阅读说明：本技术 数字pcr检测方法 (Digital PCR detection method ) 是由 盛广济 于 2018-08-16 设计创作，主要内容包括：本申请提供的数字PCR检测方法,在制备待测核酸扩增反应液时,可以使用基于染料即可实现基因分型、突变扫描、甲基化研究等,具有高分辨率与灵敏度,降低了检测成本。并且,可以使得微液滴阵列在同一个高度集成化的数字PCR检测仪上完成聚合酶链式反应,并在微液滴阵列PCR扩增后对PCR产物进行熔解曲线分析。同时,通过数字PCR检测方法,可以获得微液滴阵列的荧光曲线与熔解曲线,完全可以实现PCR扩增整个过程的实时监测与PCR产物的熔解曲线分析的无痕连接。从而,实现了基于不同荧光曲线的拷贝数识别,与不同特性熔解曲线的核酸扩增特性的识别,以及通过高分辨率熔解曲线实现基因的分型、突变扫描等,更加全面、简便、高效的完成数字PCR的检测。(The digital PCR detection method provided by the application can realize genotyping, mutation scanning, methylation research and the like by using a dye when preparing a nucleic acid amplification reaction solution to be detected, has high resolution and sensitivity, and reduces the detection cost. And the micro-droplet array can complete polymerase chain reaction on the same highly integrated digital PCR detector, and the melting curve analysis is carried out on the PCR product after the micro-droplet array is subjected to PCR amplification. Meanwhile, a fluorescence curve and a melting curve of the micro-droplet array can be obtained by a digital PCR detection method, and the traceless connection of the real-time monitoring of the whole PCR amplification process and the melting curve analysis of a PCR product can be completely realized. Therefore, the method realizes the copy number identification based on different fluorescence curves and the identification of nucleic acid amplification characteristics of different characteristic melting curves, realizes gene typing, mutation scanning and the like through a high-resolution melting curve, and completes the detection of the digital PCR more comprehensively, simply and efficiently.)

数字PCR检测方法

技术领域

本申请涉及数字PCR检测分析领域，特别是涉及一种数字PCR检测方法。

背景技术

近年来，数字PCR(Digital PCR，dPCR)技术迅速发展。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，是一种用于扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。数字PCR包括微滴式PCR检测方法和芯片式检测方法。芯片式检测方法中单个芯片上的有效反应腔数量一般只有数千个，远少于微滴式，芯片式数字PCR的动态范围相对于微滴式较窄。

微滴式数字PCR系统在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测。但是，在数字PCR检测分析过程中，对于成千上万个纳升级的微液滴阵列，传统的数字PCR检测方法如果想同时检测多种目标序列，则需要设计多种引物依次进行检测，不断反复的多次检测增大了工作量，且耗费时间工作效率低。

