冲液(pH 6.0)进行透析。将透析后获得的酶活性级分上样到疏水柱HiTrap Phenyl HP(通用电气医疗生物科学公司)上，该柱已用含有1.8M硫酸铵的20mM乙酸盐缓冲液(pH 6.0)平衡。使用20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)用梯度洗脱吸收的级分，并测量酶活性。合并具有酶活性的级分，并且然后针对含有0.2M NaCl的20mM乙酸盐缓冲液(pH 6.0)进行透析。

将透析后获得的酶活性级分上样到凝胶过滤柱HiLoad Superdex 200制备级(通用电气医疗生物科学公司)上，该柱已用含有0.2M NaCl的20mM乙酸盐缓冲液(pH 6.0)平衡，并且然后收集具有酶活性的级分。当使用该HiLoad Superdex 200制备级柱通过凝胶过滤法确定时，该酶具有约266kDa的分子量。当将该结果与SDS-PAGE分析(见下文)的结果组合考虑时，据推测该酶呈二聚体形式。

随后，通过SDS-PAGE确定纯化的野生型菌株酶的分子量。首先，使纯化的野生型菌株酶的样品变性(在沸水浴中的变性缓冲液中持续10分钟)，随后进行处理以去除O连接的糖链(使用O-糖苷酶和神经氨酸酶两者；O-糖苷酶&神经氨酸酶套装(O-Glycosidase&Neuraminidase Bundle)，新英格兰生物实验室(New England Biolabs))和/或N连接的糖链(使用PNGase F；新英格兰生物实验室)。这些酶处理的条件遵循对应酶提供的方案。处理后，通过SDS-PAGE确定所得产物的分子量。

发现野生型菌株酶在不经处理时具有120kDa的分子量，在去除O连接的糖链后具有106kDa的分子量，在去除N连接的糖链后具有104kDa的分子量，并且在去除O连接的糖链和N连接的糖链两者后具有104kDa的分子量。

2.纯化的酶的内部氨基酸序列

对纯化的酶的内部氨基酸序列的分析揭示了，该酶包含以下内部氨基酸序列：

GVQYVDYNSPT(SEQ ID NO:9)

FLFGWATAAQQ(SEQ ID NO:10)

QAYQIGIFAEPIYNT(SEQ ID NO:11)

PSIWDWAS(SEQ ID NO:12)，和

EEPPFAYVPE(SEQ ID NO:13)。

3.野生型菌株酶的基因序列的确定

尝试确定编码由土生隐球菌菌株MM13-F2171产生的β-半乳糖苷酶的基因序列。将土生隐球菌菌株MM13-F2171在液体培养基(2.0％乳糖，2.0％酵母提取物，0.1％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄·7H₂O，pH 5.0)中于30℃培养24小时，伴随振荡(200转/分钟)。培养完成后，收获细胞。按照用于从酵母细胞提取RNA(机械破坏细胞)的RNeasy Mini Kit(凯杰公司(QIAGEN))的方案制备总RNA。使用SMARTer RACE 5’/3’试剂盒(TaKaRa公司)从所得的总RNA合成cDNA，并且然后进行5’和3’RACE PCR反应。所用的5’RACE GSP引物具有序列GATTACGCCAAGCTTgcaaagatcccgatctggtacgcctg(SEQ ID NO:14)，并且所用的3’RACE GSP引物具有序列GATTACGCCAAGCTTttcctgtttggctgggcgaccgcc(SEQ ID NO:15)。分析所得的RACEPCR产物的碱基序列，以确定全长cDNA序列(SEQ ID NO:5)。由全长cDNA序列编码的推定氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

通过进一步研究，成功确定了编码由土生隐球菌菌株MM13-F2171产生的β-半乳糖苷酶的基因组DNA序列(SEQ ID NO:16)。

4.纯化的野生型酶的特性

(1)最适pH和pH稳定性

使用乳糖水解活性作为指示物，检查了纯化的野生型酶的最适pH和pH稳定性。使用pH范围为pH 2至3的0.1M甘氨酸缓冲液、pH范围为pH 3至6的0.1M柠檬酸盐缓冲液、pH范围为pH 5至6的0.1M乙酸盐缓冲液、pH范围为pH 7至8的0.1M磷酸盐缓冲液、以及pH范围为pH 9至10的0.1M碳酸钠缓冲液进行针对最适pH的检查。不同pH下酶活性的测量结果显示，纯化的酶的最适pH为4至5。

