阅读说明：本技术 K-ras基因突变位点检测试剂盒 (K-ras gene mutation site detection kit ) 是由 *** 于 2019-12-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及分子生物技术和基因检测领域,具体而言,涉及一种K-ras基因突变位点检测试剂盒,该试剂盒包括：a)引物对；b)上游探针、下游探针、发夹探针；以及c)两种纳米金探针。上述引物和探针能够实现在闭管条件下对K-ras基因的突变位点进行高灵敏、高分辨、低成本检测,能够有效的避免扩增产物的交叉污染。其中下游探针既可单独使用,也可互相配合在同一反应体系下进行多重检测,因而本试剂盒能够对最多七种K-ras基因突变位点同时进行检测,检测效率更高。(The invention relates to the field of molecular biotechnology and gene detection, in particular to a K-ras gene mutation site detection kit, which comprises: a) a primer pair; b) an upstream probe, a downstream probe, a hairpin probe; and c) two kinds of nano-gold probes. The primers and the probes can realize high-sensitivity, high-resolution and low-cost detection of the mutation sites of the K-ras gene under a closed tube condition, and can effectively avoid cross contamination of amplification products. The downstream probes can be used independently or matched with each other to carry out multiple detection in the same reaction system, so that the kit can simultaneously detect at most seven K-ras gene mutation sites, and has higher detection efficiency.)

K-ras基因突变位点检测试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物技术和基因检测领域，具体而言，涉及一种K-ras基因突变位点检测试剂盒。

背景技术

K-ras是EGFR信号通路下游的一种小分子G蛋白，突变后抑制了自身的GTP酶活性，使得K-ras蛋白总是处于活化状态，导致信号通路不受上游EGFR信号指令的调控。结直肠癌患者中K-ras基因的突变率约为40％，70％发生于第12位密码子，30％发生于13位密码子。K-ras基因突变状态与西妥昔单抗疗效相关，K-ras基因发生突变时西妥昔单抗治疗无效，因此，针对K-ras基因突变进行分子分型检测，针对其突变情况制定给药方案具有十分必要性。然而通常情况下，在实际临床样本中，突变基因通常混在大量野生型基因序列中，而由于两者之间的序列常常仅有一个碱基的差异，因此针对性的检测突变基因的难度很大。基于此，目前针对这类的基因位点检测多是基于特异性较高的分子检测方法完成，使用较多的技术平台是ARMS技术和NGS技术，这两种方法均能够检测低至1％左右的基因突变，但是由于试剂盒的成本较高(或者对操作者的要求较高)，给患者带来较大的经济负担。

发明内容

本发明通过纳米金探针与模板杂交与否会引起特征吸收波长发生规律性变化来实现突变位点的检测，由于不需要昂贵的机器，也不需要复杂的操作，是一种较现有方法更为快速简单经济的K-ras基因突变检测方法。

具体的，本发明涉及一种K-ras基因突变位点检测试剂盒，包括：

a)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；

b)SEQ ID NO：3所示的上游探针、SEQ ID NO：4～10所示的下游探针中的至少一条、SEQ ID NO：11所示的发夹探针；以及

c)两种纳米金探针，其各自包含SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示核酸片段。

上述引物和探针能够实现在闭管条件下对K-ras基因的突变位点进行高灵敏、高分辨、低成本检测，能够有效的避免扩增产物的交叉污染。其中下游探针既可单独使用，也可互相配合在同一反应体系下进行多重检测，因而本试剂盒能够对最多七种K-ras基因突变位点同时进行检测，检测效率更高。