发明内容

基于此，有必要针对传统的数字PCR检测方法工作量繁重、耗费时间效率低的问题，提供一种简便、效率高的数字PCR检测方法。

本申请提供一种数字PCR检测方法，包括：

S10，制备待测核酸扩增反应液；

S20，将所述待测核酸扩增反应液微滴化，形成微液滴阵列；

S30，将所述微液滴阵列进行聚合酶链式反应，并获取所述微液滴阵列中每个微液滴的荧光曲线与每个微液滴的熔解曲线；以及

S40，根据所述微液滴阵列中每个微液滴的荧光曲线与每个微液滴的熔解曲线，对所述微液滴阵列进行分析，以获得所述待测核酸信息。

在其中一个实施例中，所述步骤S30包括：

S310，设置聚合酶链式反应的温度参数、时间参数以及循环次数；

S320，根据所述温度参数以及所述时间参数对所述微液滴阵列进行聚合酶链式反应，依次完成所述循环次数，并获取每次循环过程的每个所述微液滴的荧光曲线；以及

S330，将完成聚合酶链式反应扩增后的所述微液滴阵列降温，并以特定的温度间隔进行升温，获取每个所述微液滴的熔解曲线。

在其中一个实施例中，所述步骤S320包括：

S321，根据所述温度参数以及所述时间参数对所述微液滴阵列进行聚合酶链式反应，获取所述微液滴阵列的荧光图像；

S322，根据所述循环次数依次循环，获取所述微液滴阵列在聚合酶链式反应过程中的全部荧光图像；

S323，根据所述微液滴阵列的全部荧光图像，获取每次循环过程的每个所述微液滴的荧光信息；以及

S324，根据每次循环过程的每个所述微液滴的荧光信息，获取每个所述微液滴的荧光曲线，从而获得所述微液滴阵列的荧光曲线。

在其中一个实施例中，所述步骤S330包括：

S331，将完成聚合酶链式反应扩增后的所述微液滴阵列降温至40摄氏度以下；

S332，将降温至40摄氏度以下的所述微液滴阵列以特定的温度间隔进行升温，获取所述温度间隔对应的所述微液滴阵列的荧光图像；

S333，根据所述温度间隔对应的所述微液滴阵列的荧光图像，获取所述温度间隔对应的每个所述微液滴的荧光信息；以及

S334，根据所述温度间隔对应的每个所述微液滴的荧光信息，获取每个所述微液滴的熔解曲线，从而获得所述微液滴阵列的熔解曲线。

在其中一个实施例中，所述步骤S40包括：

S410，根据所述微液滴阵列的荧光曲线，获取所述微液滴阵列的核酸起始拷贝数；以及

S420，根据所述微液滴阵列的熔解曲线，获取所述微液滴阵列的核酸信息。

在其中一个实施例中，所述步骤S410包括：

S411，根据所述微液滴阵列的荧光曲线，获取每个所述微液滴的所述荧光曲线对应的Ct值；

S412，根据每个所述微液滴的所述荧光曲线的Ct值进行聚类，并依次由大到小进行排序，获得x₁，x₂，….x_n个类别；

S413，根据所述x₁，x₂，….x_n个类别，获得每个类别对应的所述微液滴的数量y₁、y₂、….y_n；

S414，根据每个类别对应的所述微液滴的数量y₁、y₂、….y_n，获得所述x₁，x₂，….x_n个类别对应的所述微液滴的数量y₁、y₂、….y_n频数分布；

S415，根据所述频数分布，计算所述微液滴阵列的核酸起始拷贝数。

在其中一个实施例中，在所述步骤S415中，当所述x₁类别的所述微液滴的数量y₁大于或等于特征值m时，根据所述频数分布进行泊松分布拟合，获得泊松分布的参数λ，从而获得所述微液滴阵列的核酸起始拷贝数。

在其中一个实施例中，在所述步骤S415中，当所述x₁类别的所述微液滴的数量y₁小于特征值m时，包括：

S4151，根据所述x₂，….x_n个类别对应的所述微液滴的数量y₂、….y_n的部分频数分布，依次假设所述x₂类别对应的所述核酸起始拷贝数，并进行泊松分布拟合，获取每个泊松分布对应的的参数λ_j(j＝0，1，2….)；

S4152，在一个区间[λ_min,λ_max]内搜索λ_j，使得频数值误差平方和err最小，获得最优λ_optimal；

S4153，根据所述最优λ_optimal，计算所述微液滴阵列的核酸起始拷贝数。

在其中一个实施例中，所述步骤S420包括：

S421，根据所述微液滴阵列的熔解曲线，获取每个所述微液滴的所述熔解曲线对应的熔解温度；以及

S422，根据所述熔解温度，对所述微液滴阵列进行分类，获取所述微液滴阵列的核酸信息，进而获得所述待测核酸的核酸信息。

在其中一个实施例中，所述数字PCR检测方法还包括：

S50，获取所述微液滴阵列的高分辨率熔解曲线，对所述微液滴阵列进行分类，并获得所述微液滴阵列的基因分型、突变检测等核酸信息。

本申请提供的所述数字PCR检测方法，在制备待测核酸扩增反应液时，可以使用一种染料即可实现基因分型、突变扫描、甲基化研究等，具有高分辨率与灵敏度，降低了检测的成本。并且，通过所述数字PCR检测方法，可以使得所述微液滴阵列在同一个高度集成化的数字PCR检测仪上完成聚合酶链式反应，并在所述微液滴阵列PCR扩增后对PCR产物进行熔解曲线分析。同时，通过所述数字PCR检测方法，可以获得所述微液滴阵列的荧光曲线与熔解曲线，完全可以实现PCR扩增整个过程的实时监测与PCR产物的熔解曲线分析的无痕连接。从而，通过所述微液滴阵列的荧光曲线与熔解曲线，实现了基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类，从而实现对所述微液滴阵列的定性以及定量分析，更加全面、简便、高效的完成数字PCR的检测。

附图说明

图1为本申请提供的数字PCR检测方法的整体步骤流程图；

图2为本申请提供的数字PCR检测方法获得的微液滴阵列示意图；

图3为本申请提供的数字PCR检测方法获得的微液滴阵列的荧光图像示意图；

图4为本申请提供的数字PCR检测方法获得的实时荧光曲线示意图；

图5为本申请提供的数字PCR检测方法获得的部分抽样的数字PCR定量检测方法与其他方法CPD的标准偏差进行对比图；

图6为本申请提供的数字PCR检测方法获得的熔解曲线示意图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

本申请提供一种数字PCR检测方法，包括：

S10，制备待测核酸扩增反应液；

S20，将所述待测核酸扩增反应液微滴化，形成微液滴阵列；

S30，将所述微液滴阵列进行聚合酶链式反应，并获取所述微液滴阵列中每个微液滴的荧光曲线与每个微液滴的熔解曲线；以及

S40，根据所述微液滴阵列中每个微液滴的荧光曲线与每个微液滴的熔解曲线，对所述微液滴阵列进行分析，以获得所述待测核酸信息。

在制备待测核酸扩增反应液时，可以使用一种饱和荧光染料即可实现对不同类型变异的分类，具有高分辨率与灵敏度，降低了数字PCR检测仪1检测的成本。并且，通过所述数字PCR检测方法，可以使得所述微液滴阵列在同一个高度集成化的数字PCR检测仪上完成聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，并在所述微液滴阵列PCR扩增后对PCR产物进行熔解曲线分析。在所述微液滴阵列进行聚合酶链式反应过程中，获取每个所述微液滴的荧光曲线。当所述微液滴阵列完成PCR扩增之后，再进行一次高低温循环，获取此次循环过程中的每个所述微液滴的熔解曲线。通过所述数字PCR检测方法，可以获得所述微液滴阵列的荧光曲线与所述微液滴阵列的熔解曲线，完全可以实现PCR扩增整个过程的实时监测与PCR产物的熔解曲线分析的无痕连接。从而，通过所述微液滴阵列的荧光曲线与熔解曲线，实现对所述微液滴阵列的定性以及定量分析，更加全面、简便、高效的完成数字PCR的检测。