通过在不同pH的缓冲液(使用上述缓冲液)中于40℃加热30分钟，并且然后测量残余酶活性来检查纯化的酶的pH稳定性。不同pH下残余酶活性的测量结果显示，纯化的酶在pH为2至8的pH范围内呈现稳定的酶活性。

(2)最适温度和热稳定性

为了检查纯化的酶的最适温度，使用乙酸盐缓冲液(pH 6.0)并且在不同温度下测量乳糖水解活性。不同温度下酶活性的测量结果显示，发现纯化的酶的最适温度为70℃。为了检查纯化的酶的热稳定性，将该酶在乙酸盐缓冲液(pH 6.0)中于不同温度下加热30分钟后，测量乳糖水解活性。不同温度下酶活性的测量结果显示，纯化的酶在30℃至60℃之间是稳定的，并且酶活性保留在80％或更多的活性的水平。

5.野生型酶的低聚糖产生能力的检查

(1)方法

检查纯化的酶产生低聚糖的能力。将一个单位(1U)的纯化的野生型菌株酶/1g的乳糖添加至已预热至指定反应温度的53％乳糖溶液的等分试样中，然后使其在这些温度下进行反应，持续24小时。反应完成后，通过HPLC(在下述条件下)分析反应溶液，以确定其中含有的糖的组成。糖的组成的确定结果允许评估转糖基化活性。

当由纯化的酶(野生型菌株酶)产生的低聚半乳糖达到约50％的产率时，对低聚半乳糖(GOS)的聚合度和三糖的支化度进行了检查。按照上述程序进行反应，并在65℃下持续24小时，条件是通过纯化的酶(衍生自土生隐球菌)产生的GOS达到约50％的产率。

通过使用MCITM GEL CK04S柱(三菱化学株式会社(Mitsubishi ChemicalCorporation))、H₂O作为洗脱液、0.4ml/min流速、RI检测器、80℃柱温度来确定聚合度。

通过使用Shodex柱(注册商标)Asahipak NH2P-40 3E(昭和电工株式会社(ShowaDenko K.K.))、MeCN:H₂O＝75:25(体积比)作为洗脱液、0.35ml/min流速、RI检测器、25℃柱温度来确定支化度。

(2)结果

将测量结果用于计算各种反应溶液中所含糖(总糖)的总量中低聚半乳糖(GOS)的含量(％)，以及在指示的反应温度下具有指示的聚合度的对应GOS的比例(％)。结果示于表1中。发现纯化的酶(野生型菌株酶)具有优异的产生GOS的能力。另外，发现野生型菌株酶在高温条件下呈现高水平的转糖基化活性。

表1：在不同温度下用野生型β-半乳糖苷酶产生GOS。

*不包括乳糖

将测量结果用于计算具有指示的聚合度的对应GOS的比例(％)。当使用纯化的酶(野生型菌株酶)时，GOS的聚合度的典型结果示于表2中。发现野生型菌株酶(土生隐球菌衍生的酶)具有优异的产生GOS的能力，并有效产生低聚糖，特别是三糖和更高的糖。

表2：用多种酶产生GOS的比较。

*不包括乳糖

将测量结果用于计算所得的三糖中直链和支链低聚糖的比例(％)，并且用于比较衍生自土生隐球菌的酶与已知的其他产生β-半乳糖苷酶的菌株之间具有支链的三糖的比率(即，三糖的支化度)。当使用纯化的酶(野生型菌株酶)时，GOS的支化度的结果示于表3中。发现野生型菌株酶(土生隐球菌衍生的酶)主要产生直链低聚糖。因此，揭示了该野生型菌株酶具有转糖基化活性，其中该糖链经由β-1,4-糖苷键特异性地转移，并且特别是该糖链的转糖基能力较低以形成β-1,6-糖苷键。

表3：用多种酶产生的DP3 GOS的支化度的比较。

6.获得由突变体菌株产生的β-半乳糖苷酶，并确定其氨基酸序列和分子量

两个突变体菌株(M2和M6)是通过用UV处理进行诱变的方式从土生隐球菌菌株MM13-F2171获得的。由这些突变体菌株产生的β-半乳糖苷酶以类似于上述针对野生型酶的程序纯化。发现菌株M2和M6各自具有产生突变体菌株酶1至3的高能力；观察到菌株M2具有产生突变体菌株酶1的特别高的能力，且菌株M6具有产生突变体菌株酶2和3的特别高的能力。土生隐球菌菌株M2于2015年12月10日保藏在日本技术与评价研究所的专利微生物保藏机构，名称为土生隐球菌APC-6431，其指定的登录号为NITE BP-02178。

