基于径迹蚀刻膜的数字环介导等温扩增检测方法及应用
阅读说明：本技术 基于径迹蚀刻膜的数字环介导等温扩增检测方法及应用 (Digital loop-mediated isothermal amplification detection method based on track etching membrane and application ) 是由 林星宇 罗自生 李莉 蒋艳 于 2019-11-01 设计创作，主要内容包括：本发明为基于径迹蚀刻膜的数字环介导等温扩增检测方法及应用,涉及分子生物学技术领域,公开了一种基于径迹蚀刻膜的数字环介导等温扩增方法,利用径迹蚀刻膜内小孔作为相互隔离的纳米反应器,将单个细菌均匀分散至膜的每个孔中进行LAMP扩增,产生荧光,用ImageJ软件对等温扩增后的膜系统荧光拍照计数,定量计算出膜系统中待测物的核酸原始浓度,从而实现细菌的绝对定量分析。本发明的扩增方法不需要复杂的微流控装置及芯片等成本较高的设备即可完成对细菌核酸的数字分析,具有简易的实验步骤,快速高效,操作简单,成本低廉的特点,对目标细菌没有依赖性,只要进行配套的引物设计即可开展目标细菌的数字检测,成本低廉,为基因研究提供了一种价格低廉,操作灵活简洁的数字核酸检测技术。(The invention discloses a digital loop-mediated isothermal amplification detection method based on a track etching membrane and application thereof, relates to the technical field of molecular biology, and discloses a digital loop-mediated isothermal amplification method based on a track etching membrane. The amplification method can complete the digital analysis of the bacterial nucleic acid without complex microfluidic devices, chips and other devices with higher cost, has the characteristics of simple experimental steps, rapidness, high efficiency, simple operation and low cost, has no dependence on target bacteria, can carry out the digital detection of the target bacteria by only carrying out matched primer design, has low cost, and provides a digital nucleic acid detection technology with low price and flexible and simple operation for gene research.)
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种基于径迹蚀刻膜的数字环介导等温扩增检测方法及应用。
背景技术
传统的致病菌检测通常需要数天的时间进行细菌/病毒培养，实现定量测定。近年来，核酸扩增技术如聚合酶链式反应(PCR)，能够高灵敏度地测定极少量的核酸。然而，它们需要实时荧光定量热循环仪对样品进行扩增和在线荧光检测，这大大限制了其在户外检测中的应用。
更重要的是，传统PCR法难以进行细菌数目的绝对定量分析。近年来，数字核酸检测技术发展迅速，该技术通过将单个细菌(或单个细菌核酸分子)分隔在单个隔室中并进行独立的PCR扩增反应以鉴定目标细菌 (或核酸)的绝对准确浓度。更高的特异性和准确度，更好的变异分析能力以及终点检测和绝对定量等性能使数字PCR(dPCR)技术在各种检测中得以扩展。
环介导等温扩增法(LAMP)是由Notomi在2001年建立的一种新型体外核酸扩增检测技术。它使用4-6条引物去鉴定6-8段特异性的核酸片段。DNA聚合酶具有链置换功能，在它的帮助下，目的基因可以在很短的时间内，恒温的条件下，得到高效、特异的扩增。与此同时，反应析出大量的白色焦磷酸镁沉淀，利用这个特点，实验人员可以通过观察反应体系的浑浊程度或者荧光强度来判断结果是阴性还是阳性。由于 LAMP反应是在恒温条件下进行的，所以一个稳定的热源(例如水浴或者金属浴)就能满足实验条件的要求，与此同时，实验的仪器费用也大大降低了。由于上述LAMP的诸多优点，它已经在微生物检测，例如细菌，真菌，病毒以及基因疾病检测，婴儿早期性别诊断等方面得到了普遍的应用。