在一个实施例中，在所述步骤S10中所述核酸扩增反应液中包含待检测的核酸模板、反应缓冲溶液、脱氧核糖核苷三磷酸、引物、聚合酶和产物标记物质等。耐热DNA聚合酶可以为FastStart Taq DNA聚合酶、Ex Taq、Z-Taq、AccuPrime Taq DNA聚合酶和HS TaqDNA聚合酶等。

其中，核酸扩增反应液，可以是以脱氧核糖核酸(DNA)为模板的核酸扩增反应液(可称为DNA扩增反应液)，也可以是互补脱氧核糖核酸(cDNA)即以核糖核酸(RNA)为模板的逆转录核酸扩增反应液(可称为RNA反转录反应液)，还可以是其它核酸扩增反应液，如环介导等温扩增(LAMP)反应液。其中，所述DNA扩增反应液的特点是含有DNA扩增所需要的dNTP、缓冲液、无机盐离子、聚合酶、引物、待检测的DNA模板以及染料等。反应液中的染料能指示核酸扩增，可以是SYBR Green等与DNA结合的荧光染料。

在一个实施例中，准备专供数字PCR使用的成套试剂和溶液，用来减少或避免外源DNA对模板DNA样本的潜在污染。所使用的所有仪器和耗材应该进行高温灭菌，高温干燥处理。

在一个实施例中，制备所述待测核酸扩增反应液时，采用SYBR Green荧光染料对所述待测核酸扩增反应液进行标记。由于SYBR Green荧光染料因能与所有的双链DNA相结合，对模板没有选择性，并且价格便宜，适用于多种目的产物的检测。采用熔解曲线分析时一般是用SYBR Green作为荧光染料的时候使用。因为SYBR Green染料是非特异的染料，只要有扩增，染料就与双链DNA结合，荧光大大增强。通过荧光信号的改变与温度作图，形成熔解曲线是为了观察扩增发出荧光的片段是不是数字PCR检测时需要检测的的目的基因。如果熔解曲线做出来只有单峰，出峰位置是你的退火温度，且为窄峰，那么产物是PCR扩增的特异性产物，如果峰位置不对或为宽峰，则可能是产物不是特异性或无设计对应产物，若在熔解曲线峰值之前存在小峰值，可能是引物二聚体，需要考虑重新设计引物等。如果高分辨率溶解曲线，有轻微的温度或曲线形状变化，说明有但核苷酸的变化，通过大量重复的微液滴阵列的溶解曲线分析，通过密集的曲线分析匹配程序，可以自动对核酸序列分型等。

请参见图2，在一个实施例中，在所述步骤S20中将所述待测核酸扩增反应液微滴化，形成微液滴阵列。所述微液滴阵列包括大量的多个微液滴。

在一个实施例中，一种数字PCR检测仪，所述数字PCR检测仪包括：微液滴阵列生成装置、温控装置、信号采集装置、定量分析装置以及控制器。所述微液滴阵列生成装置用以将核酸扩增反应液微滴化，形成所述微液滴阵列，进而在微液滴容器中形成微液滴阵列，可以同时检测出多种目标序列。所述温控装置用以进行温度循环，实现核酸扩增。所述信号采集装置与所述温控装置相对设置，用以对核酸扩增后的所述微液滴阵列进行信号采集。所述定量分析装置与所述信号采集装置通过数据线连接，用以实现所述微液滴阵列荧光信息的传输，进行定量分析。所述控制器分别与所述微液滴阵列生成装置、所述温控装置、信号采集装置以及定量分析装置连接，用以控制所述微液滴阵列生成装置、所述温控装置、信号采集装置以及定量分析装置。

所述数字PCR检测仪在工作时，所述微液滴阵列生成装置可以将所述待测核酸扩增反应液进行微滴化，从而形成所述微液滴阵列。所述微液滴阵列包括多个大量的微液滴。所述温控装置可以对所述微液滴阵列进行核酸扩增。所述信号采集装置实时采集所述微液滴阵列的荧光变化图像。所述温控装置对所述微液滴阵列进行核酸扩增反应，并通过所述信号采集装置采集核酸扩增反应后的所述微液滴阵列的产物信号，如荧光、紫外吸收、浊度等信号。利用所述多个扩增与非扩增微液滴在组成上的差异，对获得目标序列扩增的液滴数量进行分析，最终实现对核酸分子的定性以及定量分析。通过实时监测所述微液滴阵列的信号的变化，检测结果具有直接性，并可以解决所述微液滴阵列中的假阳性和假阴性的问题。

通过所述微液滴阵列生成装置在微液滴容器中生成所述微液滴阵列，并将落至微液滴容器的底部，不规则的堆积在一起。通过所述微液滴阵列生成装置制备的所述微液滴阵列在向下沉降过程当中，集中集合在微液滴容器的中间部位，聚集在一起，此时需要在对所述微液滴阵列进行信号采集之前，将多个所述微液滴阵列平铺在微液滴容器的底部。

