阅读说明：本技术 一种大鼠血浆中黄芪建中丸十二种成分的定量分析方法 (Quantitative analysis method for twelve components of astragalus mongholicus Jianzhong pills in rat plasma ) 是由 刘月涛 贾璐 秦雪梅 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种大鼠血浆中黄芪建中丸十二种成分的定量分析方法,属于生物分析领域。本发明采用蛋白沉淀处理大鼠血浆样本,以山萘酚为内标采用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)方法检测大鼠血浆中黄芪建中丸十二种成分的含量。采用本发明的检测方法,灵敏度高、专属性强、稳定性高、回收率高达108.74％,既能满足回收率的要求,又可以提高检测效率。此外,本检测方法的重现性好,分析时间短,能满足黄芪建中丸在大鼠血浆中浓度的检测要求,可用于黄芪建中丸药代动力学研究和生物等效性研究。(The invention relates to a quantitative analysis method for twelve components of astragalus jianzhongwan in rat plasma, belonging to the field of biological analysis. The method adopts protein precipitation to process a rat plasma sample, and adopts an ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method to detect the content of twelve components of the astragalus jianzhongwan in the rat plasma by taking kaempferol as an internal standard. The detection method has the advantages of high sensitivity, strong specificity, high stability and high recovery rate of 108.74%, and can meet the requirement of recovery rate and improve the detection efficiency. In addition, the detection method has good reproducibility and short analysis time, can meet the detection requirement of the concentration of the astragalus jianzhongwan in the plasma of rats, and can be used for pharmacokinetic research and bioequivalence research of the astragalus jianzhongwan.)

一种大鼠血浆中黄芪建中丸十二种成分的定量分析方法

技术领域

本发明涉及生物样本中药成分检测技术领域，具体涉及一种大鼠血浆中黄芪建中丸十二种成分的定量分析方法。

背景技术

黄芪建中丸源自仲景经方黄芪建中汤，全方共由黄芪、肉桂、白芍、炙甘草和大枣五味药组成。临床上主要用于补气散寒，健胃和中。现代药理研究表明，其在治疗脾虚导致的胃肠道疾病方面疗效确切；另外也有研究表明，黄芪建中丸还有镇静和解痉、降血糖、调节血液成分、调节免疫功能等作用。目前，对于黄芪建中丸体内定量检测、药代动力学研究和生物等效性试验的方法尚未有报道。为加速我国经典方剂的研究和发展，亟需建立一种高灵敏、高通量的黄芪建中丸体内定量分析方法。

近年来，基于质谱的联用技术得到了迅猛发展，尤其是超髙效液相色谱串联质谱。超高相液相色谱串联质谱具有高分离效能、高通量、高灵敏度和特异性强的特点，且受基质干扰小使样品预处理过程简单化，分析速度快。

发明内容

为黄芪健中丸体内检测提供一种灵敏度高、重现性好，分析准确、可靠的定量分析方法，本发明提供一种大鼠血浆中黄芪建中丸十二种成分的定量分析方法。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种大鼠血浆中黄芪建中丸十二种成分的定量分析方法，包括以下步骤：

(1)处理大鼠血浆样品；

(2)制备对照品储备溶液；

(3)制备混合标准品工作溶液；

(4)制备内标工作溶液；

(5)配制标准曲线工作溶液；

(6)绘制标准曲线；

(7)采用标准曲线定量法测定大鼠血浆中十二种成分含量。

进一步地，所述的一种大鼠血浆中黄芪建中丸十二种成分的定量分析方法，采用山奈酚作为内标。通过完整的分析方法，结合内标分析，建立了符合药典标准的体内定量，准确定量大鼠口服给予黄芪建中丸后血浆中12种成分。

再进一步地，所述步骤(1)中处理大鼠血浆样品，具体为：取200μL血浆样品，加入内标工作液50μL，再加入乙腈800μL，涡旋5分钟，在4℃，13000rpm离心15分钟，取上清液1000μL于另一1.5mL离心管中，置于高速离心浓缩仪中，保温40℃，吹干，100μL甲醇复溶，涡旋1分钟，在4℃，13000rpm离心10分钟，取上清液，得到所需样品溶液。通过引入内标、乙腈除蛋白、冻干和复溶等简单操作，减少待测成分的损失和系统误差，降低基质引起的基质效应，提高12种化学成分的提取效率。