CN105463135A中公开了一种快速检测非洲猪瘟病毒环介导等温扩增的方法，采用Primer Explorer V4针对非洲猪瘟K205R基因序列设计和筛选LAMP引物，在恒温水浴锅内进行LAMP反应，结束后在LAMP反应管内加入稀释后的染料，紫外灯下测试，如有荧光则为阳性，反之无荧光为阴性。该检测方法特异性极高，快速高效，不需要复杂的变温条件及设定不同的反应程序，成本低廉，操作简便。但是该非数字化检测方法只能作为一种简单的判定手段，无法进行准确定量检测。
现有的基于微流控芯片阵列反应室的dPCR技术的设计和使用成本相对较高，可扩展性有限，更重要的是微流控装置加工过程过于繁琐，而且价格昂贵，难以一次性使用。因此，迫切需要开展具有技术稳定，操作简单灵活，成本低廉的数字量化检测方法。
发明内容
本发明旨在提供一种基于径迹蚀刻膜的数字环介导等温扩增检测方法及应用，利用径迹蚀刻膜内小孔作为相互隔离的纳米反应器，将单个细菌均匀分散至膜的每个孔中进行LAMP扩增，产生荧光，从而实现细菌的绝对定量分析。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种基于径迹蚀刻膜的数字环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤：
(1)在径迹蚀刻膜上滴加含待测物的LAMP反应体系混合物形成膜系统，将膜系统密封于两片防水薄膜之间；
(2)剥离顶部防水薄膜，向膜系统中滴加矿物油覆盖整个膜系统；
(3)将整个膜系统在60-70℃恒温加热30-60min，进行等温扩增；
(4)用ImageJ软件对等温扩增后的膜系统荧光拍照计数，并用泊松分布公式对实验结果进行校正，定量计算出LAMP反应体系混合物中待测物的核酸原始浓度。
本方法的中的径迹蚀刻膜可采用普通商品化多孔薄膜替代，将含待测物的LAMP体系混合物分散到每个孔中形成高密度液滴，进行等温扩增。
所述的径迹蚀刻膜选自聚碳酸酯径迹蚀刻膜(PCTE)、聚酯径迹蚀刻膜(PETE)、聚酰亚胺径迹蚀刻膜(PITE)中任一种。
所述的径迹蚀刻膜的厚度为1-50μm，孔径为10-50μm。
优选地，所述的径迹蚀刻膜为聚碳酸酯径迹蚀刻膜，孔径为25μm。
当径迹蚀刻膜为聚碳酸酯径迹蚀刻膜时，使用前需进行预处理，预处理过程为：将径迹蚀刻膜在乙酸中进行浸泡后，再进行加热，以去除膜表面的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
所述的防水薄膜为聚二甲基硅氧烷膜、聚对苯二甲酸乙二醇酯膜、聚碳酸酯膜中任一种。
所述矿物油主要起到抑制膜系统内的水分蒸发，可以选用食品或医药级的白油。
当扩增目标为DNA时，所述的LAMP反应体系混合物包括：1×LAMP buffer，6mMMgSO4，1.4mM dNTP，640U/mL Bst DNA聚合酶，引物混合物A，50μM钙黄绿素，1mM MnCl2，1mg/mL BSA和2.5μL待测样品。
进一步地，所述引物混合物A为1.6μM FIB和BIP，0.2μM F3和B3 与0.8μM LF和LB的混合物。
当扩增目标为RNA时，在LAMP混合体系中需要加入反转录酶形成反转录LAMP混合物，以实现反转录扩增，并使用引物-染料-引物-猝灭剂双链体代替钙黄绿素-Mn2+指示剂。所述的LAMP反应体系混合物包括：1×LAMP buffer、6mM MgSO4、1.4mM dNTP、640U/mL BstDNA聚合酶、 300U/mL RNA逆转录酶、引物混合物B、3.2μM猝灭剂引物qFIP-3'IBFQ、 1mg/mLBSA和2.5μL待测样品。
进一步地，所述引物混合物B为1.6μM 5'FAM-FIP和BIP，0.2μM F3 和B3与0.8μMLF和LB的混合物。
本发明提供的上述方法可应用于大肠杆菌、沙门氏菌或大肠杆菌噬菌体的定量检测，也可以用于其他菌种的定量分析。
本发明提供的上述方法不仅可以用于数字化扩增，还可以用于液滴微流控领域，如单细胞分析或蛋白质结晶。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的方法与微流控芯片数字PCR相比，不需要复杂的微流控装置及芯片、温控装置等成本较高的设备即可完成对细菌核酸的数字分析，具有简易的实验步骤，快速高效，操作简单，成本低廉的特点。
(2)本发明的方法对目标细菌没有依赖性，只要进行配套的引物设计即可开展目标细菌的数字检测。
(3)本发明中所用径迹蚀刻膜成本低廉，且无需任何的微纳加工，使用后可直接丢弃，不需要洗涤再加工，不存在样品污染的潜在风险，为基因研究提供了一种价格低廉，操作灵活简洁的数字核酸检测技术。
附图说明
图1为聚碳酸酯径迹蚀刻膜的图片。
图2为聚碳酸酯径迹蚀刻膜俯视SEM扫描图，标尺为200μm。
图3为聚碳酸酯径迹蚀刻膜横截面SEM扫描图，标尺为100μm。
