一种tTIM融合蛋白疫苗、制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种tTIM融合蛋白疫苗、制备方法及应用 (tTIM fusion protein vaccine, preparation method and application ) 是由 莫丽华 刘大波 罗向前 于 2021-01-14 设计创作，主要内容包括：本发明属于疫苗制备技术领域,公开了一种tTIM融合蛋白疫苗、制备方法及应用,获取TAT48-60、T-bet、MHC-II基因序列；预测OVA的主要T细胞表位AI-15、VE-15、GI-15、IC-15；筛选出OVA优势T细胞表位IC-15；合成TAT-T-bet-IC-15-MHC-II融合基因和无携带TAT48-60的T-bet-IC-15-MHC-II融合基因；将tTIM融合基因克隆到pET-32a表达载体上并转化入大肠埃希菌工程菌中；表达tTIM融合蛋白；确定tTIM融合蛋白疫苗制备的最佳工艺条件。本发明能够平衡Th1/Th2比率维持机体免疫系统的稳态,从而抑制过敏性炎症反应。(The invention belongs to the technical field of vaccine preparation, and discloses a tTIM fusion protein vaccine, a preparation method and application thereof, wherein TAT48-60, T-beta and MHC-II gene sequences are obtained; predicting main T cell epitopes AI-15, VE-15, GI-15 and IC-15 of OVA; screening out OVA dominant T cell epitope IC-15; synthesizing TAT-T-beta-IC-15-MHC-II fusion gene and T-beta-IC-15-MHC-II fusion gene without TAT 48-60; cloning the tTIM fusion gene onto a pET-32a expression vector and converting the gene into engineering bacteria of Escherichia coli; expressing the tim fusion protein; determining the optimal process conditions for preparing the tTIM fusion protein vaccine. The invention can balance the ratio of Th1/Th2 to maintain the steady state of the immune system of the organism, thereby inhibiting the allergic inflammation reaction.)
技术领域
本发明属于疫苗制备技术领域，尤其涉及一种tTIM融合蛋白疫苗、制备方法及应用。
背景技术
目前，随着全球呼吸道过敏性疾病患病率不断攀升，人类的健康收到严重危害。呼吸道过敏性疾病发病机制的关键因素是机体免疫系统Th1/Th2细胞比例的失衡。近几十年，国内外针对维持免疫系统稳定的研究进展迅速，但在如何通过靶向抗原特异性T细胞抑制Th2炎症反应治疗呼吸道过敏性疾病研究方面仍处于探索阶段。
目前临床上有以抗组胺或激素等对症治疗来缓解病情，而糖皮质激素及抗组胺药物是目前临床用来缓解过敏性疾病临床症状的主要药物，但是它对机体免疫系统的抑制特别是对IFN-γ的抑制，降低了机体防御感染的能力，难以取得满意的疗效。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)现有的通过靶向抗原特异性T细胞抑制Th2炎症反应治疗呼吸道过敏性疾病研究方面仍处于探索阶段。
(2)目前临床上有以抗组胺或激素等对症治疗来缓解病情的方法，对机体免疫系统的抑制特别是对IFN-γ的抑制，降低了机体防御感染的能力，难以取得满意的疗效。
解决以上问题及缺陷的难度为：由于外源性蛋白在机体内需经过APC细胞摄取后进行降解、加工处理才能将抗原信息提呈给T淋巴细胞，这直接限制了疫苗保持其自身结构的完整性、并直接进入抗原特异性T细胞起免疫调节作用的功能，严重妨碍了新型高效疫苗的研发。
解决以上问题及缺陷的意义为：借助TAT48-60渗透细胞膜以及MHC-II-抗原复合物的靶向性作用，使融合蛋白疫苗能够直接穿透细胞膜、靶向性的进入抗原特异性T细胞中起免疫调节功能。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种tTIM融合蛋白疫苗、制备方法及应用。
本发明是这样实现的，一种tTIM融合蛋白疫苗的制备方法，所述tTIM融合蛋白疫苗的制备方法包括以下步骤：
步骤一，在线网站获取TAT48-60、T-bet、MHC-II基因序列。
步骤二，通过软件Propred.MHC Class-II Binding Peptide Prediction Server预测OVA的主要T细胞表位AI-15、VE-15、GI-15、IC-15。