根据本发明的再一方面，还涉及一种组合物，其由如上所述的K-ras基因突变位点检测试剂盒混合配制得到。

附图说明

为了更清楚地说明本发明

具体实施方式

或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明所提供试剂盒的使用原理示意图；

图2为本发明一个实施例中K-ras基因七种突变位点独立检测结果；

图3为本发明一个实施例中K-ras基因七种突变位点同管多重检测结果；

图4为本发明一个实施例中K-ras基因突变位点检测试剂在模板用量为3×10⁴拷贝下的灵敏度检测结果；

图5为本发明一个实施例中K-ras基因突变位点检测试剂在模板用量为3×10³拷贝下的灵敏度检测结果；

图6为本发明一个实施例中K-ras基因突变位点检测试剂在模板用量为3×10²拷贝下的灵敏度检测结果；

图7为本发明一个实施例中K-ras基因突变位点检测试剂中干扰物质的影响；

图8为本发明一个实施例中K-ras基因突变位点检测试剂的特异性验证；

图9为本发明一个实施例中K-ras基因突变位点检测试剂检测实际临床样本结果；

图10为本发明一个实施例中K-ras基因突变位点实际临床样本的实时荧光PCR检测结果。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

本发明涉及一种K-ras基因突变位点检测试剂盒，包括：

a)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；

b)SEQ ID NO：3所示的上游探针、SEQ ID NO：4～10所示的下游探针中的至少一条、SEQ ID NO：11所示的发夹探针；以及

c)两种纳米金探针，其各自包含SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示核酸片段。

本发明所提供的K-ras基因突变位点检测试剂盒可以实现一管检测最多七种K-ras基因上的热点突变，整个过程无需复杂操作即可完成判读，亦不需要复杂的检测设备和仪器。具体原理如下所述。首先利用一对共用引物对热点突变位点区域进行扩增，获得高浓度的靶序列扩增子。利用扩增子热点突变位点较为集中的特点，设计一条公用辅助探针及针对七种突变靶点特异性的七条检测探针，当靶序列存在时，探针与模板特异性结合，在内切酶的参与下，将信号分子切割，进而在与纳米金探针杂交后形成不同的信号差异。这种信号差异可以通过可见光差值进行判读，基于此实现一管内对K-ras基因一个或多个突变位点的快速检测。该方法相对于荧光PCR方法，具有更加灵敏简单快速低成本的特点，更易于推广使用。

显然，优选的，所述试剂盒包括SEQ ID NO：4～10所示的全部下游探针。

在一些实施方式中，所述纳米金探针中纳米金颗粒的平均粒径为1nm～200nm。

在一些实施方式中，所述纳米金探针中纳米金颗粒的平均粒径为5nm～80nm。

在一些实施方式中，所述纳米金探针中纳米金颗粒的平均粒径为10nm～30nm。

在一些实施方式中，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示核酸片段独立地通过连接片段与所述纳米金颗粒连接，且所述连接片段彼此不杂交，也不与a)和b)发生杂交。

在本发明中，“杂交”评定的标准是指核酸在严格条件下不发生杂交。对本领域技术人员而言，这种“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)和1mM EDTA的杂交液中于60℃杂交12～16小时，然后在65℃下用含0.1％SDS、和0.1％SSC的洗涤液洗涤15～60分钟。或者，两个核酸片段在如Sambrook等的分子克隆：实验手册(1989)(冷泉巷实验室出版，纽约，美国)的“大肠杆菌中克隆基因的表达”一节里所述的标准杂交条件下互相杂交。这样的条件如在45℃的6.0×SSC中杂交，然后在50℃的2×SSC中进行洗涤的步骤。为了选择严格性，可以例如在用于低严格性的50℃下的2.0×SSC和用于高严格性50℃下的2.0×SSC之间选择洗涤步骤中的盐浓度。另外，洗涤步骤中温度可在用于低严格性的约22℃的室温的用于高严格性的65℃之间变化。在一个具体的实施方式中，严格条件为在本申请的PCR反应条件。

在一些实施方式中，所述连接片段的长度为1nt～15nt，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14nt；优选3nt～5nt。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、DNA内切酶、dNTP、缓冲液或缓冲盐、可溶性镁盐、Tween-20以及水中的一种或多种。

