阅读说明：本技术 一种评价中成药药代基质效应的分析方法 (Analysis method for evaluating matrix effect of Chinese patent medicine ) 是由 李川 程晨 余玄 杜飞飞 徐方 王凤清 董凯 张桂萍 姚小青 于 2019-11-01 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种评价中成药药代基质效应的分析方法,包括以下步骤：1)将中成药和中成药中关键成分分别对实验鼠给药后,采集体液；2)对体液进行分析,确定体液所含中成药中关键成分的浓度；3)采用梯形法计算获得AUC<Sub>0-t</Sub>；4)计算AUC<Sub>0-∞</Sub>；5)计算血浆总清除率；6)计算肾清除率、胆汁清除率；7)计算稳态分布容积；8)计算尿累积排泄分数、胆汁累积排泄分数；9)将药代动学参数,进行样本T检验评价显著性差异,确定中成药中关键成分的药代基质效应。本发明提供的一种评价中成药药代基质效应的分析方法,可以快速准确地评价中成药关键成分的药代基质效应,对于揭示基于药代的中成药中关键成分方剂配伍规律具有重要意义。(The invention provides an analysis method for evaluating the effect of a Chinese patent drug-substituted matrix, which comprises the following steps: 1) respectively administering key components of the Chinese patent medicine and the Chinese patent medicine to a laboratory mouse, and collecting body fluid; 2) analyzing the body fluid to determine the concentration of key components in the Chinese patent medicine contained in the body fluid; 3) AUC is obtained by trapezoidal calculation 0‑t (ii) a4) Calculating AUC 0‑∞ (ii) a 5) Calculating the total clearance rate of the blood plasma; 6) calculating renal clearance and bile clearance; 7) calculating a steady-state distribution volume; 8) calculating cumulative urine excretion fraction and cumulative bile excretion fraction; 9) and (3) carrying out sample T test on pharmacokinetic parameters to evaluate the significance difference, and determining the drug-induced matrix effect of key components in the Chinese patent medicine. The invention provides a commentThe analysis method of the drug-substituted matrix effect of the Chinese patent medicine can quickly and accurately evaluate the drug-substituted matrix effect of the key components of the Chinese patent medicine, and has important significance for disclosing the compatibility rule of key component prescriptions in the Chinese patent medicine based on the drug substitution.)

一种评价中成药药代基质效应的分析方法

技术领域

本发明属于中药药代动力学领域，涉及一种评价中成药药代基质效应的分析方法。

背景技术

中成药是以中药材为原料，在中医药理论指导下，为了预防及治疗疾病的需要，按规定的处方和制剂工艺将其加工制成一定剂型的中药制品，是经国家药品监督管理部门批准的商品化的一类中药制剂。中成药常用剂型包括片剂、丸剂、散剂、膏剂、注射剂等。和化药相比，中成药化学成分复杂，给药后机体内变化过程复杂。中药药代基质效应是指中成药中单一成分受其它成分的影响，与成分单独给药相比，体内药动学特征发生改变。考察中药药代基质效应对于阐明复方给药后中药单体成分体内药动学特征，揭示关键成分的方剂配伍规律具有重要意义。目前尚未有人提出系统考察中药药代基质效应的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种评价中成药药代基质效应的分析方法，可以快速、准确地评价中成药关键物质的药代基质效应。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种评价中成药药代基质效应的分析方法，包括以下步骤：

1)将中成药和中成药中关键成分分别对实验鼠给药后，在不同时间点t采集给药中成药和给药中成药中关键成分的实验鼠的体液，分别作为试样组A和试样组B；

2)采用液相色谱质谱联用法对试样组A和试样组B进行分析，确定在不同时间点t的试样组A和试样组B中所含中成药中关键成分的浓度C_t；

3)根据浓度C_t与对应的时间点t之间的线性关系，采用梯形法计算获得面积AUC_0-t；

4)计算AUC_0-∞，使其符合公式(1)，所述公式(1)为：AUC_0-∞＝AUC_0-t+C_t/k_e，其中，AUC_0-∞为时间从0时刻到无穷大期间的药时曲线下面积，μM·h；AUC_0-t为时间从给药前0时刻到实验所选的最后一个时间点t这一段时间内的药时曲线下面积，μM·h；C_t为在不同时间点t的实验鼠体液中所含中成药中关键成分的浓度，μM；k_e为末端消除速率，h^-1；

5)根据AUC_0-∞，按公式(2)计算血浆总清除率CL_tot,p；

所述公式(2)为：CL_tot,p＝Dose/AUC_0-∞，其中，CL_tot,p为血浆总清除率，L/h/kg；Dose为给药剂量，μmol；AUC_0-∞为时间从0时刻到无穷大期间的药时曲线下面积，μM·h；

