一种耐湿的螨变应原可溶性微针
阅读说明：本技术 一种耐湿的螨变应原可溶性微针 (Moisture-proof mite allergen soluble microneedle ) 是由 不公告发明人 于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种耐湿的螨变应原可溶性微针,包括针体和背衬,针体包括螨变应原和复合基质材料,其中,复合基质材料为甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物与聚乙烯醇的混合,甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物与聚乙烯醇的含量比为(1:1.5)～(2:1)。本发明通过筛选适合的基质材料种类与含量(Gantrez S-97+PVA)、适合的药载比,使制得的螨变应原可溶性微针在高湿条件下仍能具有良好的机械强度,易于刺入皮肤给药,且不影响螨变应原活性。(The invention discloses a moisture-proof mite allergen soluble microneedle, which comprises a needle body and a back lining, wherein the needle body comprises mite allergen and a composite matrix material, the composite matrix material is a mixture of a methyl vinyl ether-maleic anhydride copolymer and polyvinyl alcohol, and the content ratio of the methyl vinyl ether-maleic anhydride copolymer to the polyvinyl alcohol is (1:1.5) - (2: 1). According to the invention, through screening the proper type and content of the matrix material (Gantrez S-97+ PVA) and the proper drug loading ratio, the prepared mite allergen soluble microneedle still has good mechanical strength under a high-humidity condition, is easy to penetrate into the skin for administration, and does not influence the activity of the mite allergen.)
技术领域
本发明涉及螨变应原的给药技术领域，具体涉及一种耐湿的螨变应原可溶性微针。
背景技术
过敏的发病率很高，文献报道约有三分之一的人在一生中患过过敏性疾病。根据我国北京地区的统计，在一般人群中过敏的发病率约为15％。太平洋部分地区的过敏性疾病甚至高达50％。进入21世纪以来，该病已成为最常见的全球性疾病之一。世界卫生组织的数据表明，目前全球有22％～25％的人患有过敏性疾病，并以每10年23倍的速度增加，目前仅在我国就有两亿多人患病。因此过敏和抗过敏，是现代人面临的不可回避的严峻问题。引起变态反应的抗原物质称为变应原，螨变应原属于变应原中的一大类。目前的螨变应原多以注射剂进行给药，针头的频繁注射容易导致患者的依从性差。由于螨变应原中含有抗原活性蛋白，口服给药容易被胃肠道中的蛋白酶分解失活，导致患者依从性差；螨变应原属于生物大分子，由于皮肤存在角质层障碍导致药物难以透过进入皮肤。因此，亟待一种螨变应原的新型递送途径。