更进一步地，所述步骤(2)中制备对照品溶液，具体方法为：取甘草苷、异甘草苷、甘草素、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、毛蕊异黄酮、肉桂酸、紫檀烷、芒柄花素、异黄烷和甘草次酸对照品，精密称定，置5mL容量瓶中，加入甲醇定容，制成浓度分别为0.626mg/mL、0.21mg/mL、0.2mg/mL、0.312mg/mL、0.218mg/mL、0.312mg/mL、0.27mg/mL、0.27mg/mL、0.256mg/mL、0.192mg/mL、0.228mg/mL和0.274mg/mL的对照品储备溶液。配置设定浓度的标准溶液，可减少对待测物标准品的浪费，节约资源。

更进一步地，所述步骤(3)中制备混合对照品溶液，具体为：分别吸取适量体积的十二种成分的对照品溶液于5mL容量瓶中，定容，得到甘草苷、异甘草苷、甘草素、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、毛蕊异黄酮、肉桂酸、紫檀烷、芒柄花素、异黄烷和甘草次酸终浓度为5.008μg/mL、1.68μg/mL、1.6μg/mL、28μg/mL、6.54μg/mL、24.96μg/mL、21.6μg/mL、54.8μg/mL、0.512μg/mL、0.768μg/mL、0.456μg/mL和3.24μg/mL的混合对照品溶液。混合对照品溶液可实现一次进样同时分析多个成分，节约时间和成本。此外，也可减少对质谱分析过程中的离子抑制效应，提供分析效率。

更进一步地，所述步骤(4)中制备内标工作溶液，具体为：取山萘酚对照品精密称定，置5mL容量瓶中，加入甲醇定容，浓度为50μg/mL。山奈酚为常见的黄酮类成分母核，与待测成分的结构相似，可将血浆生物基质带来的干扰降低，准确对其进行定量分析。

更进一步地，所述步骤(5)中配制标准工作溶液，具体为：将混合标准品溶液稀释至终浓度的2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍和200倍的系列浓度。配置该系列浓度的标准溶液，可模拟血浆中待测物的浓度曲线，且满足药物在血浆的动态浓度范围。

更进一步地，所述步骤(6)中绘制标准曲线，具体为：取空白血浆200μL加入标准工作溶液50μL和内标溶液20μL，乙腈800μL，涡旋5分钟，在4℃，13000rpm，离心15分钟，吸取上清液1000μL于1.5mL离心管，置于高速离心浓缩仪中，保温40℃，吹干，加入100μL甲醇复溶，涡旋1分钟，在4℃，13000rpm，离心10分钟，吸取上清液得到空白溶液，采用超高相液相色谱串联质谱检测，绘制标准曲线。引入空白基质(空白血浆)，经过平行的实验操作，模拟生物基质对待测物的干扰，准确定性定量。

更进一步地，所述的液相色谱条件具体为，色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱柱，规格：2.1mm×100mm，1.8μm；柱温：40℃；进样量为5μL，液相流速为0.25mL/min；流动相A/B：0.1％甲酸水溶液/乙腈溶液；流动相梯度洗脱程序为：0-5min，5％B；5-10min，20％B；10-15min，25％B；15-18min，30％B；18-20min，40％B；20-23min，60％B；23-25min，99％B，分析时间25min；通过色谱梯度分离，短时间获得较好的分离度，快速准备对待测物定性定量分析。

更进一步地，所述的质谱检测条件具体为：采用MRM多反应监测模式、ESI离子源，离子源温度400℃，离子化方式：气动辅助电喷雾离子化；CAD：Medium；CUR：20psi；GS1：45psi；GS2：35psi；TEM：400℃；IS：5500v。构建适宜于不同待测成分的MRM定量模式，实现准确、灵敏的定量。