确定获得的纯化的酶(即，一种衍生自突变体菌株M2的酶(突变体菌株酶1)和两种衍生自突变体菌株M6的酶(突变体菌株酶2和3))的氨基酸序列。首先，使用蛋白质测序仪(PPSQ-31A，岛津公司(SHIMADZU CORPORATION))确定突变体菌株酶1至3的N末端氨基酸序列。然后，搜索野生型菌株酶的cDNA序列(SEQ ID NO:5)中对应于每种突变体菌株酶的N末端氨基酸序列的碱基序列，从而确定编码每种突变体菌株酶的cDNA序列。突变体菌株酶1的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)对应于具有野生型菌株酶的全长氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的N末端130个氨基酸残基缺失的序列，该氨基酸序列是从编码野生型菌株酶的cDNA序列(SEQID NO:5)推导的。类似地，突变体菌株酶2的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)对应于具有野生型菌株酶的全长氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的N末端136个氨基酸残基缺失的序列，而突变体菌株酶3的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)对应于具有野生型菌株酶的全长氨基酸序列(SEQ IDNO:1)的N末端141个氨基酸残基缺失的序列。

随后，通过SDS-PAGE确定这些突变体菌株酶的分子量。用于去除糖链的程序和条件与上述针对野生型酶的程序和条件一致。当这些酶不经处理以及进行用于去除N连接的糖链、O连接的糖链以及N连接的糖链和O连接的糖链两者的处理时，确定对应突变体菌株酶的分子量。基于SDS-PAGE分析的结果，观察到除了突变体菌株酶1之外，菌株M2还产生突变体菌株酶2和3。

发现突变体菌株酶1在不经处理时具有71kDa的分子量，在去除O连接的糖链后具有65kDa的分子量，在去除N连接的糖链后具有64kDa的分子量，并且在去除O连接的糖链和N连接的糖链两者后具有64kDa的分子量。

发现突变体菌株酶2在不经处理时具有66kDa的分子量，在去除O连接的糖链后具有63kDa的分子量，在去除N连接的糖链后具有61kDa的分子量，并且在去除O连接的糖链和N连接的糖链两者后具有61kDa的分子量。

发现突变体菌株酶3在不经处理时具有66kDa的分子量，在去除O连接的糖链后具有62kDa的分子量，在去除N连接的糖链后具有61kDa的分子量，并且在去除O连接的糖链和N连接的糖链两者后具有61kDa的分子量。

7.突变体菌株酶1、2和3的低聚糖产生能力的检查

(1)方法

向等分试样的乳糖溶液中添加衍生自菌株M2(突变体菌株酶1)或M6(突变体菌株酶3)的纯化的酶，并且使混合物进行反应。反应完成后，对反应溶液中含有的糖的聚合度和支化度进行检查。反应条件以及聚合度和支化度的测量按照上文第5节所述的进行。

(2)结果

将测量结果用于计算各种反应溶液中所含糖(总糖)的总量中GOS的含量(％)，以及在指示的反应温度下具有指示的聚合度的对应GOS的比例(％)(表4)。发现纯化的酶(突变体菌株酶)具有优异的产生GOS的能力。另外，发现突变体菌株酶在高温条件下呈现高水平的糖转移活性。还可以发现，野生型菌株酶和突变体菌株酶在产生GOS的能力方面没有差异。

表4：在不同温度下用突变体菌株酶3产生GOS。

*不包括乳糖

将测量结果用于计算具有指示的聚合度的对应GOS的比例(％)。当使用衍生自菌株M2(突变体菌株酶1)和M6(突变体菌株酶3)的纯化的、经突变的酶时，GOS的聚合度的典型结果示于表5中。发现突变体菌株酶具有优异的产生GOS的能力，并有效产生低聚糖，特别是三糖和更高的糖。还可以发现，野生型菌株酶和突变体菌株酶在产生GOS的能力方面没有差异。