步骤三，利用过敏性哮喘小鼠的血清和小鼠抗OVAIgG为一抗，通过Western Blot和ELISA筛选出OVA优势T细胞表位IC-15。
步骤四，以linker将TAT48-60、T-bet、MHC-II基因序列与筛选出的OVA主要抗原表位IC-15短肽基因序列进行连接，合成TAT-T-bet-IC-15-MHC-II融合基因，同时合成无携带TAT48-60的T-bet-IC-15-MHC-II融合基因。
步骤五，将tTIM融合基因克隆到pET-32a表达载体上并转化入大肠埃希菌工程菌中。
步骤六，大肠埃希菌BL21经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG诱导培养，表达tTIM融合蛋白。
步骤七，通过6His-tag蛋白纯化系统纯化tTIM融合蛋白，确定tTIM融合蛋白疫苗制备的最佳工艺条件。
进一步，步骤一中，所述TAT48-60的基因序列为GRKKRRQRRRPPQQ。
进一步，步骤一中，所述T-bet的Gene ID为57765，所述MHC-II的GenBank ID为111364。
进一步，步骤二中，所述T细胞表位AI-15的基因序列为AMVYLGAKDSTRTQI，所述VE-15的基因序列为VVRFDKLPGFGDSIE，所述GI-15的基因序列为GLFRVASMASEKMKI，所述IC-15的基因序列为IKHIATNAVLFFGRC。
进一步，步骤三中，所述小鼠抗OVAIgG多克隆抗体的制备方法，包括：
(1)通过南京的GenScript公司合成T细胞表位肽。
(2)制备小鼠抗OVAIgG多克隆抗体，对生产的抗体进行OVA特异性鉴定。
进一步，步骤(2)中，所述对生产的抗体进行OVA特异性鉴定的方法，包括：
1)ELISA微孔板用20μg/ml的OVA包被，加进抗OVA多克隆抗体孵育。微孔用BSA包被，作为非特异性对照抗原，统计检验方法为ANOVA。
2)用抗OVA的多克隆抗体包被ELISA微孔板，加梯度浓度的OVA-T细胞表位肽，按照ELISA的测试程序操作，统计检验方法为ANOVA。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的tTIM融合蛋白疫苗的制备方法制备得到的tTIM融合蛋白疫苗。tTIM融合蛋白疫苗本质是一种靶向性的、可直接进入抗原特异性T细胞中并诱导细胞产生适量的Th1型细胞因子维持免疫系统稳态的新型疫苗(合成后的融合蛋白序列SEQ ID NO1：
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gln Gly Gly
Gly Gly Ser Ala Leu Val Pro Ala Ala Pro Gly Arg Phe Leu Gly Ser
Phe Ala Tyr Pro Pro Arg Ala Gln Val Ala Gly Phe Pro Gly Pro Gly
Glu Phe Phe Pro Pro Pro Ala Gly Ala Glu Gly Tyr Pro Pro Val Asp
Gly Tyr Pro Ala Pro Asp Pro Arg Ala Gly Leu Tyr Pro Gly Pro Arg
Glu Asp Tyr Ala Leu Pro Ala Gly Leu Glu Val Ser Gly Lys Leu Arg
Val Ala Leu Ser Asn His Leu Leu Trp Ser Lys Phe Asn Gln His Gln
Thr Glu Met Ile Ile Thr Lys Gln Gly Arg Arg Met Phe Pro Phe Leu
Ser Phe Thr Val Ala Gly Leu Glu Pro Thr Ser His Tyr Arg Met Phe
Val Asp Val Val Leu Val Asp Gln His His Trp Arg Tyr Gln Ser Gly
Lys Trp Val Gln Cys Gly Lys Ala Glu Gly Ser Met Pro Gly Asn Arg
Leu Tyr Val His Pro Asp Ser Pro Asn Thr Gly Ala His Trp Met Arg
Gln Glu Val Ser Phe Gly Lys Leu Lys Leu Thr Asn Asn Lys Gly Ala
Ser Asn Asn Val Thr Gln Met Ile Val Leu Gln Ser Leu His Lys Tyr
Gln Pro Arg Leu His Ile Val Glu Val Asn Asp Gly Glu Pro Glu Ala
Ala Cys Ser Ala Ser Asn Thr His Val Phe Thr Phe Gln Glu Thr Gln
Phe Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Ala Glu Ile Thr Gln Leu Lys
Ile Asp Asn Asn Pro Phe Ala Lys Gly Phe Arg Glu Asn Phe Glu Ser
Met Tyr Ala Ser Val Asp Thr Ser Val Pro Ser Pro Pro Gly Pro Asn
Cys Gln Leu Leu Gly Gly Asp Pro Phe Ser Pro Leu Leu Ser Asn Gln