6)根据AUC_0-t，按公式(3)计算肾清除率CL_R，按公式(4)计算胆汁清除率CL_B；

所述公式(3)为：CL_R＝Cum.A_e-U/AUC_0-t，其中，CL_R为肾清除率，L/h/kg；Cum.A_e-U为累积尿***量，μmol；AUC_0-t为时间从给药前0时刻到实验所选的最后一个时间点t这一段时间内的药时曲线下面积，μM·h；

所述公式(4)为：CL_B＝Cum.A_e-B/AUC_0-t，其中，CL_B为胆汁清除率，L/h/kg；Cum.A_e-B为累积胆汁***量，μmol；AUC_0-t为时间从给药前0时刻到实验所选的最后一个时间点t这一段时间内的药时曲线下面积，μM·h；

7)根据CL_tot,p，按公式(5)计算稳态分布容积V_ss，

所述公式(5)为：V_ss＝CL_tot,p*t_1/2，其中，V_ss为稳态分布容积，L/kg；CL_tot,p为血浆总清除率，L/h/kg；t_1/2为消除半衰期，h；

8)按公式(6)计算尿累积***分数f_e-U，按公式(7)计算胆汁累积***分数f_e-B；

所述公式(6)为：f_e-U＝Cum.A_e-U/Dose*100％，其中，f_e-U为尿累积***分数，％；Cum.A_e-U为累积尿***量，μmol；Dose为给药剂量，μmol；

所述公式(7)为：f_e-B＝Cum.A_e-B/Dose*100％，其中，f_e-B为胆汁累积***分数，％；Cum.A_e-B为累积胆汁***量，μmol；Dose为给药剂量，μmol；

9)将试样组A和试样组B中，C_t、AUC_0-t、AUC_0-∞作为剂量依赖型血浆药代动学参数，CL_tot,p、V_ss作为剂量非依赖型血浆药代动学参数，选择f_e-U、f_e-B、CL_R、CL_B中的一项或多项作为反映***的药代动学参数，进行样本T检验评价显著性差异，确定中成药中关键成分的药代基质效应。

优选地，步骤1)中，所述中成药为血必净注射液。

步骤1)中，所述中成药中关键成分是指，在中成药中可用于评价中成药药代基质效应的成分。

优选地，步骤1)中，所述实验鼠为SD大鼠。

优选地，步骤1)中，所述给药的方式选自口服或注射中的一种。所述注射选自静脉注射、皮下注射、肌肉注射中的一种。

优选地，步骤1)中，所述实验鼠的体液选自血浆、尿或胆汁中的一种或多种组合。

更优选地，所述体液为血浆时，采血后离心、冷冻保存待测；所述体液为尿时，收集尿样后冷冻保存待测；所述体液为胆汁时，收集胆汁冷冻保存待测。

进一步优选地，所述离心的条件为：离心速率为5000-20000rpm；离心时间为1-3min。最优选地，所述离心的条件为：离心速率为10000rpm；离心时间为2min。

进一步优选地，所述冷冻保存的温度为≤-70℃。

更优选地，所述体液为血浆时，所述时间点t为给药前的任一时间点和给药后的0、0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、24h。

更优选地，所述体液为尿或胆汁时，所述时间点t为给药前的0-12h和给药后的0–4、4–8和8–24h。

优选地，步骤1)中，所述实验鼠给药前可饮水但禁食10-14h。更优选地，所述实验鼠给药前禁食12h。

优选地，步骤2)中，所述实验鼠的体液在进行分析前要加入溶剂后振荡进行蛋白沉淀、离心，取上清液作为分析液。

更优选地，所述溶剂为甲醇。

更优选地，所述实验鼠的体液与溶剂加入的体积之比为1:2-4。最优选地，实验鼠的体液与溶剂加入的体积之比为1:3。

更优选地，所述振荡时间为1-6min。最优选地，所述振荡时间为5min。

更优选地，所述离心的条件为：离心速率为10000-15000rpm；离心时间为5-15min。最优选地，所述离心的条件为：离心速率为14800rpm；离心时间为10min。

优选地，步骤2)中，所述液相色谱质谱联用法中，所述液相色谱采用的色谱柱为Water MG II柱(50mm×2.0mm，3μm)。

优选地，步骤2)中，所述液相色谱质谱联用法中，所述液相色谱采用的色谱柱温为室温，优选为20-25℃；流速为0.2-0.4ml/min，优选为0.3ml/min；进样量为3-10μL，优选为5μL。

优选地，步骤2)中，所述液相色谱质谱联用法中，所述液相色谱采用的流动相：水-甲醇溶液(含甲酸)，其中，A相为水(含0.003-0.005％甲酸)，B相为甲醇(含0.003-0.005％甲酸)；分析时间：10min；梯度洗脱。

更优选地，所述液相色谱质谱联用法中，所述液相色谱采用的流动相：水-甲醇溶液(含甲酸)，其中，A相为水(含0.004％甲酸)，B相为甲醇(含0.004％甲酸)；分析时间：10min；梯度洗脱。