表5：用多种酶产生GOS的比较。

*不包括乳糖

将测量结果用于计算所得的三糖中直链和支链低聚糖的比例(％)，并且用于比较野生型菌株酶与两种突变体菌株酶(表6)之间具有支链的三糖的比率(即，三糖的支化度)。

表6：用多种酶产生的DP3 GOS的支化度的比较。

发现突变体菌株酶(经突变的、土生隐球菌衍生的酶)主要产生直链低聚糖。因此，揭示了这些突变体菌株酶具有转糖基化活性，其中该糖链经由β-1,4-糖苷键特异性地转移，并且特别是该糖链的转糖基能力较低以形成β-1,6-糖苷键。还观察到，野生型菌株酶和突变体菌株酶具有可比较的产生GOS的能力，并且就β-半乳糖苷酶的特性而言没有任何实质性差异。突变体菌株酶2是β-半乳糖苷酶，其氨基酸序列在N末端比突变体菌株酶1的氨基酸序列短六个氨基酸残基，并且在N末端比突变体菌株酶3的氨基酸序列长五个氨基酸残基。从以上结果可明显看出，N末端区域的氨基酸序列不影响酶促特性，因此可以推断出，突变体菌株酶2也具有与突变体菌株酶1和3等同的酶促特性。

8.突变体菌株酶1和3的特性

将纯化的、经突变的酶(参见上文第6部分所述)用于检查突变体菌株酶1和3的特性。实验方法类似于针对野生型菌株酶描述的那些(参见上文第4部分所述)。

(1)最适pH和pH稳定性

发现突变体菌株酶1和3各自的最适pH为4至5。发现突变体菌株酶1和3各自在pH 2至9的pH范围内呈现稳定的活性。

(2)最适温度和热稳定性

发现突变体菌株酶1和3各自的最适温度为70℃。发现突变体菌株酶1和3各自在30℃至65℃之间是稳定的，并且酶活性保留在80％或更多的活性的水平。

实例1：低变应原性GOS(HA-GOS)的制备。

GOS制剂的合成

由通过四个批次的土生隐球菌β-半乳糖苷酶(从天野酶公司获得，批号GFEO0450731SDR、GFEO0450741SDR、GFEN1052631SDR和GFEO0750431SDR)对乳糖进行转半乳糖基化产生四个批次的GOS制剂(称为PT 731-741-631-431)。对于每个批次，使用乳糖浆液(约50％(w/w)乳糖纯的，批号502392；MFG：13-07-2014)作为底物。将该乳糖浆液加热至95℃以溶解该乳糖。随后，将该乳糖溶液冷却至65℃的反应温度。添加非常温和的柠檬酸盐缓冲液(2-3mM)以调节并稳定pH。使用0.94LU酶/g乳糖。在反应期间，根据需要通过柠檬酸和氢氧化钠来调节pH。酶添加后42小时，通过在90℃下加热30分钟来停止该反应。

下游处理

在通过加热终止酶反应之后，将该溶液在离子交换柱上运行(阳离子交换，随后阴离子交换))，随后使用柠檬酸将pH降低至3.2。在75℃下进行巴氏消毒后，将GOS浓缩至大约75％干物质。

由此获得的GOS制剂批次的分析示于表7中。在该表中显示，通过应用四个批次的土生蝶孢银耳β-半乳糖苷酶产生的四个批次的规格高度一致(批次间的差异低)。与REF-GOS(其通过在环状芽孢杆菌的作用下对乳糖进行转半乳糖基化而制备)的差异非常小。

表7：对多个批次的HA-GOS进行近似分析

*通过在环状芽孢杆菌的作用下对乳糖进行转半乳糖基化制备的常规GOS。

根据已建立的方法进行GOS聚合度(DP)分析。表8显示，本发明的低变应原性GOS(HA-GOS)的聚合度分析的结果与使用来自环状芽孢杆菌的酶获得的参考GOS制剂(REF-GOS)中发现的那些高度类似。

表8：DP分析的分析结果

实例2：口服激发测试

该实例描述了双盲的、安慰剂对照的口服激发测试，以证明在具有已知的低聚半乳糖过敏的多名人受试者中HA-GOS的变应原性降低。另外，用HA-GOS进行皮肤点刺测试和嗜碱性粒细胞活化测试。

材料

测试中包括HA-GOS(批次PT731；参见实例1)和使用环状芽孢杆菌酶获得的商业GOS制剂(REF-GOS)。将这些材料在室温下于黑暗中储存直至使用。

受试者

如在Soh等人，2015¹⁰的文章中所述的，从先前针对新加坡特应性人群中GOS过敏的患病率进行研究的群组中选择合格的受试者。接触了七名参加该研究的合格的受试者。两名受试者拒绝参加。因此，将五名确诊GOS相关的过敏的成年受试者召回至临床，进行皮肤点刺测试、血液样品抽取，并用HA-GOS进行两次双盲的、安慰剂对照的口服激发测试(两次激发之间的最短时间为2周)。