图4为实施例1中不同样品荧光拍照计数时膜系统的荧光图，其中 (a-e)分别为实施例1中标准样品a至标准样品e的荧光图，标尺为 0.5mm；(f)为标准样品测量DNA浓度与实际DNA浓度的拟合图。
图5为实施例2中不同样品荧光拍照计数时膜系统的荧光图，其中 (a-d)分别为实施例2中标准样品a至标准样品d的荧光图，标尺为 0.5mm；(e)为标准样品测量DNA浓度与实际DNA浓度的拟合图。
图6为实施例4中测量的待测样品中MS2病毒DNA浓度与标准噬菌斑法测量得到待测样品中MS2病毒DNA浓度对比图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。
以下实施方式采用配制标准样品作为待测样品进行测量，根据测量得到的核酸浓度与标准样品中实际核酸浓度来判断本发明的检测方法的准确性。所有实施例中所使用的引物来源于美国Integrated DNA Technologies 公司；LAMP反应体系混合物中其他扩增试剂购于New England Biolabs 公司；聚碳酸酯径迹蚀刻膜(PCTE)购于美国Sterlitech公司；乙酸和PDMS 膜于市场购买。
以下实施方式使用的聚碳酸酯径迹蚀刻膜的如图1-3所示，可以看到其中的微细的小孔，在实验过程中，LAMP反应体系混合物将分布在这些小孔内，独立完成等温扩增。
实施例1：基于孔径为25μm的径迹蚀刻膜的数字环介导等温扩增检测方法分析大肠杆菌(ATCC 10798)
所使用引物序列如下：
F3：5'-GCCATCTCCTGATGACGC-3'
B3：5'-ATTTACCGCAGCCAGACG-3'
LF：5'-CTTTGTAACAACCTGTCATCGACA-3'
LB：5'-ATCAATCTCGATATCCATGAAGGTG-3'
FIP：5'-CATTTTGCAGCTGTACGCTCGCAGCCCATCATGAATGTTGCT-3'
BIP：5'-CTGGGGCGAGGTCGTGGTATTCCGACAAACACCACGAATT-3'
标准样品a至e中大肠杆菌实际DNA原始浓度分别为：
标准样品a：大肠杆菌DNA原始浓度为11copy/μL；
标准样品b：大肠杆菌DNA原始浓度为1.1×102copy/μL；
标准样品c：大肠杆菌DNA原始浓度为1.1×103copy/μL；
标准样品d：大肠杆菌DNA原始浓度为1.1×104copy/μL；
标准样品e：大肠杆菌DNA原始浓度为1.1×105copy/μL；
将2.5μL标准样品a至e分别添加1×LAMP buffer，6mM MgSO4， 1.4mM dNTP，640U/mL Bst DNA聚合酶，1.6μM FIP和BIP，0.2μM F3 和B3，0.8μM LF和LB，1mg/mL BSA，50μM钙黄绿素，1mM MnCl2制得5个含标准样品的LAMP反应体系混合物。
(1)先将孔径为25μm的PCTE浸置于10％乙酸中30min，再140℃加热60min，以去除膜表面的亲水涂层PVP；
(2)在PCTE膜表面滴加25μL的含标准样品的LAMP反应体系混合物形成膜系统，将膜系统密封于两片PDMS膜之间；
(3)剥离顶部PDMS膜，向膜系统中滴加矿物油密封覆盖整个膜系统；
(4)将整个膜系统在65℃下恒温加热40min进行等温扩增；
(5)用ImageJ软件对等温扩增后的膜系统荧光拍照计数，并用泊松分布公式对实验结果进行校正，定量计算出LAMP反应体系混合物中标准样品的DNA原始浓度。
如图4所示，其中图4中(a)至(e)分别为标准样品a、标准样品 b、标准样品c、标准样品d、标准样品e扩增后的膜系统荧光图像。对扩增后的膜系统进行荧光计数，并根据泊松分布公式矫正后计算得出标准样品中DNA原始浓度，利用该方法测量计算得到的标准样品DNA原始浓度与标准样品中实际DNA原始浓度的拟合图如图4中(f)所示，可以看出测量的DNA浓度与实际DNA浓度十分相符，拟合度可达0.9998，说明本发明数字环介导等温扩增方法用于定量分析大肠杆菌的准确性非常高。
实施例2：基于孔径为14μm径迹蚀刻膜的数字环介导等温扩增检测方法分析大肠杆菌(ATCC 10798)
所使用引物序列与实施例1相同，但本实施例中标准样品a至d中大肠杆菌实际DNA原始浓度分别为：
标准样品a：大肠杆菌DNA原始浓度为1×103copy/μL；
标准样品b：大肠杆菌DNA原始浓度为1×104copy/μL；
标准样品c：大肠杆菌DNA原始浓度为1×105copy/μL；
标准样品d：大肠杆菌DNA原始浓度为1×106copy/μL；
将2.5μL标准样品a至e分别添加1×LAMP buffer，6mM MgSO4， 1.4mM dNTP，640U/mL Bst DNA聚合酶，1.6μM FIP和BIP，0.2μM F3 和B3，0.8μM LF和LB，1mg/mL BSA，50μM钙黄绿素，1mM MnCl2制得4个含标准样品的LAMP反应体系混合物。