更优选地，所述梯度洗脱程序的具体为：

0-0.5min，A相：B相体积比为98：2-98：2；0.5-7min，A相：B相体积比为98：2-30：70；7-8min，A相：B相体积比为30：70-2：98；8-8.1min，A相：B相体积比为2：98-98：2；8.1-10min，A相：B相体积比为98：2-98：2。

优选地，步骤2)中，所述液相色谱质谱联用法中，所述质谱的测定条件为：离子源为ESI源；检测模式为负离子电喷雾电离模式(ESI^-)；工作模式为SRM模式；用于定量分析的SRM离子对为：m/z 611→491。

优选地，步骤2)中，所述液相色谱质谱联用法对实验鼠体液进行分析，先根据对已知浓度的中成药中关键成分标准品，通过质谱定性，再通过标准曲线法对实验鼠体液中所含的对应中成药中关键成分的浓度进行定量。

所述标准曲线法是通过LC/MS/MS测定获得的中成药中关键成分的色谱峰面积与相应的中成药中关键成分的浓度的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到中成药中关键成分的标准工作曲线的回归方程，再通过LC/MS/MS测定实验鼠体液中所含的对应中成药中关键成分的色谱峰面积代入对应中成药中关键成分的标准工作曲线的回归方程，计算得到实验鼠体液中所含的对应中成药中关键成分的浓度。

优选地，步骤2)中，所述中成药中关键成分的个数n为不小于1的自然数。更优选地，所述n为1-6的自然数。

步骤3)中，所述梯形法为将血药浓度C_t-时间t曲线分割成无数小的梯形，再按照梯形面积公式：(上底+下底)乘以高除以2，计算各个小梯形面积并将所有梯形面积相加，得到药时曲线下面积AUC_0-t。根据浓度C_t与对应的时间点t之间的线性关系，绘制浓度C_t与时间点t的曲线。

步骤4)中，所述AUC(药时曲线下面积)代表用药后药物进入体循环的总量，反映药物的血浆暴露水平。

步骤4)中，所述末端消除速率k_e为：将血药浓度C_t取对数，对时间t作线性回归后所得斜率值的负数。所述末端消除速率k_e由Kinetica 5.0软件进行拟合算出。

步骤5)中，所述CL_tot,p是肝肾等的药物清除率的总和，即单位时间内多少容积血浆中的药物被清除干净，该参数反映机体清除药物的能力。

步骤6)中，所述CL_R指肾脏在一定时间内将血浆中的药物排出体内的能力，一方面反映肾脏对药物的清除能力，另一方面反映药物从体内清除的机制，为药物血浆总清除率的组成部分之一。

步骤6)中，所述CL_B指肝脏通过胆汁***方式在一定时间内将血浆中的药物排出体内的能力，一方面反映肝脏对药物的清除能力，另一方面反映药物从体内清除的机制，为药物血浆总清除率的组成部分之一。

步骤7)中，所述V_ss是指药物在体内达动态平衡后，体内药量与血药浓度之比，其药理意义是提示该药是否体内分布广泛或者是药物与生物高分子有大量结合，亦或两者兼有之。

步骤7)中，所述t_1/2(消除半衰期，也称末端消除半衰期)根据药时曲线末端消除相计算，在数值上与末端消除速率k_e成反比，即:末端消除半衰期t_1/2＝0.693/k_e；该参数为末端相血药浓度下降一半所需的时间，直观反映了药物从体内的消除速度。

步骤8)中，所述f_e-U反映药物从尿***的程度。

步骤8)中，所述f_e-B反映药物从胆汁***的程度。

步骤6)或8)中，所述公式(3)或(6)中，所述累积尿***量Cum.A_e-U为各时间段尿中的中成药中关键成分浓度与***体积的乘积之和。

步骤6)或8)中，所述公式(4)或(7)中，所述累积胆汁***量Cum.A_e-B为各时间段胆汁中的中成药中关键成分浓度与***体积的乘积之和。

步骤9)中，所述样本T检验，目的在于考察试样组A和试样组B两组给药方式下，所选的待测中成药中关键成分的体内药动学特征是否出现显著差异，若存在差异显著说明中成药中其它成分可能影响所选待测中成药中关键成分的体内药动学特征，即可能存在中药药代基质效应，若无显著差异说明中成药中其它成分不影响待测中成药中关键成分的体内药动学特征，即不存在中药药代基质效应。优选地，步骤9)中，所述样本T检验按公式(8)进行计算，所述公式(8)为：

其中，

为两样本均值；σ_x1 ²、σ_x2 ²分别为两样本方差；γ为相关样本的相关系数；n为样本量。所述公式(8)采用SPSS 19.0软件进行计算，其中相关样本的相关系数γ由SPSS19.0软件进行拟合算出。