在一个实施例中，在对多个所述微液滴阵列进行信号采集之前，通过所述温控装置20进行高低温，将多个所述微液滴阵列平铺在微液滴容器的底部。首先，将所述微液滴阵列升温。其次，将所述微液滴阵列降温。再次，将所述微液滴阵列进行高低温循环，直至所述微液滴阵列平铺于所述微液滴容器底板。最后，将所述微液滴阵列平铺于微液滴容器中，并将平铺后的所述微液滴阵列进行PCR扩增并进行拍照检测。

在一个实施例中，通过微液滴阵列生成装置可以生成多个体积大小均一的微液滴。每个所述微液滴大小在微米级。在多个所述微液滴体积均一的情况下，根据多个所述微液滴的荧光信息，对多个所述微液滴进行定量分析。

在一个实施例中，所述步骤S30包括：

S310，设置聚合酶链式反应的温度参数、时间参数以及循环次数；

S320，根据所述温度参数以及所述时间参数对所述微液滴阵列进行聚合酶链式反应，依次完成所述循环次数，并获取每次循环过程的每个所述微液滴的荧光曲线；以及

S330，将完成聚合酶链式反应扩增后的所述微液滴阵列降温，并以特定的温度间隔进行升温，获取每个所述微液滴的熔解曲线。

PCR由变性--退火(复性)--延伸三个基本反应步骤组成构成。模板DNA的变性是指模板DNA经加热至90℃～95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。模板DNA与引物的退火(复性)是指模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50～60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。引物的延伸是指DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70～75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

其中，退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。

在所述步骤S310中，所述微液滴阵列在引物、待检测DNA样本和耐热DNA聚合酶存在下，通过使变性、退火和延伸步骤的循环重复大约30次～50次来进行PCR。所述循环次数一般设置为30次～50次的变性、退火和延伸三步过程循环。所述温度参数一般设置为40℃～95℃，所述时间参数根据每一个具体过程而定。

在一个实施例中，所述步骤S320包括：

S321，根据所述温度参数以及所述时间参数对所述微液滴阵列进行聚合酶链式反应，获取所述微液滴阵列的荧光图像；

S322，根据所述循环次数依次循环，获取所述微液滴阵列在聚合酶链式反应过程中的全部荧光图像；

S323，根据所述微液滴阵列的全部荧光图像，获取每次循环过程的每个所述微液滴的荧光信息；以及

S324，根据每次循环过程的每个所述微液滴的荧光信息，获取每个所述微液滴的荧光曲线，从而获得所述微液滴阵列的荧光曲线。

在所述步骤S321中，所述步骤S321包括：

首先，将所述微液滴阵列加热至95℃，并加热4min，用以将所述微液滴阵列中的酶进行热启动，所述微液滴阵列完成酶热启动之后，对所述微液滴阵列进行变性1min；

其次，所述微液滴阵列变性之后，降温至55℃，引物与DNA模板结合，形成局部双链，退火(复性)1min，此时通过所述信号采集装置30对所述微液滴阵列进行拍照，获得第一次循环的所述微液滴阵列的荧光图像；

再次，将所述微液滴阵列进行升温至70℃，延伸7min；

最后，根据所述循环次数依次按照上述变性-退火(复性)-延伸三步骤进行循环45次，循环45次之后，降温至4℃，对所述多个微液进行保存。

在一个实施例中，通过所述温控装置20对所述微液滴阵列进行升温降温，所述循环次数设置为45次，进而每个微液滴可以获取45次循环过程中的45张荧光图像。每个所述微液滴进行了45次循环，共获得45张荧光图像。通过对45张荧光图像中每个所述微液滴进行定位，并获取每个所述微液滴的45个荧光强度值，从而获取每个所述微液滴的荧光曲线。

在一个实施例中，在所述步骤S323中，首先，根据每个荧光图像，获得每个进行PCR扩增的所述微液滴的荧光强度值。然后，根据所述每个进行PCR扩增的微液滴的荧光强度值，获得每个进行PCR扩增的微液滴的荧光曲线。最后，根据所述每个进行PCR扩增的微液滴的荧光曲线，获得所述所有进行PCR扩增的微液滴的荧光曲线，也就是所述微液滴阵列的荧光曲线。

请参见图3，在一个实施例中，采集所述微液滴阵列的荧光图像，并进行图像追踪。在获取每个所述微液滴阵列的荧光曲线时，需要对每张图像中的每个所述微液滴分别进行定位，获取每个所述微液滴的荧光强度。在所述数字PCR检测仪中，会在成像系统中标定，所述荧光图像的每一个像素对应的实际的比例是多少。根据所述荧光图像，提取出所述微液滴的直径对应的是多少个像素，从而得到直径对应多少个微米，也就可以获得所述微液滴的直径是多少根据之前。

在一个实施例中，对每个所述微液滴进行追踪时，还可以通过在每个温度循环过程中采集的图像，进行NCAST图像差分及聚类运算，识别到每个所述微液滴的位置，进而获取所述微液滴阵列的荧光强度。

在一个实施例中，如果在一个温度循环过程中造成的微液滴移动距离不大于一个微液滴的直径，可以采用以下方法进行微液滴追踪。其中，对每个所述微液滴进行追踪时，对每个所述微液滴进行图像追踪步骤如下：