如本文使用的术语“缓冲液”指水溶液或组合物，当酸或碱加入该溶液或组合物中时，所述水溶液或组合物抵抗pH中的变化。这种对pH变化的抗性是由于此类溶液的缓冲性质。因此，显示出缓冲活性的溶液或组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。缓冲液一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的能力。相反，它们一般能够维持在特定范围内的pH，例如pH 7～pH 9。一般地，缓冲液能够维持在其pKa上和下一个对数内的pH(参见例如，Mohan，Buffers，Aguide for the preparation and use of buffers in biological systems，CALBIOCHEM，1999)。缓冲液和缓冲溶液一般由缓冲盐或优选非离子缓冲液组分如TRIS和HEPES制备。可以在本发明的方法中使用的缓冲液优选选自磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)、2-氨基-2羟甲基-1,3-丙二醇(TRIS)缓冲液、TRIS缓冲盐水溶液(TBS)和TRIS/EDTA(TE)。缓冲盐溶于溶剂(通常是水)中后能够得到所述缓冲液。

在一些实施方式中，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。

在一些实施方式中，所述DNA内切酶选自TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN或MthFEN中的任一种。

在一些实施方式中，所述可溶性镁盐为MgCl₂。

在一些实施方式中，所述水通常没有核酸及核酸酶，例如双蒸水或去离子水。水为蒸馏水、去离子水、反渗水。

本发明还涉及一种组合物，其由如上所述的EGFR基因T790M位点检测试剂盒混合配制得到。

在一些实施方式中，所述组合物为溶液，其中a)中的引物的浓度独立地选自0.5μM～1.5μM，b)中探针的浓度独立地选自0.5μM～1.5μM，c)中纳米金探针的浓度独立地选自0.03μM～0.2μM，所述组合物中还含有靶核酸。

在一些实施方式中，所述组合物的pH为8～9，优选为8.5。

本发明还涉及一种检测K-ras基因突变位点的方法，其包括：

a)获取如上所述的组合物；

b)进行PCR反应，观测反应体系的颜色变化以判断K-ras基因突变位点突变情况。

所述方法可用于K-ras基因靶向药物的用药指导。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1 K-ras基因突变位点检测使用的引物探针

根据K-ras基因外显子12和13位密码子上的热点突变位点(如表1)序列设计特异性的引物和探针，检测结果特异性可由引物对、探针对共同决定，其设计原理如图1所示。

表1.常见K-ras基因热点突变类型

所述的K-ras基因突变位点检测试剂盒由引物、常规探针、纳米金探针、反应液和酶液构成，引物和探针序列如下所示。

上游引物：GTA CTG GTG GAG TAT TTG ATA GTG TAT TAA CCT TAT G(SEQ ID NO：1)；

下游引物：TGG TCC TGC ACC AGT AAT ATG CAT ATT AAA ACA AG(SEQ ID NO：2)；

上游探针：GGACACCGCATGGC(SEQ ID NO：3)；

下游探针1：CACCGCATGGCTCACCAGCTCCAACTAC(SEQ ID NO：4)；

下游探针2：CACCGCATGGCCCAACAGCTCCAACTAC(SEQ ID NO：5)；

下游探针3：CACCGCATGGCCCATCAGCTCCAACTAC(SEQ ID NO：6)；

下游探针4：CACCGCATGGCCCAGCAGCTCCAACTAC(SEQ ID NO：7)；

下游探针5：CACCGCATGGCCCACTAGCTCCAACTAC(SEQ ID NO：8)；

下游探针6：CACCGCATGGCCCACGAGCTCCAACTAC(SEQ ID NO：9)；

下游探针7：CACCGCATGGCCCACAAGCTCCAACTAC(SEQ ID NO：10)；

发夹探针：CGT GTT CAG CCA TG ATC CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGG AT GCCATG CGG TG TAC TTC TCT ATG CAG(SEQ ID NO：11)；

纳米金探针1：Au-AATT-CTG CAT AGA GAA GTA(SEQ ID NO：12)；

纳米金探针2：CAT GGC TGA ACA CG(SEQ ID NO：13)-TTAA-Au。

实施例2 K-ras基因七种突变位点独立检测结果验证

本实施例应用所述的K-ras基因突变位点检测试剂盒，分别采用一对引物、探针1、纳米金探针、反应液和酶液与探针2-探针8等组合，检测不同K-ras基因百分比突变含量的模板，用于验证单个独立检测体系的可行性。