优选地，所述样本T检验当P<0.05提示有统计学显著差异。

步骤4)、5)、6)、7)或8)中，所述公式(1)至(7)中的药代动力学参数，可采用药代动力学软件Kinetica 5.0按照非房室模型法分析，进行数据处理。

如上所述，本发明提供的一种评价中成药药代基质效应的分析方法，通过将中成药和中成药中关键单体成分分别对实验鼠给药后，采集实验鼠的体液，并对存在于实验鼠体液中的关键单体成分的浓度进行测定，将获得的数据进行药代动学参数计算，并进行统计分析，比较中成药复方制剂给药和中成药中关键物质单独给药后的体内过程(血药浓度，尿和/或胆汁***量和***速率)，从而揭示实验鼠在中成药给药后其中关键成分的体内过程是否受其它成分的影响，体内药动学特征是否显著改变，即是否产生中药药代基质效应。该方法可以较为快速准确地评价中成药中关键成分的药代基质效应，对于揭示基于药代的中药方剂配伍规律具有重要意义。

附图说明

图1显示为本发明给药血必净注射液后大鼠体内羟基红花黄色素A的平均血药浓度-时间曲线图。

图2显示为本发明给药羟基红花黄色素A溶液后大鼠体内羟基红花黄色素A的平均血药浓度-时间曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

以下实施例使用的试剂和仪器如下：

1、试剂

SPF级、雄性、体重230–270g的SD大鼠，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司(许可证号：SCXK(沪)2008-0016)提供，合格证号2008001624578；实验动物的使用在中国科学院上海药物研究所II期动物中心【实验动物使用许可证号：SYXK(沪)2015-0027】进行；实验方案实施前获得中国科学院上海药物研究所实验动物管理和使用委员会(IACUC)的审核与批准(2012-11-LC-08)。

羟基红花黄色素A(以下简称羟A，CAS号为78281-02-4)对照品购自诗丹德生物技术有限公司；血必净注射液(以下简称血必净，国药准字：Z20040033)由天津红日药业股份有限公司提供。

甲醇、甲酸(LC-MS级试剂，德国Merck公司)；实验用水为由Millipore Mill-QIntegral3系统制备(18.2M·Ω)的超纯水。

2、仪器

液相-质谱联用分析系统(LC/MS/MS)由Waters UPLC以及Thermo公司生产的TSQQuantum三重四极杆质谱检测器组成，系统工作软件为Chemstation(HPLC)和Xcalibur 1.3(质谱)。

–70℃超低温冰箱(日本Sanyo公司)；Sorvall Legend RT低温台式离心机(德国)；Vibrax VXR小型摇床(德国)；USC302超声波清洗器(上海波龙电子设备有限公司)。

在一个具体实施例中，对于一种评价中成药药代基质效应的分析方法，包括以下的分析过程。

选用SD大鼠作为实验动物，SD大鼠选用SPF级、雄性、体重230–270g。将中成药和中成药中作为关键成分的中成药化合物成分分别对实验鼠进行给药，给药的方式选自口服或注射中的一种，注射选自静脉注射、皮下注射、肌肉注射中的一种。实验鼠给药前可饮水但禁食10-14h。

然后，在不同时间点t采集给药中成药和给药中成药中关键成分的实验鼠的体液，分别作为试样组A和试样组B。实验鼠的体液选自血浆、尿或胆汁中的一种或多种组合。当体液为血浆时，采血后以5000-20000rpm速率离心1-3min，在≤-70℃下冷冻保存待测，其选择的时间点t为给药前的任一时间点和给药后的0、0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、24h。当体液为尿时，收集尿样后，在≤-70℃下冷冻保存待测，其选择的时间点t为给药前的0-12h和给药后的0–4、4–8和8–24h。当体液为胆汁时，收集胆汁，在≤-70℃下冷冻保存待测，其选择的时间点t为给药前的0-12h和给药后的0–4、4–8和8–24h。

采用液相色谱质谱联用法对实验鼠体液进行分析，确定在不同时间点t的实验鼠体液中所含n个中成药中关键成分的浓度C_t。其中，n为不小于1的自然数。在分析前加入甲醇后振荡1-6min进行蛋白沉淀，以10000-15000rpm速率离心5-15min，取上清液作为分析液。实验鼠的体液与甲醇加入的体积之比为1:2-4。

液相色谱质谱联用法对实验鼠体液进行分析，先根据对已知浓度的中成药中关键成分标准品，通过质谱定性，再通过标准曲线法对实验鼠体液中所含的对应中成药中关键成分的浓度进行定量。标准曲线法是通过LC/MS/MS测定获得的中成药中关键成分的色谱峰面积与相应的中成药中关键成分的浓度的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到中成药中关键成分的标准工作曲线的回归方程，再通过LC/MS/MS测定实验鼠体液中所含的对应中成药中关键成分的色谱峰面积代入对应中成药中关键成分的标准工作曲线的回归方程，计算得到实验鼠体液中所含的对应中成药中关键成分的浓度。

液相色谱采用的色谱柱为Water MG II柱(50mm×2.0mm，3μm)，柱温为室温；流速为0.2-0.4mL/min；进样量为3-10μL。液相色谱采用的流动相：水-甲醇溶液(含甲酸)，其中，A相为水(含0.003-0.005％甲酸)，B相为甲醇(含0.003-0.005％甲酸)；分析时间：10min；梯度洗脱。