Tyr Pro Val Pro Ser Arg Phe Tyr Pro Asp Leu Pro Gly Gln Pro Lys
Asp Met Ile Ser Gln Pro Tyr Trp Leu Gly Thr Pro Arg Glu His Ser
Tyr Glu Ala Glu Phe Arg Ala Val Ser Met Lys Pro Thr Leu Leu Pro
Ser Ala Pro Gly Pro Thr Val Pro Tyr Tyr Arg Gly Gln Asp Val Leu
Ala Pro Gly Ala Gly Trp Pro Val Ala Pro Gln Tyr Pro Pro Lys Met
Ser Pro Ala Gly Trp Phe Arg Pro Met Arg Thr Leu Pro Met Asp Pro
Gly Leu Gly Ser Ser Glu Glu Gln Gly Ser Ser Pro Ser Leu Trp Pro
Glu Val Thr Ser Leu Gln Pro Glu Pro Ser Asp Ser Gly Leu Gly Glu
Gly Asp Thr Lys Arg Arg Arg Ile Ser Pro Tyr Pro Ser Ser Gly Asp
Ser Ser Ser Pro Ala Gly Ala Pro Ser Pro Phe Asp Lys Glu Thr Glu
Gly Gln Phe Tyr Asn Tyr Phe Pro Asn Gly Gly Gly Gly Ser Met Val
Trp Leu Pro Arg Val Pro Cys Val Ala Ala Val Ile Leu Leu Leu Thr
Val Leu Thr Val Leu Ser Pro Pro Val Ala Leu Val Arg Asp Thr Arg
Pro Arg Phe Leu Glu Tyr Val Thr Ser Glu Cys His Phe Tyr Asn Gly
Thr Gln His Val Arg Phe Leu Glu Arg Phe Ile Tyr Asn Arg Glu Glu
Asn Leu Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Gly Tyr Arg Ala Val Thr Glu
Leu Gly Arg Pro Asp Ala Glu Asn Trp Asn Ser Gln Pro Glu Ile Leu
Glu Asp Ala Arg Ala Ser Val Asp Thr Tyr Cys Arg His Asn Tyr Glu
Ile Ser Asp Lys Phe Leu Val Arg Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser Ile
Lys His Ile Ala Thr Asn Ala Val Leu Phe Phe Gly Arg Cys
本发明的另一目的在于提供一种所述的tTIM融合蛋白疫苗在制备缓解过敏性疾病临床症状的药物中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明所构建的tTIM融合蛋白疫苗可通过靶向抗原特异性T细胞并穿透细胞膜，直接进入抗原特异性T细胞中，诱导其产生适量的Th1型细胞因子(如IFN-γ)，平衡Th1/Th2比率维持机体免疫系统的稳态，从而抑制过敏性炎症反应。
附图说明
图1是本发明实施例提供的tTIM融合蛋白疫苗的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的测试抗OVA多克隆抗体对OVA的结合力和特异性的示意图。
图3是本发明实施例提供的测试合成的OVA T细胞表位的免疫原性的示意图。
图4是本发明实施例提供的融合基因设计图。
图5是本发明实施例提供的将合成的tTIM基因或TIM基因插入pET-32a质粒中的示意图。
图6是本发明实施例提供的表达tTIM蛋白示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种tTIM融合蛋白疫苗、制备方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的tTIM融合蛋白疫苗、制备方法及应用包括以下步骤：
S101，在线网站获取TAT48-60、T-bet、MHC-II基因序列。
S102，通过软件Propred.MHC Class-II Binding Peptide Prediction Server预测OVA的主要T细胞表位AI-15、VE-15、GI-15、IC-15。
S103，利用过敏性哮喘小鼠的血清和小鼠抗OVAIgG为一抗，通过Western Blot和ELISA筛选出OVA优势T细胞表位IC-15。
S104，以linker将TAT48-60、T-bet、MHC-II基因序列与筛选出的OVA主要抗原表位IC-15短肽基因序列进行连接，合成TAT-T-bet-IC-15-MHC-II融合基因，同时合成无携带TAT48-60的T-bet-IC-15-MHC-II融合基因。
S105，将tTIM融合基因克隆到pET-32a表达载体上并转化入大肠埃希菌工程菌中。
S106，大肠埃希菌BL21经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG诱导培养，表达tTIM融合蛋白。