制备QC溶液：选取上述(4)中低、中、高三个浓度的标准工作溶液作为QC溶液。

利用QC溶液对上述建立的一种大鼠血浆中黄芪建中丸十二种成分的定量分析方法进行方法学考察。保证分析方法的准确度和稳健度，保证定量结果的准确。

与现有技术相比，本发明能够取得的有益效果为：1、分析时间短；2、分离度较好；3、重现性好，可准确测定十二种成分的含量。

该方法可用于黄芪建中丸的药代动力学研究。

附图说明

图1为样品溶液的质谱总离子流图(IS：内标)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整的说明。

实施例中使用到的仪器和试剂如下：

仪器：Agilent1290超高效液相色谱仪(Agilent公司)，超声波清洗器(KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司)，高速离心浓缩仪，高速离心机，涡旋仪，色谱柱Waters ACQUITYUPLC HSS T3(2.1mm×100mm，1.8μm)。

试剂：乙腈(质谱纯，Fisher公司)、甲醇(质谱纯，Fisher公司)、超纯水、甲酸(质谱纯，Fisher公司)，其余试剂均为分析纯。

实施例1

本实施例中一种大鼠血浆中黄芪建中丸十二种成分的定量分析方法，包括以下步骤：

(1)处理大鼠血浆样品：黄芪建中丸口服给予大鼠，2小时后眼眶取血，收集血浆样品。取200μL血浆样品，加入内标工作液50μL，再加入乙腈800μL，涡旋5分钟，在4℃，13000rpm离心15分钟，取上清液1000μL于另一1.5mL离心管中，置于高速离心浓缩仪中，保温40℃，吹干，100μL甲醇复溶，涡旋1分钟，在4℃，13000rpm离心10分钟，取上清液，得到所需样品溶液。

(2)制备对照品储备溶液：取甘草苷、异甘草苷、甘草素、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、毛蕊异黄酮、肉桂酸、紫檀烷、芒柄花素、异黄烷和甘草次酸对照品精密称定，置5mL容量瓶中，加入甲醇定容，制成浓度分别为0.626mg/mL、0.21mg/mL、0.2mg/mL、0.312mg/mL、0.218mg/mL、0.312mg/mL、0.27mg/mL、0.27mg/mL、0.256mg/mL、0.192mg/mL、0.228mg/mL和0.274mg/mL的对照品溶液；

(3)制备混合标准品工作溶液：分别吸取适量体积的十二种成分的对照品溶液于5mL容量瓶中，定容，得到甘草苷、异甘草苷、甘草素、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、毛蕊异黄酮、肉桂酸、紫檀烷、芒柄花素、异黄烷和甘草次酸终浓度为5.008μg/mL、1.68μg/mL、1.6μg/mL、28μg/mL、6.54μg/mL、24.96μg/mL、21.6μg/mL、54.8μg/mL、0.512μg/mL、0.768μg/mL、0.456μg/mL和3.24μg/mL的混合标准品溶液；

(4)制备内标工作溶液：取山萘酚对照品精密称定，置5mL容量瓶中，加入甲醇定容，浓度为50μg/mL；

(5)配制标准工作溶液：将混合标准品溶液稀释至终浓度的2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍和200倍的系列浓度；

(6)绘制标准曲线：取空白血浆200μL加入标准工作溶液50μL和内标溶液20μL，乙腈800μL，涡旋5分钟，在4℃，13000rpm，离心15分钟，吸取上清液1000μL于1.5mL离心管，置于高速离心浓缩仪中，保温40℃，吹干，加入100μL甲醇复溶，涡旋1分钟，在4℃，13000rpm，离心10分钟，吸取上清液得到空白溶液，采用超高相液相色谱串联质谱检测，绘制标准曲线；

所述液相色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱柱，规格：2.1mm×100mm，1.8μm；柱温：40℃；进样量为5μL，液相流速为0.25mL/min；流动相A/B：0.1％甲酸水溶液/乙腈溶液；流动相梯度洗脱程序为：0-5min，5％B；5-10min，20％B；10-15min，25％B；15-18min，30％B；18-20min，40％B；20-23min，60％B；23-25min，99％B，分析时间25min；