梯度洗脱程序的具体为：0-0.5min，A相：B相体积比为98：2-98：2；0.5-7min，A相：B相体积比为98：2-30：70；7-8min，A相：B相体积比为30：70-2：98；8-8.1min，A相：B相体积比为2：98-98：2；8.1-10min，A相：B相体积比为98：2-98：2。

质谱的测定条件为：离子源为ESI源；检测模式为负离子电喷雾电离模式(ESI^-)；工作模式为SRM模式；用于定量分析的SRM离子对为：m/z 611→491。

再采用药代动力学软件Kinetica 5.0按照非房室模型法分析药代动力学参数，进行数据处理。其中，根据浓度C_t与对应的时间点t之间的线性关系，绘制浓度C_t与时间点t的曲线，采用梯形法计算获得面积AUC_0-t。所述梯形法为将血药浓度C_t-时间t曲线分割成无数小的梯形，再按照梯形面积公式：(上底+下底)乘以高除以2，计算各个小梯形面积并将所有梯形面积相加，得到药时曲线下面积AUC_0-t。

计算AUC_0-∞，使其符合公式(1)，所述公式(1)为：AUC_0-∞＝AUC_0-t+C_t/k_e，其中，AUC_0-∞为时间从0时刻到无穷大期间的药时曲线下面积，μM·h；AUC_0-t为时间从给药前0时刻到实验所选的最后一个时间点t这一段时间内的药时曲线下面积，μM·h；C_t为在不同时间点t的实验鼠体液中所含中成药中关键成分的浓度，μM；k_e为末端消除速率，h^-1。所述AUC(药时曲线下面积)代表用药后药物进入体循环的总量，反映药物的血浆暴露水平。

根据AUC_0-∞，按公式(2)计算血浆总清除率CL_tot,p，所述公式(2)为：CL_tot,p＝Dose/AUC_0-∞，其中，CL_tot,p为血浆总清除率，L/h/kg；Dose为给药剂量，μmol；AUC_0-∞为时间从0时刻到无穷大期间的药时曲线下面积，μM·h。所述CL_tot,p是肝肾等的药物清除率的总和，即单位时间内多少容积血浆中的药物被清除干净，该参数反映机体清除药物的能力。

根据AUC_0-t，按公式(3)计算肾清除率CL_R，按公式(4)计算胆汁清除率CL_B。

所述公式(3)为：CL_R＝Cum.A_e-U/AUC_0-t，其中，CL_R为肾清除率，L/h/kg；Cum.A_e-U为累积尿***量，μmol；AUC_0-t为时间从给药前0时刻到实验所选的最后一个时间点t这一段时间内的药时曲线下面积，μM·h。所述CL_R指肾脏在一定时间内将血浆中的药物排出体内的能力，一方面反映肾脏对药物的清除能力，另一方面反映药物从体内清除的机制，为药物血浆总清除率的组成部分之一。

所述公式(4)为：CL_B＝Cum.A_e-B/AUC_0-t，其中，CL_B为胆汁清除率，L/h/kg；Cum.A_e-B为累积胆汁***量，μmol；AUC_0-t为时间从给药前0时刻到实验所选的最后一个时间点t这一段时间内的药时曲线下面积，μM·h。所述CL_B指肝脏通过胆汁***方式在一定时间内将血浆中的药物排出体内的能力，一方面反映肝脏对药物的清除能力，另一方面反映药物从体内清除的机制，为药物血浆总清除率的组成部分之一。

根据CL_tot,p，按公式(5)计算稳态分布容积V_ss，所述公式(5)为：V_ss＝CL_tot,p*t_1/2，其中，V_ss为稳态分布容积，L/kg；CL_tot,p为血浆总清除率，L/h/kg；t_1/2为消除半衰期，h。所述V_ss是指药物在体内达动态平衡后，体内药量与血药浓度之比，其药理意义是提示该药体内是否分布广泛或者是药物与生物高分子有大量结合，亦或两者兼有之。所述t_1/2直观反映了药物从体内的消除速度。

按公式(6)计算尿累积***分数f_e-U，按公式(7)计算胆汁累积***分数f_e-B(％)。

所述公式(6)为：f_e-U＝Cum.A_e-U/Dose*100％，其中，f_e-U为尿累积***分数，％；Cum.A_e-U为累积尿***量，μmol；Dose为给药剂量，μmol。所述f_e-U反映药物从尿***的程度。

所述公式(7)为：f_e-B＝Cum.A_e-B/Dose*100％，其中，f_e-B为胆汁累积***分数，％；Cum.A_e-B为累积胆汁***量，μmol；Dose为给药剂量，μmol。所述f_e-B反映药物从胆汁***的程度。