该研究得到医院机构伦理审查委员会的批准(IRB协议“在患有已知的低聚半乳糖过敏的患者中测试经修饰的低聚半乳糖的低变应原性”)。研究开始之前获得了所有受试者的书面同意。

皮肤点刺测试、嗜碱性粒细胞活化测试和口服激发测试

临床研究协调员在背部或前臂的中部对HA-GOS进行皮肤点刺测试。将组胺和REF-GOS用作阳性对照。记录每个样品的风团大小，并将其用作皮肤测试反应性的程度。

对患者血液样品进行嗜碱性粒细胞活化测试。将肝素化的外周血等分试样(100μL)在37℃下预孵育5分钟，并且然后将其与100μL的PBS(阴性对照)、抗IgE抗体(阳性对照，G7-18；BD生物科学公司(BD Biosciences)，圣何塞，加利福尼亚州)或稀释的GOS样品一起孵育15分钟(37℃)。孵育后，将细胞在PBS-EDTA(20mmol/L)中洗涤，并且然后将其在48℃下与藻红蛋白标记的抗人IgE(Ige21；e生物科学公司(eBioscience)，圣何塞，加利福尼亚州)、生物素标记的抗人CD203c(NP4D6；生物传奇公司(BioLegend)，圣何塞，加利福尼亚州)、以及异硫氰酸荧光素标记的抗人CD63(MEM-259，生物传奇公司)mAb一起孵育20分钟。CD203c和CD63的表达均是嗜碱性粒细胞活化的标记物。用1％BSA/PBS洗涤细胞后，添加别藻蓝蛋白共轭的链霉抗生物素蛋白(BD生物科学公司)，并在48℃下孵育15分钟。此后，用2mL的FACS裂解液(BD生物科学公司)对这些样品进行红细胞裂解。然后将细胞洗涤，重悬于1％BSA/PBS中，并通过FACSCalibur(BD生物科学公司)分析。基于侧向散射特征和IgE的表达(IgE高)⁷检测到嗜碱性粒细胞。

通过以每30分钟间隔施用递增剂量的HA-GOS进行口服食物激发测试，以达到4克的总累积剂量(参见下表9)。选择4克的总剂量，因为这一剂量是在5名对REF-GOS具有过敏性的患者中引发临床反应的最大剂量，如Chiang等人⁷所报告的。在该研究中使用0.8gGOS/100ml水的溶液，并在激发当天新鲜制备。

表9：口服食物激发测试的剂量方案

至于安慰剂，我们使用了葡萄糖、乳糖和柠檬酸的混合物来模拟非低聚糖组合物和HA-GOS的味道。用于口服激发的测试溶液的制备是由不参与实际口服激发测试的实验室人员完成的。此外，该溶液的制备由第二人检查，以避免任何混淆。进行该口服激发测试的医师对测试材料(HA-GOS或安慰剂溶液)不知情。

结果

皮肤点刺测试和口服激发测试结果

七名先前已被证实患有REF-GOS相关的过敏的受试者有资格进行用HA-GOS进行的口服激发。在用REF-GOS进行激发期间，这些受试者在阈值剂量后的30分钟内具有以急性***反应为典型特征的反应。所有受试者对REF-GOS呈皮肤点刺测试呈阳性。

最终，在本研究中，四名受试者(受试者#1、#2、#4和#5)接受了用HA-GOS和安慰剂进行的激发。在HA-GOS激发之前，所有受试者对HA-GOS呈皮肤点刺测试呈阴性。

下表列出了用HA-GOS进行的口服激发(OC)和皮肤点刺测试(SPT)的详细结果。表10中还描述了对REF-GOS激发的反应(在当前用HA-GOS进行激发之前大约两年半的时间进行)，以供参考。

表10：用HA-GOS进行口服激发(OC)和皮肤点刺测试(SPT)的结果

AR＝过敏性鼻炎，AS＝哮喘，AD＝特应性皮炎，OC＝口服激发，SPT＝皮肤点刺测试，C＝HA-GOS，P＝安慰剂

*受试者#1未通过安慰剂激发测试；她的背部、胸部和舌头发痒，并感到头晕。

受试者#1在用安慰剂进行激发期间经历了过敏反应的症状(背部、胸部和舌头发痒；头晕感)，而她通过了用HA-GOS进行的口服激发测试(无任何主诉)。执业医师确认，该受试者在经历这些过敏症状之前已经接受了安慰剂。这是一种有时在安慰剂对照的激发期间发生的已知现象，并且可能是由受试者的焦虑引起的。