S107，通过6His-tag蛋白纯化系统纯化tTIM融合蛋白，确定tTIM融合蛋白疫苗制备的最佳工艺条件。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
本发明的基因序列均属现有序列，可在GenBank上查找。菌种(大肠埃希菌BL21)属于现有菌种，且为实验室常用菌种，购自华大基因。
实施例：tTIM融合蛋白疫苗的制备及免疫原性鉴定
①在线网站获取TAT48-60(GRKKRRQRRRPPQQ)、T-bet(Gene ID:57765)、MHC-II(Gene ID:111364)基因序列；
②通过软件Propred.MHC Class-II Binding Peptide Prediction Server预测OVA的主要T细胞表位AI-15(AMVYLGAKDSTRTQI)、VE-15(VVRFDKLPGFGDSIE)、GI-15(GLFRVASMASEKMKI)、IC-15(IKHIATNAVLFFGRC)。
③利用过敏性哮喘小鼠的血清和小鼠抗OVAIgG为一抗，通过Western Blot和ELISA筛选出OVA优势T细胞表位IC-15；
(1)请南京的GenScript公司合成上述的3条T细胞表位肽。
(2)制备出小鼠抗OVAIgG多克隆抗体。经ELISA鉴定，本发明生产的抗体具有OVA特异性(如图2所示)。
测试抗OVA多克隆抗体对OVA的结合力和特异性如图2所示。
ELISA微孔板用OVA(20μg/ml)包被，加进抗OVA多克隆抗体(如图2中X轴所示)孵育。直条图表示OD值(系10次实验所得数据的平均值±标准误)。#，微孔用BSA包被，作为非特异性对照抗原。这些数据表示生产的抗OVA多克隆抗体能有效地、特异性地结合OVA。统计检验方法：ANOVA。
测试合成的OVAT细胞表位的免疫原性如图3所示。
用抗OVA的多克隆抗体包被ELISA微孔板，加梯度浓度的OVA-T细胞表位肽(如图3中X轴所示)，按照ELISA的测试程序操作。直条图表示OD值(系10次实验所得数据的平均值±标准误)。统计检验方法：ANOVA。
④以linker(Gly4Ser)将TAT48-60、T-bet、MHC-II基因序列与筛选出的OVA主要抗原表位IC-15短肽基因序列进行连接，合成TAT-T-bet-IC-15-MHC-II(tTIM)融合基因，同时合成无携带TAT48-60的T-bet-IC-15-MHC-II(TIM)融合基因；
融合基因设计图及各基因元素如图4所示，中间灰色部分表示Linker。
将合成的tTIM基因或TIM基因插入pET-32a质粒中如图5所示。
⑤将tTIM融合基因克隆到pET-32a表达载体上并转化入大肠埃希菌(E.coli)工程菌中；
⑥大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养，表达tTIM融合蛋白；
⑦通过6His-tag蛋白纯化系统纯化tTIM融合蛋白，确定tTIM融合蛋白疫苗制备的最佳工艺条件；
表达tTIM蛋白如图6所示。在大肠埃希菌(E.coli)BL21中表达tTIM蛋白。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南方医科大学深圳医院
<120> 一种tTIM融合蛋白疫苗、制备方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 638
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gln Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ala Leu Val Pro Ala Ala Pro Gly Arg Phe Leu Gly Ser
20 25 30
Phe Ala Tyr Pro Pro Arg Ala Gln Val Ala Gly Phe Pro Gly Pro Gly
35 40 45
Glu Phe Phe Pro Pro Pro Ala Gly Ala Glu Gly Tyr Pro Pro Val Asp
50 55 60
Gly Tyr Pro Ala Pro Asp Pro Arg Ala Gly Leu Tyr Pro Gly Pro Arg
65 70 75 80
Glu Asp Tyr Ala Leu Pro Ala Gly Leu Glu Val Ser Gly Lys Leu Arg
85 90 95
Val Ala Leu Ser Asn His Leu Leu Trp Ser Lys Phe Asn Gln His Gln
100 105 110
Thr Glu Met Ile Ile Thr Lys Gln Gly Arg Arg Met Phe Pro Phe Leu
115 120 125
Ser Phe Thr Val Ala Gly Leu Glu Pro Thr Ser His Tyr Arg Met Phe
130 135 140
Val Asp Val Val Leu Val Asp Gln His His Trp Arg Tyr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Lys Trp Val Gln Cys Gly Lys Ala Glu Gly Ser Met Pro Gly Asn Arg
165 170 175
