一种载螨变应原微球的缓释可溶性微针递送系统
阅读说明：本技术 一种载螨变应原微球的缓释可溶性微针递送系统 (Slow-release soluble microneedle delivery system of mite-loaded allergen microsphere ) 是由 不公告发明人 于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种载螨变应原微球的缓释可溶性微针递送系统,包括针体和背衬,针体包括螨变应原微球和基质材料,其中,基质材料为甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物和聚乙二醇的混合,甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物和聚乙二醇的含量比为(2:1)～(1:1)。本发明通过选择特定的螨变应原微球的组分种类及含量比,使制得的螨变应原缓释微球性能卓越,能较好的负载螨变应原；并通过选择特定的基质材料组分种类及含量比,及特定的药载比,使制得的螨变应原缓释可溶性微针成型性、机械强度等性能俱佳,且大大延长了药物的释放时间,治疗效果优于非缓释型的螨变应原可溶性微针,有利于降低螨变应原给药频次,增加患者的依从性。(The invention discloses a slow-release soluble microneedle delivery system carrying mite allergen microspheres, which comprises a needle body and a back lining, wherein the needle body comprises mite allergen microspheres and a matrix material, the matrix material is a mixture of methyl vinyl ether-maleic anhydride copolymer and polyethylene glycol, and the content ratio of the methyl vinyl ether-maleic anhydride copolymer to the polyethylene glycol is (2:1) - (1: 1). According to the invention, by selecting the component types and content ratios of the specific mite allergen microspheres, the prepared mite allergen slow-release microspheres have excellent performance and can better load mite allergens; and by selecting the specific types and content ratios of the components of the matrix material and the specific drug loading ratio, the prepared mite allergen sustained-release soluble microneedle has good moldability, mechanical strength and other properties, greatly prolongs the release time of the drug, has better treatment effect than non-sustained-release mite allergen soluble microneedles, is beneficial to reducing the administration frequency of the mite allergen and increases the compliance of patients.)
技术领域
本发明涉及螨变应原的给药技术领域，具体涉及一种载螨变应原微球的缓释可溶性微针递送系统。
背景技术
螨是诱发哮喘、过敏性鼻炎和湿疹等过敏性疾病的重要变应原来源。近年来美国、新西兰和澳大利亚等许多国家的调查研究相继证实，螨源性变应原与过敏性疾病的密切关系，为过敏性哮喘等过敏性疾病的病因；脱敏治疗成为该类疾病最有效的治疗方法。但螨变应原目前较多地以注射剂形式给药，长期注射导致患者顺应性差，因此亟待一种新的剂型用于螨变应原的递送。