微针作为一种新型药物递送系统，近年来得到了快速发展，尤其是可溶性微针。微针可以打破皮肤的角质层障碍，到达表皮层而不触及真皮层的神经末梢，达到无痛微创给药，且给药效果远远突破了传统经皮给药制剂。可溶性微针是微针中的一类，也是目前研究最多的类型，它可以刺入皮内后自行溶解且不造成有害残留。可溶性微针构筑的基质材料一般为水溶性好的天然高分子或合成高分子材料，从文献(Wang Q L,Ren J W,Chen B Z,et al.Effect of humidity on mechanical properties of dissolving microneedlesfor transdermal drug delivery[J].Journal of industrial and engineeringchemistry,2018,59:251-258)可知，许多高分子材料制得的可溶性微针在一定湿度条件下贮藏一定时间后，会发生力学强度下降以至于无法刺入皮肤。在我国南方尤其夏季，空气中的湿度较大，即使将微针真空包装，但从取出到使用的过程中也存在因吸潮导致机械性能下降的隐患，因此制备一种能够耐湿的可溶性微针，是螨变应原可溶性微针未来在产业化过程中亟待解决的技术难题。
经检索，涉及将螨变应原载入可溶性微针的相关文献、专利如下：
如文献(Kim J H,Shin J U,Kim S H,et al.Successful transdermal allergendelivery and allergen-specific immunotherapy using biodegradable microneedlepatches[J].Biomaterials,2018,150:38-48)将螨变应原载入可溶性微针，用单一材料透明质酸制备可溶性微针，微针的制备工艺为微滴牵引法，但未提及湿度是否会影响透明质酸制得的微针力学强度。
如公开号为CN109715075A的中国专利，提供了一种含至少一种变应原的组合物载入微针的制剂思路，选择特定的基质材料透明质酸进行研究，但该技术方案的不足之处在于：该专利着重介绍变应原载入微针的制备工艺变化，未考察湿度与不同变应原、不同基质材料的影响因素，也未就某一特定的变应原(如螨变应原)载入可溶性微针时的处方筛选进行考察。故，对于在特定湿度条件下螨变应原载入可溶性微针时，处方变化导致的可溶性微针机械性能差异，从该专利中无法知悉。
如公开号为JP2014156433A的日本专利，也只是泛泛介绍了变应原载入微针的可能性，着重介绍了微针结构的变化，但该技术方案的不足之处在于：未有具体的实施例证明不同的基质材料对开发螨变应原可溶性微针的机械性能差异，也无法判断是否耐湿。
如文献(Wang Q L,Ren J W,Chen B Z,et al.Effect of humidity onmechanical properties of dissolving microneedles for transdermal drugdelivery[J].Journal of industrial and engineering chemistry,2018,59:251-258)选择4种单一材料(透明质酸、聚乙烯醇、壳聚糖及明胶)制备可溶性微针，考察了在20％、40％、60％、80％湿度条件和干燥条件下放置30分钟，对可溶性微针力学性能的影响，发现：①在干燥和20％相对湿度条件下，四种材料制备的可溶性微针都具有良好的机械性能，具有100％的穿孔率；②在40％和60％相对湿度条件下，聚乙烯醇制备的可溶性微针穿孔率下降到90％，透明质酸、壳聚糖及明胶仍保持与干燥时相当的机械性能；③但在80％相对湿度条件下四种材料机的械性能都大大降低，无法刺入皮肤。
如文献(Hutton A R J,Quinn H L,McCague P J,et al.Transdermal deliveryof vitamin K using dissolving microneedles for the prevention of vitamin Kdeficiency bleeding[J].International journal of pharmaceutics,2018,541(1-2):56-63)报道，用Gantrez S-97制备载药维生素K的微针，微针在86％相对湿度条件下比43％湿度条件下的机械性能更好。该文献的结论迥异于“相对湿度越大则机械性能越差”的公知常识，但该文献的技术不足之处在于：①日常生活中由于气候和地域的不同，空气相对湿度也有很大的区别，而文献仅考察了43％RH和86％RH相对湿度条件，并不足以预测GantrezS-97在别的湿度条件下微针的机械性能也符合制剂要求；②进一步的，由于螨变应原的理化性质迥异于维生素K，故用Gantrez S-97载药螨变应原制成可溶性微针时，是否仍符合“86％相对湿度条件下微针的机械性能优于43％相对湿度”的规律，也尚未可知。
可见，在不同湿度条件下，选择不同材料负载不同药物制成的可溶性微针，对微针机械性能的影响是不一样的，这对开发螨变应原可溶性微针时的基质材料选择带来了不确定性。