首先，识别每次温度循环过程中拍摄的照片，获得每个微液滴的圆心位置；

然后，将当前识别的每个微液滴的圆心位置与前一次循环过程中的每个微液滴的圆心位置对比；

最后，若当前识别的每个微液滴的圆心位置与前一次循环过程中的每个微液滴的圆心位置的圆心间距小于一个微液滴直径，则标记为同一个微液滴。

请参见图4，在一个实施例中，根据每个温度循环过程中每个所述微液滴的荧光强度值，获取所述每个微液滴的荧光曲线。通过对每次温度循环过程中每个所述微液滴的各个部位的荧光强度值求和，作为每个所述微液滴的某一特定时刻的荧光强度值。

在一个实施例中，为了防止相邻的每个所述微液滴的边缘部位的互相影响，每个所述微液滴的某一特定时刻的荧光强度值采用部分求和方式。通过每次温度循环过程中所述微液滴阵列的荧光强度值，可以获得所述微液滴阵列在全部循环过程中的变化情况，获取每个所述微液滴的荧光曲线。

在一个实施例中，所述步骤S330包括：

S331，将完成聚合酶链式反应扩增后的所述微液滴阵列降温至40摄氏度以下；

S332，将降温至40摄氏度以下的所述微液滴阵列以特定的温度间隔进行升温，获取所述温度间隔对应的所述微液滴阵列的荧光图像；

S333，根据所述温度间隔对应的所述微液滴阵列的荧光图像，获取所述温度间隔对应的每个所述微液滴的荧光信息；以及

S334，根据所述温度间隔对应的每个所述微液滴的荧光信息，获取每个所述微液滴的熔解曲线，从而获得所述微液滴阵列的熔解曲线。

PCR扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生熔解曲线。由于不同的DNA有不同的温度熔解线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又恢复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变与温度作图。在扩增产物染料法需要做熔解曲线，因为熔解曲线是由于染料法的特异性差，所以通过熔解曲线考察扩增产物是否是目标产物。熔解温度上有一特征峰，用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区或非特异性产物分开。

在所述步骤S332中，将PCR扩增后对PCR产物进行熔解曲线分析，使得PCR扩增与PCR产物的熔解曲线分析无痕连接。在所述步骤S332中，通过所述温控装置将温度降至40摄氏度以下，并以所述温度间隔为0.1℃进行依次升温至95℃，每间隔0.1℃通过所述信号采集装置30进行拍照一次直至升温至95℃。然后，拍照结束后，将所述微液滴阵列降温至4℃，对所述微液滴阵列进行保存。

在一个实施例中，获取每个所述微液滴的荧光曲线时处理荧光图像的方法与获得每个所述微液滴的熔解曲线时处理荧光图像的方法相同。

在所述步骤S333中，根据每间隔0.1℃采集获得的荧光图像，获取每个所述微液滴对应的荧光强度，绘制关于温度与荧光强度的曲线，并一次微分获得含有波峰的峰性图。

熔解曲线(Dissociation curve)是指随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。熔解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。总的DNA双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度(Tm)，不同序列的DNA，Tm值不同。也就是说一个DNA的熔解曲线是一个DNA的指纹，对应特定的一个DNA。根据熔解曲线图，其波峰所在的温度代表双链DNA分子的Tm值(熔点温度)。根据扩增产物的Tm值即可判断其基因型。DNA片段的Tm依赖于它的长度、G+C组成、序列、链互补性、浓度和缓冲区成分，诸如盐、染料和PCR增强剂。

每一条熔解曲线代表着每个所述微液滴里产物的单一情况，若一条熔解曲线为单峰且在一定合理的温度范围内(一般为80～90℃)则认为正常，如果熔解曲线为双峰则可能有非特异性扩增。由此可以判断产物是否为目的基因且是否单一。内参有内参的线，同一条熔解曲线不会出现两个基因的峰。

对于所述微液滴阵列的每一条高分辨率熔解曲线分析，可以检测单核苷酸多态性及扫描突变。

在一个实施例中，在数字PCR检测过程中，通过所述信号采集装置对所述微液滴阵列进行图像采集。

通过所述信号采集装置，对所述微液滴阵列进行图像采集。其中，从微液滴容器上方采取倾斜角度照射在微液滴容器上。采用所述信号采集装置实现对所述微液滴阵列进行周期性的二维扫描，并实时进行图像采集。微液滴容器内的所述微液滴阵列的内部荧光被激发，通过所述信号采集装置的物镜收集，进入相机，相机采集所述微液滴阵列的荧光图像。

通过所述信号采集装置可以使得所述微液滴阵列荧光成像，一次拍摄一定数量的所述微液滴的荧光图像，然后利用图像处理技术，将图像中的液滴荧光进行自动识别，从而得到液滴的荧光信息。

通过所述荧光信号检测装置的荧光探测组件对含有荧光物质的所述微液滴阵列进行荧光信息采集，并将检测到的荧光信息以荧光图像的形式传输至计算机，用以进行定量分析。采用荧光成像的检测方法一次拍摄一定数量的所述微液滴的荧光图像，然后利用图像处理技术，将图像中的液滴荧光进行自动识别，从而得到液滴的荧光信息。由于所述荧光成像的检测方法的成像范围大，因此，在检测的时候对所述微液滴阵列所处的检测环境的要求较低。