皮肤作为人体最大的器官，并且具有大量的抗原呈递细胞，例如表皮层中的朗格罕氏细胞占所有细胞总数的3％～5％。然而，皮肤的角质层障碍使得螨变应原等大分子药物的递送成为了难题。作为1976年提出的新剂型，微针这一透皮给药技术在近十年来得到了迅速发展，受到广大研究者的青睐。它可以刺破人体皮肤的角质层障碍进入表皮层，而不触及真皮层的神经末梢，实现无痛微创给药，并且给药效果突破了传统的经皮给药制剂。可溶性微针属于微针中的一类，相比其他类型的微针，具有载药量大、给药剂量可控等优点，因此是目前研究最广泛的微针类型。
微球是一种药物分散或被吸附在高分子、聚合物基质中而形成的微粒分散体系。药物通过微球化可以实现缓控释，近年采用微球化技术制备的药物已有几十种，是目前比较成熟的制剂新技术。过敏性疾病治疗一般采用长期的脱敏疗法，即通过长期频繁的给药来使得机体对某种特定变应原耐受。因此，开发螨变应原的缓释制剂可以减少变应原的给药次数，增加患者的顺应性。
通过查阅国内外的文献和专利，有文献和专利报道将螨变应原直接载入可溶性微针：如Kim等用透明质酸制备可溶性微针递送螨变应原(Kim J H,Shin J U,Kim S H,etal.Successful transdermal allergen delivery and allergen-specificimmunotherapy using biodegradable microneedle patches[J].Biomaterials,2018,150:38-48)；如公开号为JP2014156433A的日本专利和公开号为CN109715075A的中国专利，讲述了可溶性微针直接加载变应原时的材料选择，但均未涉及螨变应原缓释微针的相关内容。
另外，目前尚未有螨变应原微球递送，虽有花粉变应原，蜂毒变应原的微球递送(AProtective Allergy Vaccine Based on CpG-and Protamine-Containing PLGAMicroparticles[J].Pharmaceutical Research,2007,24(10):1927-1935.)，但螨变应原疫苗的蛋白组分与花粉变应原，蜂毒变应原等存在成分差异，如何对螨变应原具有良好负载效果，仍具有不确定性。
此外，虽有研究者制备了加载微球的可溶性微针，但是都没有通过相应的处方筛选来达到较优的机械性能(Ke C J,Lin Y J,Hu Y C,et al.Multidrug release based onmicroneedle arrays filled with pH-responsive PLGA hollow microspheres.[J].Biomaterials,2012,33(20):5156-5165；DeMuth P C,Garcia-Beltran W F,Ai-Ling ML,et al.Composite dissolving microneedles for coordinated control of antigenand adjuvant delivery kinetics in transcutaneous vaccination[J].Advancedfunctional materials,2013,23(2):161-172)，同时，所加载的药物不同，微球的构建材料也会产生变化，根据文献(章捷,马凤森,占浩慧等,用于构建可溶性微针的基质材料及其复合材料[J].材料导报,2017,31(19):129-134.)可知，不同的材料之间组合以及材料与药物的组合，会导致可溶性微针机械性能具有差异；根据文献(Park J H,Allen M G,PrausnitzM R.Polymer microneedles for controlled-release drug delivery[J].Pharmaceutical Research,2006,23(5):1008-19)可知，随着药物在微针处方中的含量升高，微针机械性能将会发生下降。故选择何种材料开发载螨变应原微球的缓释可溶性微针递送系统，以及可溶性微针中各成分的质量占比为多少，能使其具有良好、有效的递送效果，仍充满许多不确定性。
综上所述，针对螨变应原疫苗，如何开发出一种机械性能优良、具有良好、有效的缓释递送效果的缓释可溶性微针递送系统，是本领域技术人员急需解决的技术难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，提供了一种载螨变应原微球的缓释可溶性微针递送系统(简称：螨变应原缓释可溶性微针，下同)，通过选择适合的基质材料种类与含量、螨变应原微球的组分种类与含量比，解决了上述现有技术存在的不足之处。
为此，本发明采取了以下技术方案：