另外，文献(Shayan Fakhraei Lahiji,Yoojung Jang,et al.Effects ofdissolving microneedle fabrication parameters on the activity of encapsulatedlysozyme[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences,2018,117:290-296)研究了聚合物的种类和浓度、制备和贮存温度以及干燥条件对蛋白类药物溶菌酶(Lysozyme)的活性影响，从该文献可知，不同种类的聚合物、不同的干燥温度会对蛋白类药物产生失活与否的显著差异。亦因此，螨变应原作为迥异于溶菌酶的另一种蛋白类药物，选择何种聚合物作为基质材料而使得螨变应原保持较佳的活性，也是不确定的。
综上所述，如何开发出一种处方适宜、机械强度适中、耐湿且不影响螨变应原活性的螨变应原可溶性微针，是本领域技术人员急需解决的技术难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，提供了一种耐湿的螨变应原可溶性微针，通过选择适合的基质材料种类与含量、药载比，解决了上述现有技术存在的不足之处。
为此，本发明采取了以下技术方案：
一种耐湿的螨变应原可溶性微针，包括针体和背衬，针体包括螨变应原和复合基质材料，其中，复合基质材料为甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物(Gantrez)与聚乙烯醇(PVA)的混合，甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物与聚乙烯醇的含量比为(1:1.5)～(2:1)。
优选的，甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物与聚乙烯醇的含量比为(1:1)。
优选的，螨变应原与复合基质材料的含量比为(1:4)～(2:3)。
更优选的，螨变应原与复合基质材料的含量比为2:3。
优选的，甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物的型号为Gantrez S-97。
优选的，针体中各成分及其含量为：螨变应原的质量占比40％，甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物的质量占比30％，聚乙烯醇的质量占比30％。
本发明还提供了一种如前所述的耐湿的螨变应原可溶性微针的制备方法，包括如下步骤：
(1)微针的阴模制备
采用倒模法制备螨变应原疫苗可溶性微针所需的聚二甲基硅氧烷阴模具；
(2)螨变应原可溶性微针的制备
将处方量的各组分混合、溶解成均一的基质溶液，取适量基质溶液涂覆于聚二甲基硅氧烷模具上，通过滚轮反复挤压使基质溶液进入阴模的孔洞。最后，置于37℃条件中干燥，脱模即得。
与现有技术相比，本发明提供的耐湿的螨变应原可溶性微针，有益效果如下：
①本发明的申请人经过探索性研究，首创性地发现Gantrez S-97和PVA结合作为复合基质材料制备螨变应原可溶性微针时，随着湿度的上升，其机械性能呈现先上升后降低的趋势，这与“相对湿度越大，则微针的机械性能越差”公知常识迥异。
②亦因此，本发明通过筛选适合的基质材料种类与含量(Gantrez+PVA)、适合的药载比，使制得的螨变应原可溶性微针在高湿条件下仍能具有良好的机械强度，易于刺入皮肤给药，且不影响螨变应原活性，取得了出人意料的、有别于公知常识的效果。
附图说明
图1为倒模法制备微针阴模的流程示意图。
图2为本发明挤压入模法制备螨变应原可溶性微针的流程示意图。
图3为本发明实施例3之在不同湿度条件下螨变应原可溶性微针的机械性能变化。
图4为本发明实施例4之在不同湿度条件下螨变应原可溶性微针的机械性能变化。
图5为本发明实施例5之NO.1组、NO.2组、NO.3组在不同湿度条件下螨变应原可溶性微针的机械性能变化。
图6为本发明实施例5之NO.4组、NO.5组、NO.6组在不同湿度条件下螨变应原可溶性微针的机械性能变化。
图7为本发明实施例5之NO.7组、NO.8组、NO.9组在不同湿度条件下螨变应原可溶性微针的机械性能变化。
图8为本发明实施例6之在不同湿度条件下螨变应原可溶性微针的机械性能变化。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1螨变应原可溶性微针阴模的制备