(1)先将孔径为14μm的PCTE浸置于10％乙酸中30min，再140℃加热60min，以去除膜表面的亲水涂层PVP；
(2)在PCTE膜表面滴加25μL的含标准样品的LAMP反应体系合物形成膜系统，将膜系统密封于两片PDMS膜之间；
(3)剥离顶部PDMS膜，向膜系统中滴加矿物油密封覆盖整个膜系统；
(4)将整个膜系统在65℃下恒温加热40min进行等温扩增；
(5)用ImageJ软件对等温扩增后的膜系统荧光拍照计数，并用泊松分布公式对实验结果进行校正，定量计算出LAMP反应体系混合物中标准样品的DNA原始浓度。
如图5所示，其中图5中(a)至(d)分别为标准样品a、标准样品 b、标准样品c、标准样品d扩增后的膜系统荧光图像。对扩增后的膜系统进行荧光计数，并根据泊松分布公式矫正后计算得出标准样品中DNA原始浓度，利用该方法测量计算得到的标准样品DNA原始浓度与标准样品中实际DNA原始浓度的拟合图如图5中(e)所示，可以看出测量的DNA 浓度与实际DNA浓度十分相符，拟合度可达0.9998，说明在不同孔径的径迹刻蚀膜上进行的数字环介导等温扩增方法用于定量分析大肠杆菌的准确性也非常高。
实施例3基于孔径为25μm径迹蚀刻膜的数字环介导等温扩增检测方法分析沙门氏菌(CVD 909)
所使用引物序列如下：
F3：5'-GACTTGCCTTTAAAAGATACCA-3'
B3：5'-AGAGTGCGTTTGAACACTT-3'
LF：5'-TCGGATGGCTTCGTTCCT-3'
LB：5'-CAAGGGTTTCAAGACTAAGTGGTTC-3'
FIP：5'-AACTTGCTGCTGAAGAGTTGGACCGAATGACTCGACCATC-3' BIP：5'-CCTGGGGCCAAATGGCATTATGCACTAAGTAAGGCTGG-3'
标准样品a至e中沙门氏菌实际DNA原始浓度分别为：
标准样品a：沙门氏菌DNA原始浓度为11copy/μL；
标准样品b：沙门氏菌DNA原始浓度为1.1×102copy/μL；
标准样品c：沙门氏菌DNA原始浓度为1.1×103copy/μL；
标准样品d：沙门氏菌DNA原始浓度为1.1×104copy/μL；
标准样品e：沙门氏菌DNA原始浓度为1.1×105copy/μL；
将2.5μL标准样品a至e分别添加1×LAMP buffer，6mM MgSO4， 1.4mM dNTP，640U/mL Bst DNA聚合酶，1.6μM FIP和BIP，0.2μM F3 和B3，0.8μM LF和LB，1mg/mL BSA，50μM钙黄绿素，1mM MnCl2制得5个含标准样品的LAMP反应体系混合物。
(1)先将孔径为25μm的PCTE浸置于10％乙酸中30min，再140℃加热60min，以去除膜表面的亲水涂层PVP；
(2)在PCTE膜表面滴加25μL的含标准样品的LAMP反应体系合物形成膜系统，将膜系统密封于两片PDMS膜之间；
(3)剥离顶部PDMS膜，向膜系统中滴加矿物油密封覆盖整个膜系统；
(4)将整个膜系统在65℃下恒温加热40min进行等温扩增；
(5)用ImageJ软件对等温扩增后的膜系统荧光拍照计数，并用泊松分布公式对实验结果进行校正，定量计算出LAMP反应体系混合物中标准样品的DNA原始浓度。经本实施例的测量计算得出的标准样品DNA原始浓度与标准样品中实际DNA原始浓度的拟合度可达0.9994，说明本发明数字环介导等温扩增方法用于定量分析沙门氏菌的准确性也较高。
实施例4基于孔径为25μm径迹蚀刻膜的数字环介导等温扩增方法定量检测大肠杆菌噬菌体MS2病毒(ATCC 15597-B1)
所使用引物序列如下：
F3：5'-CTTGCGACGATAGACTTATC-3'
B3：5'-AGAGTGCGTTTGAACACTT-3'
LF：5'-GCTAGAGTCCATGATATTCTGG-3'
LB：5'-CAAGGGTTTCAAGACTAAGTGGTTC-3'
5'FAM-FIP：5'-FAM-ATCGTATCGTCTCGCCATCTA+
CCACCAGAGCTATATTCATATC-3'
qFIP-3'IBF：5'-GAGACGATACGAT-IBFQ-3'
BIP：5'-ACAATGGGAAATGGGTTCACA+GGGTCGCTTTGACTATTG-3'
扩增目标为RNA，25μL含待测物的LAMP反应体系混合物包括： 1×LAMP buffer，6mM MgSO4，1.4mM dNTP，640U/mL Bst DNA聚合酶， 300U/mL mRNA逆转录酶，1.6μM 5'FAM-FIP和BIP，0.2μM F3和B3, 0.8μM LF和LB，3.2μM猝灭剂引物qFIP-3'IBFQ，1mg/mL BSA和2.5μL 待测样品。待测样品中含有大肠杆菌噬菌体MS2病毒。
(1)先将孔径为25μm的PCTE浸置于10％乙酸中30min，再140℃加热60min，以去除膜表面的亲水涂层PVP；