一种载螨变应原微球的缓释可溶性微针递送系统，包括针体和背衬，针体包括螨变应原微球和基质材料，其中，基质材料为甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物和聚乙二醇的混合，甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物和聚乙二醇的含量比为(2:1)～(1:1)。
优选的，甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物和聚乙二醇的含量比为3:2。
优选的，螨变应原微球和基质材料的含量比为(2:3)～(1:1)。
更优选的，螨变应原微球和基质材料的含量比为1:1。
优选的，螨变应原微球由油相、内水相和外水相构成，其中，油相为PEG-PLGA和微量司盘60溶于二氯甲烷形成的共混液，内水相为螨变应原水溶液，外水相为0.5％浓度的PVA水溶液，且油相与内水相的体积比为14:1。
优选的，针体中各成分及其含量为：螨变应原微球的质量占比为50％，甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物的质量占比为30％，聚乙二醇的质量占比为20％。
本发明中，甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物(Gantrez)的型号不作任何限定，只要满足其制备的可溶性微针机械性能符合要求即可，包括但不限于Gantrez S-97。
与现有技术相比，本发明提供的载螨变应原微球的缓释可溶性微针递送系统，有益效果如下：
本发明通过选择特定的螨变应原微球的组分种类及含量比，使制得的螨变应原缓释微球性能卓越，能较好的负载螨变应原；并通过选择特定的基质材料组分种类及含量比，及特定的药载比，使制得的螨变应原缓释可溶性微针成型性、机械强度等性能俱佳，且大大延长了药物的释放时间，治疗效果优于非缓释的螨变应原可溶性微针，有利于降低螨变应原给药频次，增加患者的依从性。
附图说明
图1为螨变应原缓释可溶性微针的释放曲线图。
图2为螨变应原可溶性微针的释放曲线图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1螨变应原缓释可溶性微针的制备
本发明拟制备的螨变应原缓释可溶性微针，由螨变应原微球和微针基质材料组成。
在众多的微球制备方法中，复乳溶剂蒸发法以其操作简单、控制工艺参数方便、无需调节pH和大幅变温，且相比单乳液体系大大提高了微球的载药量和包封率，具有可控释等优势而常用于包囊水溶性芯材。故本发明采用复乳溶剂蒸发法制备了螨变应原微球，具体方法如下：
囊壁材料与微量司盘60溶于二氯甲烷作为油相，螨变应原水溶液作为内水相，将内水相与油相按一定比例混合后，进行超声乳化，得W/O初乳。然后，将初乳注入0.5％浓度的PVA水溶液的外水相中，均质机搅拌20～30s，得复乳。搅拌挥发3h，除去有机溶剂，离心15min，弃去上清液，蒸馏水洗涤，重复3次。冻干得干粉，-4℃保存备用。
本发明采用多次填模法制备螨变应原缓释可溶性微针，步骤如下：
1)将处方中螨变应原微球和微针基质材料按比例混合后，用适量溶剂(去离子水)溶解成均匀的浇注溶液，取适量浇注溶液装入离心管，置于离心沉淀器，离心使得浇注溶液中的气泡去除，静置备用。
2)取步骤1)离心后所得的浇注溶液，浇注于聚二甲基硅氧烷(PDMS)阴模具上，利用金属阳模微针将浇注溶液反复挤压进入PDMS阴模孔洞；
3)观察PDMS阴模具孔洞填充满浇注溶液后，取出模具，放入烘箱，于37℃下干燥6h后取出，脱模，即得成品。
实施例2螨变应原缓释可溶性微针的相关测定
1.螨变应原微球粒径
精密称取所制备的干燥微球均匀散布于载玻片上，用带测微尺的光学显微镜观察形态并计数300个微球粒径(μm)，划分粒径范围并经统计学处理计算平均粒径。
当微球平均粒径小于30μm时，微球更容易分布于微针针尖，视为符合要求，可用于后续制备。
2.螨变应原微球的包封率测定
以考马氏亮蓝(CBB)法测定10ml螨变应原疫苗溶液的总蛋白含量，记为W1。随后将制备好的螨变应原微球复溶并旋涡震荡5min后，超速离心16000rpm、10min，取上清液，用CBB法测定其总蛋白含量，记为W2，计算包封率EE。包封率EE＝(W1-W2)/W1*100％。
根据2015版《中国药典》(通则9014)要求，当微球包封率大于80％时，为符合要求。
3.螨变应原缓释可溶性微针的机械性能测定
1)置于扫描电子显微镜SEM下观察微针的含针率(可溶性微针针数/阳模具针数*100％，平行6组)，来判断微针的成型性，含针率越高则微针的成型性越好。