如图1，本发明采用MEMS工艺结合倒模法制备微针阴模，步骤如下：
1)单晶硅阳模微针的制备
采用MEMS工艺制备阳模微针，微针针列为10*10，针高600μm，底部直径为300μm，针尖直径≤10μm。
2)制备聚二甲基硅氧烷模具
将聚二甲基硅氧烷与固化剂按质量比8:1混合后，浇注到放有单晶硅阳模微针的长方体容器中；将容器置于真空干燥箱，于真空度0.1MPa下抽真空3min，使得混合液中的气泡去除；再放入烘箱，于80℃下干燥3h后取出，得到成型的聚二甲基硅氧烷微针阵列模具。
实施例2螨变应原可溶性微针的制备
如图2，本发明采用挤压入模法制备螨变应原可溶性微针，步骤如下：
1)将基质材料以及螨变应原按处方比例混合后，用pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶解成均匀的混合液(即基质溶液)，取适量的基质溶液装入离心管，置于离心沉淀器，离心使得基质溶液中的气泡去除，静置备用。
2)取步骤1)离心后所得的基质溶液，浇注于本发明实施1制备的聚二甲基硅氧烷模具上，再将聚二甲基硅氧烷模具置于平面上，利用滚轮挤压模具上方的基质溶液，来回多次，使得基质溶液注入模具的孔洞中。然后，将模具置于37℃烘箱中，干燥4h后取出，脱模，即得成品。
实施例3不同湿度条件对螨变应原可溶性微针机械性能和活性的影响
本发明中，基质材料拟选择高分子的聚合物，基于前述文献的研究，本实施例拟用甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物(Gantrez S-97)载入螨变应原制成螨变应原可溶性微针，通过测定在不同湿度条件下螨变应原可溶性微针的力学强度和螨变应原的活性变化，来探究湿度条件对螨变应原可溶性微针机械性能和活性的影响。湿度条件选择10％～90％相对湿度(10～90％RH)。以为后续微针材料构成、与变应原结合以及他们相互之间关系对微针刺入性能的影响判断提供前提基础。
本实施例涉及的螨变应原可溶性微针，其制备方法参照本发明的实施例1和实施例2。
设置湿度条件：由于我国南方回潮天气的气候特征，使得空气相对湿度达90％以上，通常微针使用时在自然环境下的暴露时间约为20min，亦因此，本发明模拟真实使用场景从严选择实验条件(即湿度为90％RH，贮存时间为40min)进行微针的相关性能考察。考察方法为：使用药品稳定性试验箱来模拟不同的湿度环境。将存储温度固定为25℃，相对湿度设置为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％和90％，放置40min后取出。
螨变应原可溶性微针的皮肤穿刺性能考察：将制得的螨变应原疫苗可溶性微针用给药器以15N的力刺入离体猪耳皮肤1min后，取下微针贴片。在微针给药部位利用亚甲基蓝染料进行染色，擦除孔洞边缘的多余染料，计算穿孔率(皮肤蓝点数量与微针的针数量之比)，平行6组。穿孔率在80％以上则视为符合要求。
螨变应原相对生物活性的测量：(UniCAP法)：样品及标准品准备：样品为螨变应原溶液与基质材料的混合溶液，标准品为螨变应原溶液，分别取样品及相应标准品与等体积0.1mol/L PBS(pH 7.4)混合后，分别进行3倍系列稀释至6个点。取各稀释度样品与等体积尘螨阳性血清(4倍稀释)混合，并设阴性对照(50μLPBS缓冲液+50μL稀释的尘螨阳性血清)及100％抑制对照(50μL未稀释的标准品+50μL稀释的尘螨阳性血清)。生物活性测定：将样品、标准品及对照样品于37℃孵育2h，在ImmunoCAP 100E全自动过敏原分析仪上测定各样品、标准品及对照样品中特异性slgE浓度，每个稀释度重复测定2次，取其荧光强度的平均值计算抑制率。
结果计算：抑制率(％)＝(阴性对照测定值-样品测定值)/(阴性对照测定值-100％抑制对照的测定值)×100％。
以各稀释度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制曲线。对样品和标准品采用平行线分析法，得出样品的相对生物活性。平行测定6次。
按照CFDA颁布的《变态反应原(变应原)制品质量控制技术指导原则》中规定：制品的生物活性应为标示量的50～200％，即，当相对生物活性低于50％时，不符合测试要求。
首先，申请人考察了不同湿度条件下，以Gantrez S-97为基质材料制得的螨变应原可溶性微针，其力学强度的变化，结果见图3。