(2)在PCTE膜表面滴加25μL的含标准样品的LAMP反应体系合物形成膜系统，将膜系统密封于两片PDMS膜之间；
(3)剥离顶部PDMS膜，向膜系统中滴加矿物油密封覆盖整个膜系统；
(4)将整个膜系统在65℃下恒温加热40min进行等温扩增；
(5)用ImageJ软件对等温扩增后的膜系统荧光拍照计数，并用泊松分布公式对实验结果进行校正，定量计算出LAMP反应体系混合物中待测样品中MS2病毒的DNA原始浓度。
经本实施例的测量计算得出的待测样品中MS2病毒的DNA原始浓度与标准噬菌斑法测得待测样品中MS2病毒的DNA原始浓度对比，结果如图6所示，发现本实施例的测量计算得出的待测样品中MS2病毒的DNA 原始浓度与标准噬菌斑法测得待测样品中MS2病毒的DNA原始浓度相当，说明本方法用于测量大肠杆菌噬菌体MS2病毒的准确性与标准噬菌斑法基本相当。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 基于径迹蚀刻膜的数字环介导等温扩增检测方法及应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccatctcct gatgacgc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atttaccgca gccagacg 18
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctttgtaaca acctgtcatc gaca 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atcaatctcg atatccatga aggtg 25
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cattttgcag ctgtacgctc gcagcccatc atgaatgttg ct 42
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctggggcgag gtcgtggtat tccgacaaac accacgaatt 40
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gacttgcctt taaaagatac ca 22
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agagtgcgtt tgaacactt 19
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcggatggct tcgttcct 18
<210> 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caagggtttc aagactaagt ggttc 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aacttgctgc tgaagagttg gaccgaatga ctcgaccatc 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctggggcca aatggcatta tgcactaagt aaggctgg 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cttgcgacga tagacttatc 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agagtgcgtt tgaacactt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gctagagtcc atgatattct gg 22
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caagggtttc aagactaagt ggttc 25
<210> 17
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atcgtatcgt ctcgccatct accaccagag ctatattcat atc 43
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gagacgatac gat 13
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acaatgggaa atgggttcac agggtcgctt tgactattg 39