将试样组A和试样组B中，C_t、AUC_0-t、AUC_0-∞作为剂量依赖型血浆药代动学参数，CL_tot,p、V_ss作为剂量非依赖型血浆药代动学参数，将f_e-U、f_e-B、CL_R、CL_B作为反映***的药代动学参数，进行样本T检验，采用SPSS 19.0软件对上述药代动学参数进行计算，当P<0.05时，提示有统计学显著差异，确定实验鼠体液中所含中成药中关键成分的药代基质效应。

样本T检验按公式(8)进行计算，所述公式(8)为：

其中，

为两样本均值；σ_x1 ²、σ_x2 ²分别为两样本方差；γ为相关样本的相关系数；n为样本量。所述公式(8)采用SPSS 19.0软件进行计算，其中相关样本的相关系数γ由SPSS19.0软件进行拟合算出。

实施例1

选用SD大鼠作为实验动物，SD大鼠选用SPF级、雄性、体重230–270g。

选择血必净作为中成药，血必净由红花、赤芍、丹参、川芎和当归五味中药组成。大量临床研究和基础研究证明血必净是治疗脓毒症的有效中成药，而其发挥疗效主要依靠其中能够被机体有效利用的关键成分。红花为君药，其主要活性成分是黄酮类物质。黄酮类物质中羟A的含量(0.2–0.5mg/mL)远高于其它黄酮类成分，是血必净的质控成分之一。前期对于血必净的药代动力学研究表明，给药血必净后，羟A相比其他血必净物质在体内暴露显著且主要以原型的形式经尿***从体内消除。研究羟A的药代基质效应，有助于从药代角度阐明血必净的方剂配伍规律。因此，可选择血必净中的羟A作为关键成分。称量4.2mg羟A溶于10mL血必净的空白溶媒中，配制羟A给药溶液。

然后，在不同时间点t采集给药血必净和给药血必净中羟A的实验鼠的体液。实验鼠的体液为血浆和尿。

采集血浆样品a：随机选取SD大鼠4只，给药前可饮水但禁食12h。对每只大鼠经尾静脉注射血必净10mL/kg，即折算出羟A为4.2mg/kg。分别于给药前和给药后的0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10和24h对每只大鼠在异氟烷麻醉状态下股动脉采集全血0.2mL，收集于肝素化的采样管中。以10000rpm速率离心2min，在-70℃下冷冻保存待测。

采集血浆样品b：随机选取SD大鼠4只，给药前可饮水但禁食12h。对每只大鼠直接给予4.2mg/kg的羟A。分别于给药前和给药后的0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10和24h对每只大鼠在异氟烷麻醉状态下股动脉采集全血0.2mL，收集于肝素化的采样管中。以10000rpm速率离心2min，在-70℃下冷冻保存待测。

采集尿样品a：随机选取SD大鼠4只，给药前可饮水但禁食12h。对每只大鼠经尾静脉注射血必净10mL/kg，即折算出羟A为4.2mg/kg。分别于给药前0-12h和给药后的0–4、4–8和8–24h，收集尿样品，分别称重，置于-70℃冷冻保存待测。

采集尿样品b：随机选取SD大鼠4只，给药前可饮水但禁食12h。对每只大鼠直接给予4.2mg/kg的羟A。分别于给药前0-12h和给药后的0–4、4–8和8–24h，收集尿样品，分别称重，置于-70℃冷冻保存待测。

上述a、b两组是基于不同给药方式下的样品采集和分析，分别针对的是给药血必净和给药羟A后两组实验中各自药动学参数的获取。血浆样品分析是为了获得待测化合物羟A的血浆药动学参数，反映羟A体内暴露水平和消除速率等药动学特征。尿样分析是为了获得羟A的尿***参数和***特征。

因前期工作基础表明羟A在体内不发生代谢，主要以原型的形式经肾***，只有痕量原型经胆汁***，所以本次实验没有开展胆汁***研究。但建议在开展其他中药注射液或中药制剂的药代基质效应研究时增加胆汁样品采集(甚至粪便采集)。

采用液相色谱质谱联用法对实验鼠体液进行分析，确定在不同时间点t的实验鼠体液中所含羟A的浓度C_t。在分析前，分取血浆样品a、血浆样品b、尿样品a和尿样品b各20μL，加入甲醇60μL振荡5min进行蛋白沉淀，以l4800rpm速率离心10min，吸取上清液40μL作为分析液。经自动进样器进样5μL，进行LC/MS/MS分析。

液相色谱质谱联用法对实验鼠体液进行分析，先根据对已知浓度的羟A标准品，通过质谱定性，再通过标准曲线法对实验鼠体液中所含的对应羟A的浓度进行定量。标准曲线法是通过LC/MS/MS测定获得的羟A的色谱峰面积与相应的羟A的浓度的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到羟A的标准工作曲线的回归方程，再通过LC/MS/MS测定实验鼠体液中所含的对应羟A的色谱峰面积代入对应羟A的标准工作曲线的回归方程，计算得到实验鼠体液中所含的羟A的浓度。

