一种含螨变应原的舌下温敏凝胶及其制备方法
阅读说明：本技术 一种含螨变应原的舌下温敏凝胶及其制备方法 (Sublingual temperature-sensitive gel containing mite allergen and preparation method thereof ) 是由 不公告发明人 于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种含螨变应原的舌下温敏凝胶,由螨变应原、阳离子单体和温敏凝胶材料组成,其中阳离子单体和温敏凝胶材料的含量比为(1:2)～(1:1)。本发明提供的含螨变应原的舌下温敏凝胶,在普通含螨变应原舌下滴剂基础上提出舌下温敏凝胶剂,延续了舌下滴剂给药方便优点的同时,延长了疫苗在舌下的滞留时间,提高药效；缩短了温敏凝胶的胶凝时间,降低给药过程中吞咽造成的损失,减少了给药量；克服温敏凝胶吸附蛋白质的温敏性,提高凝胶在液体状态时对蛋白质的吸附,进而减少给药量。(The invention discloses a sublingual temperature-sensitive gel containing a mite allergen, which consists of the mite allergen, a cationic monomer and a temperature-sensitive gel material, wherein the content ratio of the cationic monomer to the temperature-sensitive gel material is (1:2) - (1: 1). The sublingual temperature-sensitive gel containing the mite allergen provided by the invention is a sublingual temperature-sensitive gel based on common sublingual drops containing the mite allergen, and has the advantages of convenience in administration of the sublingual drops, prolonged residence time of vaccines under the tongue and improved drug effect; the gelling time of the temperature-sensitive gel is shortened, the loss caused by swallowing in the administration process is reduced, and the administration amount is reduced; overcomes the temperature sensitivity of temperature sensitive gel to adsorb protein, improves the adsorption of the gel to the protein in a liquid state, and further reduces the dosage.)
技术领域
本发明涉及螨变应原的给药技术领域，具体涉及一种含螨变应原的舌下温敏凝胶及其制备方法。
背景技术
过敏被世界卫生组织(WHO)认为是当前世界性的重大卫生性问题，过敏的发病率很高，文献报道约有l/3的人在一生中患过过敏性疾病。WHO的数据表明，目前全球有22％～25％的人患有过敏性疾病，并以每10年23倍的速度增加，目前仅在我国就有两亿多人患病。因此，过敏和抗过敏，是现代人面临的不可回避的严峻问题。引起过敏反应的变应原主要有尘螨、花粉、尘土、柳絮、动物皮屑等，而螨变应原是世界性分布最强烈的变应原之一。