该试剂盒反应液体积为20μL，其组分分别为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、1μM引物(上游引物、下游引物)、1μM探针(上游探针、下游探针1～7、发夹探针)、0.1μM纳米金探针(纳米金探针1、纳米金探针2)、0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶AfuFEN。分别向对应的检测体系中依次加入混合比例分别为50％、10％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0％的待测特定突变模板。同时做阴性(NC)和阳性(PC)质控，反应程序为：95℃，30s；95℃，20s，70℃，30s，32循环；62℃，15min；55℃，5min。反应结束后，结果示于图2中。图2的结果显示，针对探针2-探针8的检测反应，本发明试剂盒均可检测至少低至1％的混合百分比模板，其中探针2能够进一步检测低至0.1％的混合百分比模板，探针3和探针4能够检测低至0.2％的混合百分比模板，探针5、探针6、探针7能够检测低至0.5％的混合百分比模板。由此可知探针2-探针8均能达到较好的检出效果。

实施例3 K-ras基因七种突变位点同管检测结果验证

本实施例应用所述的K-ras基因突变位点检测试剂盒，采用一对引物、探针1、纳米金探针、反应液和酶液与探针2-探针8等组合，检测不同K-ras基因百分比突变含量的模板，用于验证在单个反应体系中检测多个突变位点的多重检测的可行性。

该试剂盒反应液体积为20μL，其组分分别为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、1μM引物(上游引物、下游引物)、1μM探针(上游探针、下游探针1～7、发夹探针)、0.1μM纳米金探针(纳米金探针1、纳米金探针2)、0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶AfuFEN。分别向对应的检测体系中依次加入混合比例分别为50％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0％的待测特定突变模板。同时做阴性(NC)和阳性(PC)质控，反应程序为：95℃，30s；95℃，20s，70℃，30s，32循环；62℃，15min；55℃，5min。反应结束后，结果示于图3中。图3的结果显示，针对多重检测反应，本发明试剂盒均可检测至少低至1％的混合百分比模板，其中探针2能够进一步检测低至0.2％的混合百分比模板，探针3、探针4、探针5、探针6能够检测低至0.5％的混合百分比模板。由此可知，多重检测体系与单重检测体系检测结果基本一致，均能达到较好的检出效果。

实施例4 K-ras基因突变位点检测试剂的灵敏度

本实施例应用所述的K-ras基因突变位点检测试剂盒，分别考察了不同百分比浓度的K-ras基因突变位点阳性参考品在不同核酸模板用量下的检出情况，用来验证本发明所述方法的优越性。

该试剂盒反应液体积为20μL，其组分分别为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、1μM引物(上游引物、下游引物)、1μM探针(上游探针、下游探针1～7、发夹探针)、0.1μM纳米金探针(纳米金探针1、纳米金探针2)、0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶AfuFEN。分别向对应的检测体系中依次加入混合比例分别为50％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0％的待测特定突变模板，且模板总用量分别为3×10⁴拷贝、3×10³拷贝、3×10²拷贝。同时做阴性(NC)和阳性(PC)质控，反应程序为：95℃，30s；95℃，20s，70℃，30s，32循环；62℃，15min；55℃，5min。反应结束后，结果示于图4、图5、图6及表2中。结果显示本发明试剂盒在模板总用量分别为3×10⁴拷贝、3×10³拷贝、3×10²拷贝下，能够检出K-ras基因不同突变位点混合百分比模板的最低百分比如表2所示。随着模板用量降低，本发明试剂盒检出K-ras基因不同突变位点混合百分比模板的最低百分比是逐渐降低的，这与理论值相符。在总模板用量分别为3×10⁴拷贝、3×10³拷贝、3×10²拷贝时加入反应体系的突变模板分子分别约为60拷贝、15拷贝、3拷贝，也即在突变模板分子仅为3拷贝时依然能够检测出阳性信号，显示本发明所述方法具有显著的优越性。

表2 K-ras基因突变位点检测试剂的灵敏度

实施例5 K-ras基因突变位点检测试剂的抗干扰性

本实施例应用所述的K-ras基因突变位点检测试剂盒，分别检测了加入不同干扰物质(血红蛋白、白蛋白、胆固醇、乙醇)的样本，用来验证本发明所述检测方法检测实际样本时干扰物质对结果的影响。