液相色谱采用的色谱柱为Water MG II柱(50mm×2.0mm，3μm)，柱温为室温；流速为0.3ml/min；进样量为5μL。液相色谱采用的流动相：水-甲醇溶液(含甲酸)，其中，A相为水(含0.004％甲酸)，B相为甲醇(含0.004％甲酸)；分析时间：10min；梯度洗脱。

梯度洗脱程序的具体为：0-0.5min，A相：B相体积比为98：2-98：2；0.5-7min，A相：B相体积比为98：2-30：70；7-8min，A相：B相体积比为30：70-2：98；8-8.1min，A相：B相体积比为2：98-98：2；8.1-10min，A相：B相体积比为98：2-98：2。

质谱的测定条件为：离子源为ESI源；检测模式为负离子电喷雾电离模式(ESI^-)；工作模式为SRM模式；用于定量分析的SRM离子对为：m/z 611→491。

再采用药代动力学软件Kinetica 5.0按照非房室模型法分析药代动力学参数，进行数据处理。其中，根据浓度C_t与对应的时间点t之间的线性关系，绘制浓度C_t与时间点t的曲线，采用梯形法计算获得面积AUC_0-t。所述梯形法为将血药浓度C_t-时间t曲线分割成无数小的梯形，再按照梯形面积公式：(上底+下底)乘以高除以2，计算各个小梯形面积并将所有梯形面积相加，得到药时曲线下面积AUC_0-t。

计算AUC_0-∞，使其符合公式(1)，所述公式(1)为：AUC_0-∞＝AUC_0-t+C_t/k_e，其中，AUC_0-∞为时间从0时刻到无穷大期间的药时曲线下面积，μM·h；AUC_0-t为时间从给药前0时刻到实验所选的最后一个时间点t这一段时间内的药时曲线下面积，μM·h；C_t为在不同时间点t的实验鼠体液中所含羟A的浓度，μM；k_e为末端消除速率，h^-1。所述AUC(药时曲线下面积)代表用药后羟A进入体循环的总量，反映羟A的血浆暴露水平。

根据AUC_0-∞，按公式(2)计算血浆总清除率CL_tot,p，所述公式(2)为：CL_tot,p＝Dose/AUC_0-∞，其中，CL_tot,p为血浆总清除率，L/h/kg；Dose为给药剂量，μmol；AUC_0-∞为时间从0时刻到无穷大期间的药时曲线下面积，μM·h。所述CL_tot,p是羟A的肝肾等清除率的总和，即单位时间内多少容积血浆中的羟A被清除干净，该参数反映机体清除羟A的能力。

根据AUC_0-t，按公式(3)计算肾清除率CL_R，所述公式(3)为：CL_R＝Cum.A_e-U/AUC_0-t，其中，CL_R为肾清除率，L/h/kg；Cum.A_e-U为累积尿***量，μmol；AUC_0-t为时间从给药前0时刻到实验所选的最后一个时间点t这一段时间内的药时曲线下面积，μM·h。所述CL_R指肾脏在一定时间内将血浆中的羟A排出体内的能力，一方面反映肾脏对羟A的清除能力，另一方面反映羟A的肾清除机制，为羟A血浆总清除率的组成部分之一。累积尿***量Cum.A_e-U为各时间段尿中的羟A浓度与***体积的乘积之和。根据CL_tot,p，按公式(5)计算稳态分布容积V_ss，所述公式(5)为：V_ss＝CL_tot,p*t_1/2，其中，V_ss为稳态分布容积，L/kg；CL_tot,p为血浆总清除率，L/h/kg；t_1/2为消除半衰期，h。所述V_ss是指羟A在体内达动态平衡后，体内药量与血药浓度之比，其药理意义是提示羟A是否体内分布广泛或者是羟A与生物高分子是否有大量结合，亦或两者兼有之。所述t_1/2直观反映了羟基红花黄色素A从体内的消除速度。

按公式(6)计算尿累积***分数f_e-U，所述公式(6)为：f_e-U＝Cum.A_e-U/Dose*100％，其中，f_e-U为尿累积***分数，％；Cum.A_e-U为累积尿***量，μmol；Dose为给药剂量，μmol。所述f_e-U反映羟基红花黄色素A从尿***的程度。累积尿***量Cum.A_e-U为各时间段尿中的羟基红花黄色素A浓度与***体积的乘积之和。将C_t、AUC_0-t、AUC_0-∞作为剂量依赖型血浆药代动学参数，将CL_tot,p、V_ss作为剂量非依赖型血浆药代动学参数，将f_e-U、CL_R作为反映***的药代动学参数，进行样本T检验，采用SPSS 19.0软件对上述药代动学参数进行计算。

样本T检验按公式(8)进行计算，所述公式(8)为：

其中，

为两样本(如血浆a、b或尿样a、b)均值；σ_x1 ²、σ_x2 ²分别为两样本(如血浆a、b或尿样a、b)方差；γ为相关样本的相关系数(由SPSS 19.0软件进行拟合算出)；n为样本量，n为2。