Leu Tyr Val His Pro Asp Ser Pro Asn Thr Gly Ala His Trp Met Arg
180 185 190
Gln Glu Val Ser Phe Gly Lys Leu Lys Leu Thr Asn Asn Lys Gly Ala
195 200 205
Ser Asn Asn Val Thr Gln Met Ile Val Leu Gln Ser Leu His Lys Tyr
210 215 220
Gln Pro Arg Leu His Ile Val Glu Val Asn Asp Gly Glu Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Cys Ser Ala Ser Asn Thr His Val Phe Thr Phe Gln Glu Thr Gln
245 250 255
Phe Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Ala Glu Ile Thr Gln Leu Lys
260 265 270
Ile Asp Asn Asn Pro Phe Ala Lys Gly Phe Arg Glu Asn Phe Glu Ser
275 280 285
Met Tyr Ala Ser Val Asp Thr Ser Val Pro Ser Pro Pro Gly Pro Asn
290 295 300
Cys Gln Leu Leu Gly Gly Asp Pro Phe Ser Pro Leu Leu Ser Asn Gln
305 310 315 320
Tyr Pro Val Pro Ser Arg Phe Tyr Pro Asp Leu Pro Gly Gln Pro Lys
325 330 335
Asp Met Ile Ser Gln Pro Tyr Trp Leu Gly Thr Pro Arg Glu His Ser
340 345 350
Tyr Glu Ala Glu Phe Arg Ala Val Ser Met Lys Pro Thr Leu Leu Pro
355 360 365
Ser Ala Pro Gly Pro Thr Val Pro Tyr Tyr Arg Gly Gln Asp Val Leu
370 375 380
Ala Pro Gly Ala Gly Trp Pro Val Ala Pro Gln Tyr Pro Pro Lys Met
385 390 395 400
Ser Pro Ala Gly Trp Phe Arg Pro Met Arg Thr Leu Pro Met Asp Pro
405 410 415
Gly Leu Gly Ser Ser Glu Glu Gln Gly Ser Ser Pro Ser Leu Trp Pro
420 425 430
Glu Val Thr Ser Leu Gln Pro Glu Pro Ser Asp Ser Gly Leu Gly Glu
435 440 445
Gly Asp Thr Lys Arg Arg Arg Ile Ser Pro Tyr Pro Ser Ser Gly Asp
450 455 460
Ser Ser Ser Pro Ala Gly Ala Pro Ser Pro Phe Asp Lys Glu Thr Glu
465 470 475 480
Gly Gln Phe Tyr Asn Tyr Phe Pro Asn Gly Gly Gly Gly Ser Met Val
485 490 495
Trp Leu Pro Arg Val Pro Cys Val Ala Ala Val Ile Leu Leu Leu Thr
500 505 510
Val Leu Thr Val Leu Ser Pro Pro Val Ala Leu Val Arg Asp Thr Arg
515 520 525
Pro Arg Phe Leu Glu Tyr Val Thr Ser Glu Cys His Phe Tyr Asn Gly
530 535 540
Thr Gln His Val Arg Phe Leu Glu Arg Phe Ile Tyr Asn Arg Glu Glu
545 550 555 560
Asn Leu Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Gly Tyr Arg Ala Val Thr Glu
565 570 575
Leu Gly Arg Pro Asp Ala Glu Asn Trp Asn Ser Gln Pro Glu Ile Leu
580 585 590
Glu Asp Ala Arg Ala Ser Val Asp Thr Tyr Cys Arg His Asn Tyr Glu
595 600 605
Ile Ser Asp Lys Phe Leu Val Arg Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser Ile
610 615 620
Lys His Ile Ala Thr Asn Ala Val Leu Phe Phe Gly Arg Cys
625 630 635
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