该试剂盒反应液体积为20μL，其组分分别为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、1μM引物(上游引物、下游引物)、1μM探针(上游探针、下游探针1～7、发夹探针)、0.1μM纳米金探针(纳米金探针1、纳米金探针2)、0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶AfuFEN。分别向对应的检测体系中依次加入混合比例分别为1％的待测特定突变模板，且模板总用量分别为3×10⁴拷贝，同时向检测体系中分别加入不同干扰物质(0.1mg/ml血红蛋白、0.01mmol/L白蛋白、0.2mmol/L胆固醇、0.1％乙醇)。同时做阴性(NC)和阳性(PC)质控，反应程序为：95℃，30s；95℃，20s，70℃，30s，32循环；62℃，15min；55℃，5min。反应结束后，结果示于图7中。图7的结果显示不同干扰物质(血红蛋白、白蛋白、胆固醇、乙醇)不会影响本发明试剂盒的检测结果。

实施例6 K-ras基因突变位点检测的特异性

本实施例应用所述的K-ras基因突变位点检测试剂盒，分别检测了不同来源的核酸样本，分别有人gDNA、L858R DNA(EGFR基因21号外显子突变质粒)、L747_P753>S(EGFR基因19号外显子一种缺失突变质粒)、E746_T751>I(EGFR基因19号外显子一种缺失突变质粒)、E746_T751del(EGFR基因19号外显子一种缺失突变质粒)，用来验证本发明所述的方法检测核酸样本时的特异性。

该试剂盒反应液体积为20μL，其组分分别为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、1μM引物(上游引物、下游引物)、1μM探针(上游探针、下游探针1～7、发夹探针)、0.1μM纳米金探针(纳米金探针1、纳米金探针2)、0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶AfuFEN。向体系中依次加入人gDNA、EGFR L858R DNA、EGFR L747_P753>S、K-ras c.183A>C、Braf V600E、E746_T751del及对照(PC和NC)模板。反应程序为：95℃，30s；95℃，20s，70℃，30s，32循环；62℃，15min；55℃，5min。反应结束后，结果示于图8中。图8的结果显示不同来源的核酸检测结果均为阴性，显示了本检测试剂盒良好的特异性。

实施例7 K-ras基因突变位点检测试剂检测实际临床样本

本实施例应用所述的K-ras基因突变位点检测试剂盒，分别检测了14例临床实际样本，用来评价本发明所述的检测方法检测实际样本的能力。

该试剂盒反应液体积为20μL，其组分分别为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、1μM引物(上游引物、下游引物)、1μM探针(上游探针、下游探针1～7、发夹探针)、0.1μM纳米金探针(纳米金探针1、纳米金探针2)、0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶AfuFEN。向体系中依次加入15例临床样本及对照(PC和NC)模板。反应程序为：95℃，30s；95℃，20s，70℃，30s，32循环；62℃，15min；55℃，5min。反应结束后，结果示于图9中(S1～S14分别代表不同的临床样本)。图9的结果与实时荧光PCR检测结果(图10)一致，均检出3例阳性，这显示本发明检测试剂盒能够正常的反映临床样本的检测结果。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州市宝创生物技术有限公司

<120> K-ras基因突变位点检测试剂盒

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

gtactggtgg agtatttgat agtgtattaa ccttatg 37

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

tggtcctgca ccagtaatat gcatattaaa acaag 35

<210> 3

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

ggacaccgca tggc 14

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

caccgcatgg ctcaccagct ccaactac 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

caccgcatgg cccaacagct ccaactac 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

caccgcatgg cccatcagct ccaactac 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

caccgcatgg cccagcagct ccaactac 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 8

caccgcatgg cccactagct ccaactac 28

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 9

caccgcatgg cccacgagct ccaactac 28

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 10

caccgcatgg cccacaagct ccaactac 28

<210> 11

<211> 66

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 11

cgtgttcagc catgatccgt ctcggttttc cgagacggat gccatgcggt gtacttctct 60

atgcag 66

<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 12

ctgcatagag aagta 15

<210> 13

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 13

catggctgaa cacg 14