在一个实施例中，所述步骤S40包括：

S410，根据所述微液滴阵列的荧光曲线，获取所述微液滴阵列的核酸起始拷贝数；以及

S420，根据所述微液滴阵列的熔解曲线，获取所述微液滴阵列的核酸信息。

在一个实施例中，所述步骤S410包括：

S411，根据所述微液滴阵列的荧光曲线，获取每个所述微液滴的所述荧光曲线对应的Ct值；

S412，根据每个所述微液滴的所述荧光曲线的Ct值进行聚类，并依次由大到小进行排序，获得x₁，x₂，…，x_n个类别；

S413，根据所述x₁，x₂，….x_n个类别，获得每个类别对应的所述微液滴的数量y₁、y₂、….y_n；

S414，根据每个类别对应的所述微液滴的数量y₁、y₂、….y_n，获得所述x₁，x₂，…，x_n个类别对应的所述微液滴的数量y₁、y₂、….y_n频数分布；

S415，根据所述频数分布，计算所述微液滴阵列的核酸起始拷贝数。

在所述步骤S411中，PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期(对数期)，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一DNA模板不同时间扩增或同一时间不同微液滴容器内扩增，得到的Ct值是恒定的。当所述微液滴对应的荧光曲线为扩增曲线时，此时表明所述微液滴中含有目标基因成分。当所述微液滴对应的荧光曲线为一条直线时，此时表明所述微液滴中不含目标基因成分。

从获取的实时荧光曲线，可以获得Ct值，每个所述微液滴的Ct值在获取时，对所述荧光曲线进行求导，所述荧光曲线的斜率固定的荧光曲线的起始循环次数即为所需要的Ct值。

在一个实施例中，在所述步骤S411中，首先，对每个进行PCR扩增的微液滴的荧光曲线求导，获取所述每个进行PCR扩增的微液滴的荧光曲线的斜率。其次，根据所述每个进行PCR扩增的微液滴的荧光曲线的斜率，获取所述每个进行PCR扩增的微液滴的荧光曲线的斜率中斜率固定不变的数值。再次，根据所述斜率固定不变的数值，获取其对应的起始循环数，所述起始循环数为每个进行PCR扩增的微液滴的Ct值。最后，根据所述每个进行PCR扩增的微液滴的Ct值，获得所述所有进行PCR扩增的微液滴的Ct值。

在一个实施例中，在所述步骤S411中，首先，根据每个进行PCR扩增的微液滴的荧光曲线，获得每个进行PCR扩增的微液滴的荧光域值的缺损值。其次，根据每个进行PCR扩增的微液滴的荧光域值的缺损值，获得其对应的循环数，所述循环数为每个进行PCR扩增的微液滴的Ct值。再次，根据所述每个进行PCR扩增的微液滴的Ct值，获得所述所有进行PCR扩增的微液滴的Ct值。

其中，Ct值中C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。在实时荧光PCR中，Ct值是指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺损设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold＝10×SDcycle 3-15。

在一个实施例中，PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺损设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold＝10×SDcycle 3-15。根据所述荧光域值的缺损值threshold，获取相对应的循环数，所述循环数为所述Ct值。Ct值与起始DNA浓度的关系为：起始拷贝数越多，Ct值越小。

在所述步骤S412中根据每个所述微液滴的所述荧光曲线的Ct值进行聚类，并依次由大到小进行排序，获得，x₂，…，x_n个类别。其中，所述微液滴阵列中暗液滴对应的类别为x₁，也就是说所述微液滴阵列中不含核酸起始拷贝数的液滴对应的类别为x₁类别。由于核酸起始拷贝数越多，Ct值越小，所以此时暗液滴(阴性液滴)对应的Ct值为无穷大，也就是所述x₁类别对应的Ct值为无穷大。以此类推，所述x₂类别对应的核酸起始拷贝数为1，所述x₃类别对应的核酸起始拷贝数为2，所述x₄类别对应的核酸起始拷贝数为3，所述x₅类别对应的核酸起始拷贝数为4等。

在一个实施例中，在所述步骤S415中，当所述x₁类别的所述微液滴的数量y₁大于或等于特征值m时，根据所述频数分布进行泊松分布拟合，获得泊松分布的参数λ，从而获得所述微液滴阵列的核酸起始拷贝数。

其中，所述特征值m范围为所述微液滴阵列中所述微液滴总数的0.5％-10％。

在一个实施例中，所述特征值m可以为所述微液滴总数的5％。

当所述x₁类别的所述微液滴的数量y₁大于或等于特征值m时，此时所述微液滴阵列中暗液滴的数量y₁大于或等于特征值m。此时，所述微液滴阵列中暗液滴的数量对整体计算所述微液滴阵列的核酸起始拷贝数起到一定的作用，从而对所述微液滴的数量y₁、y₂、….y_n频数分布进行泊松分布拟合，获得对应的泊松分布的参数λ。

假设：数字PCR中的微液滴含有的起始DNA拷贝数为x，根据数理统计理论，x＝k(k＝0，1，2，3.....)的概率分布函数P符合泊松概率模型，其中λ为微液滴中含有的平均分子拷贝数。

因此，通过所述泊松分布模型期望值μ与方差σ²，可知期望值μ为λ，方差σ²为λ。因此，可知数字PCR中每个微液滴中包含目标DNA分子的拷贝数为λ，所以求得的λ值就能够实现核酸的定量检测。