从图3中可知，①随着湿度的上升，机械性能呈现先上升后降低的趋势，这与“相对湿度越大，则微针的机械性能越差”公知常识迥异；②在70％RH时，微针的穿孔率大于80％且达到峰值，此时机械性能最好；③在90％RH时，微针的穿孔率低于80％时，不符合测试要求；也就是说，在相对湿度达90％这样的回潮天气条件下，以Gantrez S-97为基质材料制得的螨变应原可溶性微针，在使用时很可能会因机械性能的下降而无法完全刺入皮肤；④从图3的曲线可知，在83％RH时的微针机械性能相当或略逊于43％RH，这与本发明背景技术所述文献(Hutton A R J,Quinn H L,McCague P J,et al.Transdermal delivery ofvitamin K using dissolving microneedles for the prevention of vitamin Kdeficiency bleeding[J].International journal of pharmaceutics,2018,541(1-2):56-63)的结论恰好相反。
其次，申请人考察了不同湿度条件下，以Gantrez S-97为基质材料制得的螨变应原可溶性微针，其螨变应原的相对生物活性变化，结果见表1。
表1.不同湿度条件下螨变应原的相对生物活性比较(mean±SD，％)
基质材料
10％RH
20％RH
30％RH
40％RH
50％RH
Gantrez S-97
75.4±1.5
74.6±1.8
75.6±2.1
76.8±1.6
73.6±1.4
基质材料
60％RH
70％RH
80％RH
90％RH
Gantrez S-97
72.3±1.8
78.7±1.2
76.9±2.0
74.9±1.5
由表1可知：①基质材料选用Gantrez S-97，在不同湿度条件下对螨变应原的生物活性没有显著差异；②在90％RH时，螨变应原的相对生物活性为74.9％±1.5％，虽符合测试要求，但已临近于不合格的标准线。
综上可知，由于Gantrez S-97为脆性材料，选用何种韧性材料与其结合，作为复合基质材料载药螨变应原，在90％RH时提高微针的机械性能使其符合测试要求，但又能确保所开发的螨变应原可溶性微针，其螨变应原的相对生物活性又不低于50％，具有不确定性。且文献《用于构建可溶性微针的基质材料及其复合材料》(章捷,马凤森,占浩慧等,材料导报,2017,31(19):129-134.)也提示，微针不同的材料韧性与脆性之间的组合以及材料与药物的组合，会导致可溶性微针机械性能具有差异。需要进行探索性研究。
实施例4复合基质材料的种类对螨变应原可溶性微针机械性能和活性的影响
基于本实施例3的预实验研究，有必要对在不同湿度条件下复合基质材料的选择进行探索性研究，方能解决开发螨变应原可溶性微针的技术困惑。
亦因此，本发明通过设置梯度的湿度条件，考察10％RH～90％RH下螨变应原可溶性微针的力学强度和螨变应原的活性变化，来探究如表2所示的基质材料种类在不同湿度条件下对螨变应原可溶性微针的机械性能和活性的影响。
本实施例中，韧性材料的种类选择PVA、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酸(PAA)中的一种，与脆性材料Gantrez S-97结合形成复合基质材料。
本实施例涉及的螨变应原可溶性微针，其制备方法参照本发明的实施例1和实施例2；湿度条件及微针的机械性能和活性的测定方法，参照本发明的实施例3。
首先，申请人测定了不同湿度条件下，如表2所示的螨变应原可溶性微针的穿孔率，测定结果见图4。
表2.不同基质材料组分构成的微针处方
No.
复合基质材料(wt％)
螨变应原(wt％)
1
30％Gantrez S-97+30％PVP
40％
2
30％Gantrez S-97+30％PAA
40％
3
30％Gantrez S-97+30％PVA
40％
从表2、图4中可知：
①NO.3组(Gantrez S-97+PVP)随相对湿度的增大，微针的机械性能逐渐下降，从合格降至不合格，不符合测试要求；
②在10％RH～90％RH中的任一湿度条件下，NO.2组(Gantrez S-97+PAA)和NO.3组(Gantrez S-97+PVA)的穿孔率均大于80％，符合测试要求。
进一步的，对NO.2组和NO.3组测定螨变应原的活性，由于实施例3中已表明湿度条件的变化对螨变应原的相对生物活性无显著影响，故此处测定在90％RH时的螨变应原相对生物活性，测定结果见表3。
表3.聚合物种类对螨变应原生物活性的影响(mean±SD，n＝6)
No.