所述质谱条件：采用MRM多反应监测模式、ESI离子源，离子源温度400℃，离子化方式：气动辅助电喷雾离子化(ESI)；CAD：Medium；CUR：20psi；GS1：45psi；GS2：35psi；TEM：400℃；IS：5500v。监测离子、碰撞能量、锥孔电压等参数见表1。各成分在色谱行为见图1(1：甘草苷；2：异甘草苷；3：甘草素；4：毛蕊异黄酮苷；5：芒柄花苷；6：紫檀烷苷；7：毛蕊异黄酮；8：肉桂酸；9：紫檀烷；10：芒柄花素；11：异黄烷；12：甘草次酸；IS：内标)。

表1十二种成分的监测离子、碰撞能量、锥孔电压参数

采用标准曲线法计算血浆样品中十二种成分的含量，结果如下：

给药2小时后大鼠血浆中甘草苷、异甘草苷、甘草素、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、毛蕊异黄酮、肉桂酸、紫檀烷、芒柄花素、异黄烷和甘草次酸的浓度分别为0.0068μg/mL、0.9876μg/mL、0.1008μg/mL、0.0010μg/mL、0.4677μg/mL、0.0049μg/mL、0.0147μg/mL、0.0547μg/mL、0.4869μg/mL、1.2512μg/mL、6.8025μg/mL和106.3974μg/mL。

实施例2

大鼠血浆中黄芪建中丸的十二种成分含量测定方法学考察：

下述实验的样品品溶液均采用如下方法制备：

1)标准曲线的建立及线性范围试验

将混合标准品工作溶液稀释至终浓度的2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍和200倍的系列浓度。采用拟定的方法，采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1mm×100mm，1.8μm)色谱柱以Agilent1290超高效液相色谱仪联用Q3200串联质谱进行检测绘制标准曲线并得到各成分的相关系数、线性范围、定量限及检测限结果见表2。

表2十二种成分的标准曲线、相关系数、线性范围、定量限及检测限结果

2)精密度试验

取QC溶液，连续进样6次，测定样品中十二种成分的峰面积，其同一供试品溶液峰面积RSD≦15％，表明整个检测系统的精密度良好，结果见表3。

表3精密度、重复性及稳定性试验结果

3)重复性试验

取QC溶液，平行备样6份，进行UHPLC-MS/MS的测定，结果显示，6份供试品溶液中十二种成分的峰面积的RSD≦15％，表明该方法重现性良好，结果见表3。

4)稳定性试验

取QC溶液，在4℃放置24小时、室温放置6小时、-80℃反复冻融3三次，-80℃放置15天，测定十二种成分的峰面积，结果显示，峰面积的RSD≦15.05％，表明大鼠血浆中黄芪建中丸的十二种成分的待测溶液在上述条件下稳定性良好，结果见表3。

5)回收率试验

取空白血浆200μL加入乙腈800μL，涡旋1分钟，4℃，13000rpm离心15分钟，取上清液，加入50μL的标准品工作液，20μL的内标溶液，用高速离心浓缩仪(40℃)，吹干，100μL甲醇复溶制备得到溶液A。

取空白血浆200μL加入乙腈800μL，50μL的标准品工作液，20μL的内标溶液，涡旋1分钟，4℃，13000rpm离心15分钟，取上清液，加入用高速离心浓缩仪(40℃)，吹干，100μL甲醇复溶，4℃，13000rpm离心10分钟，取上清液制备得到溶液B。

回收率计算公式为：回收率＝B/A×100％

QC溶液平行备样5份，进行UHPLC-MS/MS的测定，结果显示，回收率在83.27％-108.74％，表明该方法回收率良好，结果见表4。

表4回收率试验和基质效应结果

6)基质效应

取空白溶剂200μL加入乙腈800μL，50μL的标准品工作液，20μL的内标溶液，涡旋1分钟，4℃，13000rpm离心15分钟，取上清液，使用高速离心浓缩仪(40℃)，吹干，100μL甲醇复溶，4℃，13000rpm离心10分钟，取上清液制备得到溶液C。

基质效应计算公式为：基质效应＝B/C×100％

QC溶液平行备样5份，进行UHPLC-MS/MS的测定，结果见表4。