其中，对于液滴式PCR，单个液滴中所包含的起始拷贝数满足Poisson分布。

其中λ为所述微液滴中平均包含的起始DNA拷贝数。每个液滴中包含的平均起始拷贝数用CPD(copies per droplet)来表示。

此时，所述微液滴阵列的核酸起始拷贝数为λ乘以所述微液滴阵列的所述微液滴的数量。

假设所述待测核酸扩增反应液的总体积为V(每个微液滴的体积为v)，则所述待测核酸扩增反应液浓度c(copy/μL)为：

所以，求得λ的值，也就能实现DNA的定量检测。

在一个实施例中，在所述步骤S415中，当所述x₁类别的所述微液滴的数量y₁小于特征值m时，包括：

S4151，根据所述x₂，…，x_n个类别对应的所述微液滴的数量y₂、…，y_n的部分频数分布，依次假设所述x₂类别对应的所述核酸起始拷贝数，并进行泊松分布拟合，获取每个泊松分布对应的的参数λ_j(j＝0，1，2….)；

S4152，在一个区间[λ_min,λ_max]内搜索λ_j，使得频数值误差平方和err最小，获得最优λ_optimal；

S4153，根据所述最优λ_optimal，计算所述微液滴阵列的核酸起始拷贝数。

当所述x₁类别的所述微液滴的数量y₁小于特征值m时，此时所述微液滴阵列中暗液滴的数量对整体计算所述微液滴阵列的核酸起始拷贝数没有作用，可以忽略。

Biorad系统在20000个液滴体系的情况下，一般建议样本DNA浓度不大于6CPD。在实际实验过程中，k>4时，Ct值的区分变小，很难根据Ct值区分一个液滴的起始拷贝数为4或者5，因此可以只使用所述x₂，…，x_n个类别进行不完整抽样来对Poisson分布进行拟合。

在一个实施例中，给定一个区间[λ_min,λ_max]，在[λ_min,λ_max]区间中搜索，计算误差的平方和err最小，选择最优λ_optimal使得误差平方和最小。

在一个实施例中，获得泊松分布的参数λ时，采用最大似然估计方法对参数λ进行估计。

在一个实施例中，对参数λ进行估计的方法还可以为矩估计法、顺序统计量法或最大似然法。

采用此方法无需保证阴性暗液滴的数量，且比单独采用一个频点进行估计的精度和稳定性高得多。

在所述步骤S4153中，所述微液滴阵列的核酸起始拷贝数为所述最优λ_optimal乘以所述微液滴阵列的所述微液滴的数量。

在一个实施例中，根据不完全抽样，采用最小二乘法对泊松分布的参数λ进行点估计。

在实际过程中，所述数字PCR定量检测方法，不依赖于标准曲线而能够高精度地测定所述微液滴阵列的核酸起始拷贝数。

同时，通过实时荧光曲线可以解决所述微液滴阵列中存在假阳性的问题。通过对所述微液滴阵列的荧光曲线进行处理，并进行不依赖于均匀性假设进行的统计修正，而取得真正的绝对定量。

采用所述数字PCR定量检测方法不仅摆脱了对标准荧光曲线的依赖，排除了由标准荧光曲线引起的定量结果不确定的问题，并且解决了液滴式数字PCR终点检测方式的限制，打破了只采用了一个p(x＝0)的数据对待测样本整体进行参数估计的局限性，提高了数字PCR定量检测的准确性。

采用所述数字PCR定量检测方法无需保证阴性空液滴的数量。同时，采用多维度的频数分布数据对整体进行最优参数估计的精度要比单独采用一个p(x＝0)的数据进行估计的精度和稳定性高得多。

每一个荧光曲线代表一个有用信息的曲线的变化过程，参加了液滴样本信息，以实现实时监测，以设定算法消除相邻液滴之间的相互影响。

所述数字PCR检测方法依赖抽象的数学模型，实现了重复性、高灵敏性，并且动态范围变大，可以利用少量液滴实现监测。用小量的数据覆盖更多的信息。同时，所述数字PCR定量检测方法避免了之前泊松分布概率模型的误差，实现绝对定量，更加直观。并且，通过所述数字PCR定量检测方法可以结合所有数据，从而可以避免随机误差的产生。获取液滴样本荧光曲线，实时监测液滴样本的荧光亮度的变化，用以去除假阳性，消除相邻液滴之间的相互影响，为后续定量分析模型提供更精确的数据源。

请参见图5，根据部分核酸起始拷贝数分别为0，1，2，3情况下获得的泊松分布拟合。其中，横坐标为每个所述微液滴中包含的平均起始拷贝数(copies per droplet，CPD)。纵坐标为每个所述微液滴中包含的平均起始拷贝数的标准偏差(standard deviation，StdDev，STD)。每个所述微液滴中包含的平均起始拷贝数用CPD(copies per droplet)来表示。可知，采用部分所述核酸起始拷贝数获得的每个所述微液滴中包含的平均起始拷贝数用CPD的标准偏差比其他算法获得的平均起始拷贝数用CPD的标准偏差小。因此，所述数字PCR检测方法获得的每个所述微液滴中包含的平均起始拷贝数用CPD的值更加精确。对20000个液滴进行1000次仿真的结果表明。仅采用单点的估计方法只能覆盖有限的浓度范围，并且估计精度随着样品浓度的升高而急剧恶化。而采用不完全泊松分布拟合算法，随着样品浓度的增加，估计精度没有明显的恶化，并且能够将待测核酸扩增反应液的浓度扩大两倍。对于液滴数量较少的情况下，不完全泊松分布拟合算法(部分抽样泊松分布拟合算法)仍然具有很好的可靠性。

