阅读说明：本技术 一种夏天无指纹图谱建立方法及多成分化学模式识别方法 (Decumbent corydalis tuber fingerprint map establishing method and multi-component chemical pattern recognition method ) 是由 龚千锋 严丽萍 于欢 李潮 温柔 于 2019-10-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种夏天无指纹图谱建立方法S1、取十四个产地的大选、统货、小选夏天无粉末,用抢水洗净,放置在阳光下晒干或阴凉通风处阴干,备用；S2、称取1g夏天无粉末,置于具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50ml,称定重量,超声提取30min；S3、将S3步骤得到的溶液放冷,再称定重量,用50%甲醇溶液补足减失的重量,摇匀,过0.22um滤膜,取续滤液,制得供试品溶液;S4、分别取取10μL溶液通过UltiMate 3000 DAD检测器采用200～400 nm波段进行扫描,建立指纹图谱,可以检测出14个产区的夏天无在成分上的差异,分出各个产区不同等级的夏天无药材,且可判断与夏天无质量相关性较强的化学成分。(The invention discloses a decumbent corydalis tuber fingerprint map establishing method S1, fourteen large-choice, general-purpose and small-choice decumbent corydalis tuber powders of producing areas are taken, cleaned by rush water and placed in the sun for drying or in the shade in a ventilated place for later use; s2, weighing 1g of rhizoma corydalis Decumbentis powder, placing in a conical flask with a plug, precisely adding 50ml of 50% methanol, weighing, and ultrasonically extracting for 30 min; s3, cooling the solution obtained in the step S3, weighing the solution, complementing the lost weight with 50% methanol solution, shaking the solution evenly, filtering the solution with a 0.22um filter membrane, taking the subsequent filtrate to obtain a sample solution, S4, respectively taking 10 mu L of the solution, scanning the solution by an Ultimate 3000DAD detector by adopting a 200-400 nm waveband, establishing a fingerprint spectrum, detecting the difference of the components of corydalis amabilis in 14 production areas, separating the corydalis amabilis medicinal materials in different grades of each production area, and judging the chemical components with strong correlation with the quality of the corydalis amabilis.)

一种夏天无指纹图谱建立方法及多成分化学模式识别方法

技术领域

本发明属于中药分类技术领域，具体涉及一种夏天无指纹图谱建立方法及多成分化学模式识别方法。

背景技术

夏天无系罂粟科紫堇属延胡索亚属的多年生草本植物伏生紫堇的干燥块茎或全草，又名一粒金丹、野延胡、洞里神仙、伏地延胡索和落水珠。主产于江西，广泛分布于江苏、安徽、浙江、福建、台湾和湖南等省，是我国常用的中草药。夏天无具活血、通络、行气、止痛等功效。主治高血压、脑血管引起的中风偏瘫，并对风湿性关节炎、坐骨神经痛、小儿麻痹后遗症等具有较好的效果，其主要活性成分为生物碱类。已知的夏天无生物碱提取物中的生物碱主要有：原阿片碱，毕枯枯灵，夏无宁碱，紫堇尔明，延胡索乙素，巴马亭，上述6种生物碱都是夏天无生物碱提取物中的主要活性成分。为了全面准确地反应夏天无总生物碱提取物的质量，有必要对这6种生物碱的含量都进行测定。

在我国多个产区的各等级的夏天无，在实际成分也存在一定的差异，现在缺少一种图谱对于多种夏天无的成分进行分离进行汇总记录，也缺少一种对夏天无有效成分的直观展示突进，限制了对夏天无成分的研究和开发，所以需要更新技术解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种夏天无指纹图谱建立方法及多成分化学模式识别方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种夏天无指纹图谱建立方法，其特征在于：包括以下步骤，

S1、取十四个产地的大选、统货、小选夏天无粉末，用抢水洗净，放置在阳光下晒干或阴凉通风处阴干，备用；

S2、称取1g夏天无粉末，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，称定重量，超声提取30min；

S3、将S3步骤得到的溶液放冷，再称定重量，用50%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，过0.22um滤膜，取续滤液,制得供试品溶液；

S4、分别取取10μL溶液通过UltiMate 3000 DAD 检测器采用200～400 nm 波段进行扫描，建立指纹图谱。

优选的，S4步骤中使用的UltiMate 3000 DAD 检测器的色谱柱为 Diamonsil-C18，乙腈为流动相A,水溶液为流动相B，采用梯度程序洗脱；流速1.0mL·min，柱温25℃。

优选的，S4步骤中使用的扫描波长为289nm。

优选的，14个产地3个等级的夏天无指纹图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，确定特征共有峰，以及四个对应成分的峰。