目前，常用的脱敏疗法就是皮下注射疗法，起效快，但容易引起疼痛，造成患者的不耐受性。皮下注射也容易造成局部或者全身的不良反应，严重可致死亡。而且治疗后针头等锐利物品的处理也是一个麻烦的问题，使用完后要放置到合适的位置，进行后续处理，花费较贵，代价较大。舌下特异性免疫治疗(Sublingual immunotherapy，SLIT)是一种经口腔黏膜给药逐渐达到免疫耐受的特异性免疫治疗方法，通过一定时间内让病人“舌下含服”特异性的变应原疫苗，变应原疫苗的剂量和浓度由低至高，在3～5周内达至预定的饱和剂量并维持一段时间，以刺激患者的免疫系统产生对该致敏原的耐受性，实现免疫治疗的效果。1986年Scadding GK最先报道舌下含服免疫治疗成功用于变应性鼻炎治疗的随机双盲试验研究，近年来国外SLIT作为皮下免疫治疗的替代疗法，已广泛应用于治疗过敏性鼻炎、过敏性哮喘。
目前常用的螨变应原舌下疫苗多为滴剂，滴剂的生物粘附性弱，而正常人口腔中每天分泌唾液1～1.5L，唾液的存在会冲刷掉用于舌下的滴剂缩短螨变应原在舌下黏膜的滞留时间，使得螨变应原舌下滴剂的治疗效果大打折扣。凝胶剂可保护抗原免于酶促降解，并最大程度地减少了从口腔的损失，从而最大程度地吸收以提供足够的刺激。因此，本发明在普通滴剂的基础上提出凝胶剂以增加螨变应原疫苗在舌下黏膜的粘滞性。然而，高粘度的凝胶剂虽然可提高疫苗的舌下滞留时间，但存在给药时无法准确定量的问题。温敏性水凝胶由特殊的嵌段共聚物构成，具有低温下为液态，升至一定温度时凝聚且变化随温度可逆的特性。因此，本发明拟通过开发螨变应原疫苗的舌下温敏凝胶制剂，来解决“兼顾粘滞性和定量给药”的技术难题。
经检索，目前尚未发现有将螨变应原疫苗开发成舌下温敏凝胶制剂的文献报道，类似文献如下：
公开号为CN102014954A的中国专利公开了一种使用季节性变应原的粘膜变应原-特异性免疫疗法，提出了对花粉变应原开发成固体剂型(含舌下凝胶制剂)的思路，但是该专利的不足之处在于：①仅提出了花粉变应原舌下凝胶剂，凝胶剂的滞留性问题仍未提供解决方案；②凝胶剂给药时能否做到定量给药，也无从知悉。
公开号为CN1840190A的中国专利公开了一种治疗过敏性疾病的药物组合物，该组合物包含尘螨变应原、花粉变应原以及药学上可接受的载体，组合物可开发成舌下含服剂，但该技术的不足之处在于：从其实施例4的舌下含服剂的制备可知为滴剂，存在“舌下黏膜的滞留时间短、螨变应原治疗效果差”的缺陷。
White J A等人在文献中报道了将骨髓灰质炎疫苗开发成舌下温敏凝胶，采用热应答凝胶(TRG)与细菌热不稳定毒素(DmLT)双突变体联合，来提高骨髓灰质炎疫苗的免疫效果(White J A,Blum J S,Hosken N A,et al.Serum and mucosal antibody responsesto inactivated polio vaccine after sublingual immunization using athermoresponsive gel delivery system[J].Human Vaccines&Immunotherapeutics,2014,10(12):3611-3621.)。但该文献的技术不足之处在于：①骨髓灰质炎疫苗的佐剂选用DmLT，副作用大，免疫应答水平低；②未对温敏凝胶的pH值进行研究，存在不确定性。
众所周知，螨变应原中的主要抗原Der P1在中性pH中活性最强(毕玉田,吴奎,王长征.屋尘螨过敏原Der p1研究进展[J].重庆医学,2007,36(2):171-173)，且pH的改变也会影响温敏凝胶的流变学性质。也就是说，开发螨变应原舌下温敏凝胶时，选择pH中性且胶凝时间短的温敏凝胶，是必须考虑的关键技术因素之一。
此外，螨变应原中的主要抗原Der p1作为一种阴离子蛋白酶，在温敏凝胶中的吸附量会随温度变化而变化。在凝胶的相转变温度(LCST)以下，温敏性微凝胶对蛋白质吸附量不大，但在LCST附近，吸附量发生突跃，表现出对蛋白质及酶吸附的温度敏感性。因此，开发pH中性且胶凝时间短的温敏凝胶时，如何提高液体状态下凝胶对螨变应原的吸附力，是必须考虑的关键技术因素之二。