相对生物活性(％)
2
47.3±2.8
3
88.6±4.3
从表3可知：
①在90％RH时，NO.2组(Gantrez S-97+PAA)的相对生物活性小于50％，不符合测试要求；
②在90％RH时，NO.3组(Gantrez S-97+PVA)的相对生物活性大于50％，仍符合测试要求。
综上，综合考虑微针的机械性能和螨变应原的活性，选择Gantrez S-97与PVA的组合作为开发螨变应原可溶性微针的基质材料。
实施例5基质材料中各组分的含量比对螨变应原可溶性微针的机械性能和活性的影响
在实施例4的基础上，假定基质材料在针体中的质量占比为一定值，且基质材料的组分固定(Gantrez S-97与PVA的组合)，仅改变基质材料各组分的含量比，同理考察如表4所示的不同含量比的基质材料组分在10％RH～90％RH湿度条件下对螨变应原可溶性微针机械性能的影响，以及在90％RH时螨变应原活性的影响。
本实施例涉及的螨变应原可溶性微针，其制备方法参照本发明的实施例1和实施例2；湿度条件及微针的机械性能和活性的测定方法，参照本发明的实施例3。
首先，申请人测定了不同湿度条件下，如表4所示的螨变应原可溶性微针的穿孔率，测定结果见图5、图6和图7。
表4.不同含量比的基质材料组分构成的微针处方
No.
Gantrez S-97：PVA(w/w)
螨变应原(wt％)
1
1:3
40％
2
1:2.5
40％
3
1:2
40％
4
1:1.5
40％
5
1:1
40％
6
1.5:1
40％
7
2:1
40％
8
2.5:1
40％
9
3:1
40％
从表5、图5、图6和图7中可知：
①随着相对湿度的增大，全部9组的穿孔率都呈先上升后下降的趋势；
②仅NO.4组、NO.5组、NO.6组和NO.7组在任一湿度条件下，穿孔率均大于80％，符合测试要求。其中，NO.5组的穿孔率最大。
其次，申请人测定了在90％RH时，如表4所示的螨变应原可溶性微针的相对生物活性变化，测定结果见表5。
表5.不同含量比的基质材料组分对螨变应原活性的影响(mean±SD，n＝6)
No.
相对生物活性(％)
1
88.8±4.2
2
86.5±3.7
3
90.6±2.8
4
87.6±3.1
5
88.6±4.3
6
89.7±3.1
7
90.8±1.9
8
87.6±2.4
9
88.4±1.5
综上，综合考虑微针的机械性能和螨变应原的活性，选择含量比为(1:1.5)～(2:1)的Gantrez S-97与PVA的组合，作为开发螨变应原可溶性微针的复合基质材料。其中，最佳含量比为1:1。
实施例6药载比对螨变应原可溶性微针机械性能的影响
在实施例5的基础上，假定复合基质材料中各组分的含量比为一定值(Gantrez S-97与PVA的含量比＝1:1)，仅改变药载比(即螨变应原与复合基质材料的含量比)，考察如表6所示的不同药载比在10％RH～90％RH湿度条件下对螨变应原可溶性微针机械性能的影响。
本实施例涉及的螨变应原可溶性微针，其制备方法参照本发明的实施例1和实施例2；微针的机械性能的测定方法，参照本发明的实施例3。测试结果见图8。
表6.不同的药载比微针处方
从图8可知，NO.2组、NO.3组和NO.4组在任一湿度条件下的穿孔率均大于80％，符合测试要求，即药载比为(1:4)～(2:3)时，螨变应原可溶性微针机械性能达到要求。综合考虑载药量对螨变应原可溶性微针治疗效果的影响，选择NO.2组(即药载比为2:3)作为最佳处方。
综上所述，本发明提供的螨变应原可溶性微针中，针体的最佳处方为：螨变应原的质量占比40％，甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物的质量占比30％，聚乙烯醇的质量占比30％。
本发明提供的螨变应原可溶性微针中，针体的适宜处方为：螨变应原与复合基质材料的含量比为(1:4)～(2:3)，复合基质材料中甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物与聚乙烯醇的含量比为(1:1.5)～(2:1)。