2)将20N的重物放置于针尖朝上的微针上，3min后取下重物，利用显微镜观察微针的剩余高度百分比(剩余高度百分比＝可溶性微针高度/阳模具微针高度*100％，平行6组)，来判断微针的机械强度，剩余高度百分比越大则微针的机械强度越好。
当微针含针率大于80％，剩余高度百分比大于70％，视为符合测试要求。
4.螨变应原的药物释放性能考察
配置pH为7.4的PBS缓冲液，采用Franz扩散池法：取6片已知确认处方所制得的螨变应原缓释可溶性微针贴片，将微针预先刺破石蜡parafilm封口膜后加载在Franz扩散池上。分别在1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d进行取样，取样量为0.9mL。接收液为pH为7.4的PBS缓冲液。
同样采用Franz扩散法：取6片已知载药量的螨变应原可溶性微针贴片，将微针预先刺破parafilm封口膜后加载在Franz扩散池上。分别在30s、1min、5min、10min、30min、1h、3h、6h、10h进行取样，取样量为0.9mL。接收液为pH为7.4的PBS缓冲液。
最后，通过ELISA试剂盒检测上述不同时段所取样溶液的螨变应原含量，绘制药物释放曲线。
5.螨变应原的治疗效果测定
取制得的螨变应原可溶性微针、螨变应原缓释可溶性微针各9片，利用给药器分别刺入经过脱毛后的18只已致敏大鼠背部皮肤，待微针针部完全溶解后取出。分别在给药后间隔0天、7天、14天后从大鼠的静脉取血清，用ELISA法对血清中的特异性IgE水平进行定量。第0天所测定的为过敏大鼠的初始血清特异性IgE水平，第7天与第14天所测定的血清特异性IgE水平体现的是给药后对过敏大鼠的治疗效果，其血清特异性IgE水平越低，说明对治疗效果越好。
实施例3螨变应原微球的组分种类及含量对螨变应原负载的影响
本实施例中，螨变应原微球由油相、内水相、外水相构成三相体系，油相为囊壁材料和微量司盘60溶于二氯甲烷形成的共混溶液，内水相为螨变应原水溶液，外水相为0.5％浓度的聚乙烯醇(PVA)水溶液，通过改变囊壁材料的种类、油相与内水相的体积比，来探究如表1所示的不同材料构建的螨变应原微球对包封率及粒径的影响。
本实施例中，囊壁材料选为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇-聚乳酸丙烯酸共聚物(PEG-PLGA)、聚乙二醇-聚乳酸共聚物(PEG-PLA)、聚3-羟基丁酸酯(PHB)中的一种；油相与内水相的含量比根据预实验初步确定范围，选为20:1～2:1不等(表1.)。
本实施例中，螨变应原微球的制备工艺，见实施例1。螨变应原微球的包封率、平均粒径的测定方法，见实施例2，测试结果见表1。
表1.不同材料构建的螨变应原微球对包封率及粒径的影响(mean±SD，n＝6)
从表1可知，综合考虑螨变应原微球的包封率和粒径，仅当囊壁材料为PEG-PLGA、油相与内水相的含量比为14:1时，符合测试要求。
故，构成螨变应原微球的三相体系中，选择PEG-PLGA和微量司盘60溶于二氯甲烷形成的共混液作为油相，选择螨变应原水溶液作为内水相，选择0.5％浓度的PVA水溶液作为外水相，且油相与内水相的含量比为14:1。
实施例4基质材料的组分种类对螨变应原缓释可溶性微针性能的影响
在实施例3的基础上，设定基质材料在针体中的质量占比为一定值(基质材料占60％，螨变应原微球颗粒占40％)，仅改变基质材料的组分种类，考察如表2所示的不同组合的基质材料对微针机械性能的影响。
本实施例中，基质材料选择甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物(Gantrez)、聚乙二醇(PEG)、透明质酸(HA)和麦芽糖中的一种或两两组合。
本实施例中，螨变应原缓释可溶性微针的制备工艺，见实施例1。微针成型性、机械强度的测定方法，见实施例2，测试结果见表2。
表2.不同的基质材料组分对微针性能的影响(mean±SD)
从表2可知，综合考虑含针率和剩余高度百分比，仅当基质材料为Gantrez和PEG的混合时(即No.7组)，含针率为95.6±1.4％，剩余高度百分比为72.5±2.5％，均符合测试要求。
故，选择Gantrez和PEG的混合作为基质材料。
实施例5基质材料之间各组分的含量比对螨变应原缓释可溶性微针性能的影响
在实施例4的基础上，设定基质材料在针体中的质量占比为一定值(基质材料占60％，螨变应原微球颗粒占40％)，且基质材料的组分固定为Gantrez和PEG的混合，仅改变Gantrez与PEG的含量比，考察如表3所示的不同含量比的基质材料组分对微针性能的影响。
本实施例中，螨变应原缓释可溶性微针的制备工艺，见实施例1。微针成型性、机械强度的测定方法，见实施例2，测试结果见表3。
表3.不同含量比的基质材料组分对微针性能的影响(mean±SD)
No.