喻海琼等学者发现，使用阳离子聚合物壳聚糖为主要材料制备粉尘螨纳米疫苗，对哮喘小鼠舌下含服给药，发现粉尘螨壳聚糖纳米疫苗对致敏小鼠具有免疫治疗作用，壳聚糖对蛋白质吸附率达到60％(喻海琼,刘志刚,国华,周一平.粉尘螨壳聚糖纳米疫苗舌下含服对哮喘小鼠的治疗作用[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2011,29(1):4-9)。该文献的技术不足之处在于：①壳聚糖必须在pH值低于6.2的酸性溶液中才能溶解，且凝胶液pH值对流变学特性会产生影响，而抗原Der p1在中性pH中活性最强，所以阳离子聚合物能否用于开发螨变应原的舌下温敏凝胶存在不确定性；②粉尘螨变应原在舌下黏膜的滞留情况，也无从知悉。故此，温敏凝胶基质材料与变应原之间是否存在相互作用与影响，尚存在不确定性，需要探索验证。
综上所述，选择何种材料开发螨变应原舌下温敏凝胶，以提高螨变应原的舌下滞留时间，且在凝胶的相转变温度(LCST)以下仍具有良好的吸附性，是本领域技术人尚未解决的技术难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，提供了一种含螨变应原的舌下温敏凝胶及其制备方法，解决了上述现有技术存在的不足之处。
为此，本发明采取了以下技术方案：
一种含螨变应原的舌下温敏凝胶，由螨变应原、阳离子单体和温敏凝胶材料组成，其中阳离子单体和温敏凝胶材料的含量比为(1:2)～(1:1)。
优选的，阳离子单体和温敏凝胶材料的含量比为1:2。
优选的，阳离子单体为羧甲基壳聚糖。
优选的，温敏凝胶材料为泊洛沙姆、聚(N-异丙基丙烯酰胺)中的一种。
本发明还提供一种如前所述的含螨变应原的舌下温敏凝胶的制备方法，包括如下步骤：将温敏凝胶材料和阳离子单体配制成1mol/L的混合水溶液，调节pH为7.2，加入引发剂，通N2聚合，得到共聚物；再加入交联剂，水中透析，精制后得到共聚物的水凝胶；水凝胶在蒸馏水中浸泡1周后，于4℃磁力搅拌下，缓慢加入螨变应原，混匀，即得成品。
本发明中，螨变应原为尘螨变应原，包括但不限于抗原Der p1。
与现有技术相比，本发明提供的含螨变应原的舌下温敏凝胶，有益效果如下：
1)在普通含螨变应原舌下滴剂基础上提出舌下温敏凝胶剂，延续了舌下滴剂给药方便优点的同时，延长了疫苗在舌下的滞留时间，提高药效；同时也便于准确定量给药；
2)缩短了温敏凝胶的胶凝时间，降低给药过程中吞咽造成的损失，减少了给药量；
3)克服温敏凝胶吸附蛋白质的温敏性，提高凝胶在液体状态时对蛋白质的吸附，进而减少给药量。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1螨变应原的舌下温敏凝胶的制备
将温敏凝胶材料和阳离子单体配制成1mol/L的混合水溶液，调节pH为7.2，加入引发剂，通N2聚合2h后得到共聚物。产物经水中透析进行精制，加入交联剂，得到共聚物水凝胶。所得水凝胶在蒸馏水中浸泡1周，以除去凝胶中未反应的单体、交联剂和引发剂分子。然后，于4℃磁力搅拌下，再缓慢加入螨变应原，混匀，即得成品。
实施例2温敏凝胶材料的筛选
假定温敏凝胶材料与阳离子单体的含量比为一定值(如1:1)，温敏凝胶材料为泊洛沙姆、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)中的一种，阳离子单体为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、甲基丙烯酸(2-二乙胺基)乙酯、氯化三甲基-3-丙烯酰胺丙基胺中的一种；通过测定相转变温度、黏膜滞留性来探究不同种类的温敏凝胶材料、阳离子单体的影响。
本实施例中，螨变应原的舌下温敏凝胶制备方法，见实施1，测定结果见表1。
1、相转变温度测定方法：
取10g已制备好的温敏凝胶溶液倒入西林瓶中，在西林瓶中放入磁力搅拌子，插入精度为0.1℃的精密温度计，温度计的水银球完全浸没在凝胶溶液中，将其放入常温(<25℃)水浴中，转速300r/min,保持水温持续缓慢升高，升温速度约0.5℃/min。最后记录下搅拌子停止转动时的温度，测得的温度即为凝胶的相转变温度(LCST)。每个样品平行测定3次，结果取平均值。
当相转变温度接近舌下温度36.3℃～37.2℃，最适宜，视为符合测试要求。
2、黏膜滞留性测定方法：