表10中的数据显示，所有四名受试者(他们接受了用HA-GOS进行的双盲的、安慰剂对照的激发)在摄入HA-GOS后均未显示过敏症状。

嗜碱性粒细胞活化测试结果

图2-6显示了在进行口服激发测试之前对所有五名受试者进行的嗜碱性粒细胞活化测试的结果。

图2显示了如通过嗜碱性粒细胞活化标记物CD203c的表达(图2a，MFl＝平均荧光)以及表达嗜碱性粒细胞活化标记物CD63的细胞百分比(图2b)所测量的测试受试者#1中的嗜碱性粒细胞活化的结果。正方形表示HA-GOS(图中的实线)。菱形表示REF-GOS(图中的虚线)。

类似地，图3、4、5和6显示了如通过嗜碱性粒细胞活化标记物CD203c的表达(图3a、4a、5a和6a；MFl＝平均荧光)以及表达嗜碱性粒细胞活化标记物CD63的细胞百分比(图3b、4b、5b和6b)所测量的分别在测试受试者#2、#3、#4和#5中的嗜碱性粒细胞活化。正方形表示HA-GOS(图中的实线)。菱形表示REF-GOS(图中的虚线)。

结果显示，三名受试者(#1、#3和#4)对REF-GOS的嗜碱性粒细胞活化反应呈阴性。先前在用REF-GOS进行的其他嗜碱性粒细胞活化测试期间也发现了这一点。然而，这些受试者被确认对REF-GOS过敏，因为他们对REF-GOS的反应呈皮肤点刺测试和口服激发测试结果阳性。在这些受试者中，对HA-GOS的嗜碱性粒细胞反应也呈阴性。

受试者#2和#5显示出对REF-GOS明显的嗜碱性粒细胞活化反应，而HA-GOS并未导致嗜碱性粒细胞活化。

结论

在安慰剂对照的口服激发测试期间，HA-GOS摄入未在n＝4个REF-GOS过敏的受试者中显示过敏反应。在所有测试的受试者中，用HA-GOS进行的皮肤点刺测试均呈阴性。同样在REF-GOS过敏的受试者中进行的嗜碱性粒细胞活化测试中，与REF-GOS相比，发现HA-GOS的变应原性明显降低。当一并考虑时可以得出结论，与REF-GOS相比，HA-GOS是明显低变应原性的。

参考文献：

1.Ben,X.-M.Low level of galacto-oligosaccharide in infant formulastimulates growth of intestinal Bifidobacteria and Lactobacilli.WorldJ.Gastroenterol.14,6564(2008).

2.Sierra,C.et al.Prebiotic effect during the first year of life inhealthy infants fed formula containing GOS as the only prebiotic:amulticentre,randomised,double-blind and placebo-controlledtrial.Eur.J.Nutr.54,89-99(2014).

3.Fanaro,S.et al.Galacto-oligosaccharides are bifidogenic and safe atweaning:a double-blind randomized multicenter study.J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.48,82-8(2009).

4.Sierra,C.et al.Prebiotic effect during the first year of life inhealthy infants fed formula containing GOS as the only prebiotic:amulticentre,randomised,double-blind and placebo-controlled trial.Eur.J.Nutr.(2014).

5.Arslanoglu,S.,Moro,G.E.&Boehm,G.Early supplementation of prebioticoligosaccharides protects formula-fed infants against infections during thefirst 6months of life.J.Nutr.137,2420-2424(2007).

6.Chatchatee,P.et al.Identification of IgE and IgG binding epitopeson beta-and kappa-casein in cow’s milk allergic patients.Clin.Exp.Allergy 31,1256-62(2001).

7.Whisner,C.M.et al.Galacto-oligosaccharides increase calciumabsorption and gut bifidobacteria in young girls:a double-blind cross-overtrial.Br.J.Nutr.110,1292-303(2013).

8.Chiang,W.C.et al.Anaphylaxis to cow’s milk formula containingshort-chain galacto-oligosaccharide.J.Allergy Clin.Immunol.130,1361-1367(2012).

9.Lieberman,J.A.&Sicherer,S.H.Diagnosis of food allergy:epicutaneousskin tests,in vitro tests,and oral food challenge.Curr.AllergyAsthma Rep.11,58-64(2011).

10.Soh,J.Y.et al.Anaphylaxis to galacto-oligosaccharides-anevaluationin an atopic population in Singapore.Allergy 70,1020-3(2015).