通过所述数字PCR定量检测方法解决了结果的假阳性和假阴性。测序平台的样本高通量性，可同时进行上百例样本的检测。同时能利用不同种类的荧光，进行多个位点的检测，加速检测的速度，降低了实验成本。采用数字PCR检测仪通过微滴化处理，使得稀有检测片段从大量的复杂背景中分离出来，大大简化操作步骤，有效节约了准备时间和检测时间，且结果判读直观可靠，具有可以稳定实施的特点，检测灵敏度及精确性都达到精准定量的要求，提高了检测的灵敏度和精确性。

在一个实施例中，所述步骤S420包括：

S421，根据所述微液滴阵列的熔解曲线，获取每个所述微液滴的所述熔解曲线对应的熔解温度；以及

S422，根据所述熔解温度，对所述微液滴阵列进行分类，获取所述微液滴阵列的核酸信息，进而获得所述待测核酸的核酸信息。

不同序列的DNA，Tm值不同。也就是说一个DNA的熔解曲线是一个DNA的指纹，对应特定的一个DNA。根据熔解曲线图，其波峰所在的温度代表双链DNA分子的Tm值(熔点温度)。根据扩增产物的Tm值即可判断其基因型。通过将相同的熔解曲线进行归类划分，不同形状熔解曲线的基因分型或归类，并与目标基因的熔解曲线进行对比，可以去除非特异性假阳性，排除与目标基因不同的序列。

在一个实施例中，通过熔解曲线对所述微液滴阵列进行分类时，可以采用决策树、贝叶斯、人工神经网络、K-近邻、支持向量机和基于关联规则的分类、Bagging以及Boosting等算法。

在一个实施例中，所述数字PCR检测方法还包括：

S50，获取所述微液滴阵列的高分辨率熔解曲线，对所述微液滴阵列进行分类，并获得所述微液滴阵列的基因分型、突变检测等核酸信息。

根据所述熔解曲线，可以获取所述微液滴阵列的核酸扩增的特异性，以及核酸扩层过程中是否有引物二聚体现象等。

根据所述微液滴阵列的实时检测dsDNA熔解过程中荧光信号值的变化，获取所述微液滴阵列的高分辨率熔解曲线。高分辨率熔解曲线是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限，实现了真正的闭管操作。在突变扫描、单核苷酸多态性分析、甲基化研究、基因分型、序列匹配等方面HRM分析技术发挥着重要作用。双链核苷酸的热稳定性受其长度和碱基组成的影响，序列变化会导致升温过程中dsDNA解链行为的改变。因为所用的荧光染料只能嵌入并结合到dsDNA上，因此利用实时PCR技术，通过实时检测dsDNA熔解过程中荧光信号值的变化，就能以生成不同形状熔解曲线的方式将PCR产物中存在的差异直观地展示出来。同时，借助于专业性的分析软件就可以对测试群体实现基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类。

在一个实施例中，在所述步骤S20中形成所述微液滴阵列时，可以采用瞬时加速的微液滴生成方法或变速周期的微液滴生成方法。

在一个实施例中，在所述步骤S10中所述待测核酸扩增反应液中采用饱和染料对聚合酶链式反应产物进行分析。

在一个实施例中，对多个所述微液滴进行定性分类分析时，也可以采用高分辨率熔解曲线分析(high resolution melting analysis，HRM)无需使用序列特异性探针，而是利用一种饱和染料对PCR反应产物进行分析。双链核苷酸(double strand DNA，dsDNA)的热稳定性受其长度和碱基组成的影响，序列变化会导致升温过程中dsDNA解链行为的改变。因为所用的荧光染料只能嵌入并结合到dsDNA上，因此利用实时PCR技术，通过实时检测dsDNA熔解过程中荧光信号值的变化，就能以生成不同形状熔解曲线的方式将PCR产物中存在的差异直观地展示出来。同时，借助于专业性的分析软件就可以对测试群体实现基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类。

在一个实施例中，引物设计有三条基本原则。首先，引物与模板的序列要紧密互补。其次，引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。再次，引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。具体实现这三条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度、产物长度、序列Tm值、引物与模板形成双链的内部稳定性、形成引物二聚体以及发夹结构的能值、在错配位点的引发效率，引物及产物的GC含量等等。同时，针对特殊的检测也可以对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点、引进突变等。

引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)+2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法。

请参见图6，在一个实施例中，通过所述数字PCR检测方法获得的所述微液滴阵列的熔解曲线图，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，其波峰所在的温度代表双链DNA分子的Tm值(熔点温度)。根据扩增产物的Tm值即可判断其基因型。由此可以看出，存在两个熔解温度Tm1以及Tm2。熔解温度Tm1与熔解温度Tm2分别对应着两种不同类别的DNA由此可以将所述微液滴阵列中的目标DNA区分出来。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。