Gantrez与PEG的含量比
含针率(％)
剩余高度百分比(％)
1
Gantrez:PEG＝3:1
94.2±1.4
69.5±1.7
2
Gantrez:PEG＝2:1
95.6±1.7
71.1±2.1
3
Gantrez:PEG＝3:2
98.3±1.6
83.2±2.3
4
Gantrez:PEG＝1:1
95.8±1.4
72.5±2.5
5
Gantrez:PEG＝2:3
93.1±1.2
64.1±1.4
从表3可知，综合考虑含针率和剩余高度百分比，当Gantrez与PEG的含量比为(2:1)～(1:1)时符合测试要求。其中，当Gantrez与PEG的含量比为3:2时(即NO.3组)，剩余高度百分比和含针率都最高，表明微针的机械性能和成型性均最佳。
故，选择3:2作为Gantrez与PEG的最佳含量比。
实施例6药载比对螨变应原缓释可溶性微针性能的影响
根据文献(Park J H,Allen M G,Prausnitz M R.Polymer microneedles forcontrolled-release drug delivery[J].Pharm Res,2006,23(5):1008-19.)可知，微针中载药量的变化，将会影响微针的机械性能，存在不确定性。
在实施例5的基础上，设定基质材料的组分及比例为一定值，仅改变药载比(即螨变应原微球与基质材料的含量比)，考察如表4所示的不同药载比对微针性能的影响。
本实施例中，螨变应原缓释可溶性微针的制备工艺，见实施例1。微针成型性、机械强度的测定方法，见实施例2，测试结果见表4。
表4.不同药载比构成的微针处方及对微针性能的影响(mean±SD)
No.
药载比
含针率(％)
剩余高度百分比(％)
1
2:3
98.3±1.6
83.2±2.3
2
3:4
97.8±1.4
77.2±2.1
3
1:1
97.6±1.6
75.3±2.4
4
4:3
83.6±1.2
67.2±1.8
5
3:2
75.6±2.2
54.1±3.1
由表4可知：
1)综合考虑含针率和剩余高度百分比，当药载比为(2:3)～(1:1)时符合测试要求。
2)考虑载药量对螨变应原治疗效果的影响，选择药载比为1:1时作为最佳处方。
综上所述，本发明提供的螨变应原缓释可溶性微针中，针体的最佳处方为：螨变应原微球的质量占比为50％，Gantrez的质量占比为30％，PEG的质量占比为20％；其中，螨变应原微球的三相体系构成为：油相为PEG-PLGA和微量司盘60溶于二氯甲烷形成的共混液，内水相为螨变应原水溶液，外水相为0.5％浓度的PVA水溶液，且油相与内水相的含量比为14:1。
本发明提供的螨变应原缓释可溶性微针中，针体的适宜处方为：螨变应原微球与基质材料的含量比为(2:3)～(1:1)，基质材料由Gantrez和PEG组成，Gantrez与PEG的含量比为(2:1)～(1:1)。
实施例7螨变应原缓释可溶性微针的释放曲线考察
本实施例对螨变应原缓释可溶性微针、螨变应原可溶性微针进行释放曲线的比较，仅将螨变应原微球等剂量的替换成螨变应原可溶性微针，直接载入微针，基质材料不变，其余制备方法参照实施例1，即可制得螨变应原可溶性微针。
本实施例中，螨变应原缓释可溶性微针的制备工艺，见实施例1。螨变应原的药物释放性能考察，见实施例2，释放曲线见图1和图2。
由图1和图2结果可知：本发明提供的螨变应原缓释可溶性微针，释放时间在8天时，累计药物释放量超过90％；而普通的螨变应原可溶性微针(非缓释)，释放时间在180min时，累计药物释放量已经超过90％。
实施例8螨变应原缓释可溶性微针的治疗效果评价
本实施例拟对螨变应原缓释可溶性微针、螨变应原可溶性微针进行治疗效果的比较，仅将螨变应原微球等剂量的替换成螨变应原，直接载入微针，基质材料不变，其余制备方法参照实施例1，即可制得螨变应原可溶性微针。
本实施例中，螨变应原缓释可溶性微针的制备工艺，见实施例1。螨变应原的治疗效果测定，见实施例2，测定结果见表5。
表5.治疗效果的比较(mean±SD，n＝9)
由表5可知，在第7天取血时，螨变应原可溶性微针组的血清IgE水平低于螨变应原缓释可溶性微针组；但在第14天取血时，螨变应原缓释可溶性微针组的血清IgE水平比螨变应原可溶性微针组更低。
结合实施例7的释放曲线比较，分析原因可知，第7天时螨变应原缓释可溶性微针组的药物并未释放完全，而螨变应原可溶性微针组早已释放完全，因此螨变应原缓释可溶性微针组的治疗效果不如螨变应原可溶性微针组。但随着时间推移，螨变应原缓释可溶性微针组继续释放螨变应原，导致第14天时螨变应原缓释可溶性微针组的对过敏大鼠的治疗效果更好。
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