将温敏凝胶与小鼠唾液混合液置小试管中于37℃恒温水浴后，磁流变仪测定混合液的流变性质(即粘弹性)。将70至150μm的钢球小心地放在2至5μl的粘液样本中，并通过电磁体以不同的驱动频率进行振荡，确定球体的位移量及其相对于驱动力的相位滞后，磁流变仪测定粘弹性，粘弹性的表征值定义为logG*(粘度和弹性的矢量和)。
logG*高于1.6，且logG*越高，则滞留性越好，视为符合测试要求。
3、吸附率测定方法：
凝胶吸附已知蛋白总量的载螨变应原后，测定上清液中游离蛋白含量，计算吸附率，计算公式如下：吸附率＝(总蛋白-游离蛋白)/总蛋白×100％。
表1.温敏凝胶材料筛选(mean±SD，n＝3)
温敏凝胶组成(阳离子单体+温敏凝胶材料)
相转变温度(℃)
logG*
吸附率(％)
壳聚糖+泊洛沙姆
31.3±0.52
1.2
70±0.37
羧甲基壳聚糖+泊洛沙姆
32.2±0.53
1.3
71±0.47
甲基丙烯酸(2-二乙胺基)乙酯+泊洛沙姆
31.4±0.15
1.4
67±0.88
氯化三甲基-3-丙烯酰胺丙基胺+泊洛沙姆
28.3±0.76
1.4
57±0.93
壳聚糖+PNIPAM
35.9±0.52
1.3
71±0.46
羧甲基壳聚糖+PNIPAM
36.8±0.47
1.7
72±0.42
甲基丙烯酸(2-二乙胺基)乙酯+PNIPAM
34.5±0.47
1.6
65±0.45
氯化三甲基-3-丙烯酰胺丙基胺+PNIPAM
32.9±0.51
1.7
55±0.67
从表1中可知，
①不同种类的阳离子单体与不同种类的温敏凝胶材料组合使用，吸附能力都有一定程度的改善；
②综合考虑凝胶的相转变温度、logG*，仅当阳离子单体为羧甲基壳聚糖，温敏凝胶材料为PNIPAM时，制成的温敏凝胶符合测试要求。
实施例3温敏凝胶材料与阳离子单体的含量比的筛选
本实施例拟通过测定相转变温度、logG*、吸附率、胶凝时间，来探究不同的温敏凝胶材料与阳离子单体的含量比，对前述指标的影响。
本实施例中，螨变应原的舌下温敏凝胶制备方法，见实施1；相转变温度、黏膜滞留性的测定方法，吸附率的测定方法，见实施例2；测定结果见表2。
1、胶凝时间测定方法：
取10g已制备好的温敏凝胶溶液倒入西林瓶中，在西林瓶中放入磁力搅拌子，在25℃恒温水浴20min后，置于37℃恒温水浴，置入瞬间开始计时，以搅拌子停止转动时的时间记为胶凝时间。水浴温度控制在36.8℃-37.2℃之间。每组平行测定3次，结果取平均值。
当胶凝时间小于5s时，视为符合测试要求。
表2.不同含量比的阳离子单体与凝胶材料对温敏凝胶性质的影响(mean±SD，n＝3)
从表2可知，综合考虑相转变温度、logG*、吸附率、胶凝时间4个影响因子，当羧甲基壳聚糖与PNIPAM的含量比为(1:2)～(1:1)时，均符合测试要求；考虑粘弹性对重要性，选择羧甲基壳聚糖与PNIPAM的含量比为1:2时，作为最佳处方。
实施例4螨变应原舌下温敏凝胶治疗效果的测定
取4～6周龄雌性BALB/c小鼠，设如下三个实验组：空白舌下温敏凝胶组、螨变应原舌下滴剂组和螨变应原舌下温敏凝胶组。各组在第0、7和14天用50μg粉尘螨变应原+2mg Al(OH)3腹腔注射致敏(阴性对照组使用生理盐水)小鼠。第28天乙醚麻醉小鼠后，分别对三个实验组舌下含服免疫18次，每次间隔1d，末次免疫1周后用50μg螨变应原滴鼻激发，每天1次，连续7次。末次激发24h后进行气道高反应检测。末次滴鼻48h后处死小鼠，取血，分离制备血清，测定血清中的IgE水平。
测定结果见表3。
表3.小鼠血清中IgE抗体水平测定(mean±SD，n＝10)
注：组内治疗前后比较，aP<0.05；与治疗后的舌下滴剂组相比，bP<0.05。
从表3可知：
①螨变应原舌下滴剂组、螨变应原舌下温敏凝胶组各自的组内比较，治疗后与治疗前相比，IgE抗体水平显著下降(P<0.05)；
②与治疗后的螨变应原舌下滴剂组相比，治疗后的螨变应原舌下温敏凝胶组IgE抗体水平显著下降(P<0.05)，可见，螨变应原开发成舌下温敏凝胶制剂的治疗效果，要优于开发成舌下滴剂。
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