优选的，使用UltiMate 3000 DAD 检测器之前，精密称取同一批次夏天无粉末1g，按S1-S3步骤制得供试品溶液，连续自动进样10ul共6次，记录各色谱图。

本发明还提供了一种夏天无的多成分化学模式识别方法，包括以下步骤，

S1、采集14批次3等级夏天无6个特征成分定量数据；

S2、将一起42批次夏天无样品6个特征成分导入SIMCA14.1软件中进行主成分分析；

S3、通过0PLS-DA法对样品进行分析，导出PCA图进行观察。

优选的，S1中的定量数据是在上述步骤制得的指纹图谱中获得。

优选的，6个特征成分分别为峰为盐酸巴马汀、峰为紫堇碱、峰为四氢药根碱、比枯枯灵碱、原阿片碱以及延胡索乙素。

本发明的技术效果和优点：该夏天无指纹图谱建立方法及多成分化学模式识别方法，该法所建立的夏天无生物碱类成分指纹图谱特征性强、方法简便，结合6个生物碱含量测定可更好地控制其质量，对夏天无等级分类具有指导意义和参考价值，推进对于夏天无药材的成分研究和应用，对于市场上夏天无的选购也有很大的益处。

具体实施方式

本案所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种夏天无指纹图谱建立方法，包括以下步骤，

S1、取十四个产地的大选、统货、小选夏天无粉末，用抢水洗净，放置在阳光下晒干或阴凉通风处阴干，备用；

S2、称取1g夏天无粉末，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，称定重量，超声提取30min；

S3、将S3步骤得到的溶液放冷，再称定重量，用50%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，过0.22um滤膜，取续滤液,制得供试品溶液；

S4、分别取取10μL溶液通过UltiMate 3000 DAD 检测器采用200～400 nm 波段进行扫描，建立指纹图谱。采用e2695型水溶液，乙腈－0.5%三乙胺溶液（醋酸调pH=9.99)为流动相进行梯度洗脱，再利用HPLC法对14 批3个等级夏天无药材进行测定，运用 “中药谱指纹图谱相似度评价软件”2012A 版计算相似度，对其6种生物碱成分进行含量测定，从而得到多等级各地的夏天无成分数值，整理为图谱。

S4步骤中使用的UltiMate 3000 DAD 检测器的色谱柱为 Diamonsil- C18，乙腈为流动相A,水溶液为流动相B，采用梯度程序洗脱；流速1.0mL·min，柱温25℃。

S4步骤中使用的扫描波长为289nm，在该波长的扫描下，夏天无各成分分离的速度更快，效果更好。

14个产地3个等级的夏天无指纹图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，确定特征共有峰，以及四个对应成分的峰，建立了14产区不同等级夏天无生物碱类成分的HPLC指纹图谱，相似度均大于0.94，说明不同产区的夏天无在成份上无差异，标定了12个峰，并指定了其中6个特征峰。

使用UltiMate 3000 DAD 检测器之前，精密称取同一批次夏天无粉末1g，按S1-S3步骤制得供试品溶液，连续自动进样10ul共6次，记录各色谱图，进行精密度试验，对仪器的检测精度校准，精密称取同一批次已知含量的夏天无粉末6份，每份约1.0g,分别精密加入原阿片碱等6种对照品，加入量分别为供试品含有量的80%、100%、120%，按“2.4”项下条件，制备成供试品溶液，通过S4步骤进行测定，记录各对照品峰面积并计算回收率，结果显示原阿片碱、盐酸巴马汀、延胡索乙素、比枯枯灵碱、四氢药根碱、紫堇碱的回收率分别为：97.54%、97.85%、97.31%、97.61%、97.78%、98.23%；RSD值分别为1.21%、0.76%、1.26%、1.93%、1.52%、1.24%，表明所建立的含量测定方法准确度较高。。

本发明中夏天无的多成分化学模式识别方法，包括以下步骤，

S1、采集14批次3等级夏天无6个特征成分定量数据；

S2、将一起42批次夏天无样品6个特征成分导入SIMCA14.1软件中进行主成分分析；

S3、通过0PLS-DA法对样品进行分析，导出PCA图进行观察。运用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）对样品进行模式识别，为了更好地考察化学模式识别方法能否将不同等级完全区分，进一步采用0PLS-DA法对样品进行分析，从PCA图观察，大选与小选可以很好的分开，为夏天无的等级划分提供可靠依据。

S1中的定量数据是在上述步骤制得的指纹图谱中获得。

6个特征成分分别为峰为盐酸巴马汀、峰为紫堇碱、峰为四氢药根碱、比枯枯灵碱、原阿片碱以及延胡索乙素。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。