通过比较由血浆a、b和尿样a、b分析所得到的待测血必净中羟A的血浆药动学参数和***参数在两组给药方式下的差异来表征体内药代过程是否出现显著差异，若出现显著差异说明血必净中其他中药成分可能影响所选待测羟A的体内药动学行为，即可能存在中药药代基质效应，若无显著差异说明血必净中其他中成药成分对羟A的药动学行为无显著影响，即不存在中药药代基质效应，以此确定血必净中羟A的药代基质效应。

结果提示血浆a、b和尿样a、b两组给药数据对比无显著统计学差异(P>0.05)，表明血必净给药后羟A在体内的暴露特征和体内消除不受其他成分的影响，无明显中药药代基质效应。

实施例2

配制羟基红花黄色素A的浓度范围为15.6-8000nmol/L的标准溶液，进行LC/MS/MS检测，以色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其相应羟基红花黄色素A的质量浓度为横坐标(X轴)，进行回归分析，得到回归方程及其相关系数，如表1所示。由表1可知，上述回归方程的在相应浓度范围内进样时线性关系良好，相关系数r>0.99。

表1

实施例3

根据实施例1，大鼠经尾静脉注射给药血必净10mL/kg后的血浆样品a，其体内羟A的血药浓度数据见表2。大鼠经尾静脉注射4.2mg/kg羟A溶液后的血浆样品b，其体内羟A的血药浓度见表3。

将表2和表3中的大鼠体内羟A的血药浓度数据，绘制羟A平均血药浓度-时间曲线图，获得图1、图2，其中，图1为给药血必净后大鼠体内羟A的平均血药浓度-时间曲线图；图2为给药羟A溶液后大鼠体内羟A的平均血药浓度-时间曲线图。

将表2和表3中的大鼠体内羟A的血药浓度数据，采用药代动力学软件Kinetica5.0计算，获得血浆药动学参数数据表4、5，用于反映药代行为特征。其中，表4为给药血必净后血浆药动学参数的数据；表5为给药羟A溶液后血浆药动学参数的数据。

通过将表4、5中血浆药动学参数数据进行汇总，获得表6。表6为两组给药后血浆药动学参数汇总表。同理，根据实施例1，通过测定各时间段尿液中羟A的浓度，以及采样相关信息，获得两组给药后的尿排参数汇总表7。

使用SPSS 19.0软件进行样本T检验，对比分析上述两组药代动力学参数，包括血浆药动学参数和尿排参数，具体参数有：剂量依赖型血浆药动学参数C_5min、AUC_0-t、AUC_0-∞，剂量非依赖型血浆药动学参数t_1/2、CL_tot,p、V_ss，反映尿***的参数，f_e-U、CL_R。

结果显示，给药血必净或羟A溶液后，大鼠体内羟A的基本药代行为特征如下：大鼠给药血必净后，体内羟A的消除半衰期(t_1/2)较短，约0.66h；血浆总清除率(CL_tot,p)为0.53L/h/kg；稳态分布体积(V_SS)较小，为0.34L/kg；肾清除率(CL_R)为0.51L/h/kg，尿排分数为92.8％，表明羟A主要以原型经尿排出体外。给药羟A溶液后，体内羟A末端消除半衰期(t_1/2)较短，约0.62h；血浆总清除率(CL_tot,p)为0.56L/h/kg；稳态分布体积(V_SS)较小，为0.34L/kg；肾清除率(CL_R)为0.51L/h/kg，尿排分数为92.3％，同样提示羟A主要以原型经尿排出体外。

通过比较两种给药方式下羟A的药动学参数，两组给药数据对比无显著统计学差异(P>0.05)，表明血必净给药后羟A在体内血浆暴露和体内消除不受血必净其他成分的影响，无中药药代基质效应，其分析结果与图1、2相符。

表2

表3

表4

表5

药动学参数	Rat1	Rat2	Rat3	Rat4	Mean	SD	RSD％
								C<sub>5min</sub>(μM)	20.8	20.8	20.5	21.2	20.8	0.3	1.5
AUC<sub>0-24h</sub>(μM·h)	13.2	12.5	12.3	11.9	12.5	0.5	4.3
								AUC<sub>0-∞</sub>(μM·h)	13.2	12.6	12.3	11.9	12.5	0.5	4.3
t<sub>1/2</sub>(h)	0.63	0.60	0.71	0.55	0.62	0.06	10.2
								CL<sub>tot,p</sub>(L/h/kg)	0.53	0.55	0.57	0.59	0.56	0.03	4.64
V<sub>ss</sub>(L/kg)	0.32	0.36	0.36	0.34	0.34	0.02	5.58

表6

时间段(h)	血必净组	羟A组
			C<sub>5min</sub>(μM)	18.3±0.7	20.8±0.3
AUC<sub>0-24h</sub>(μM·h)	12.5±0.7	12.5±0.5
			AUC<sub>0-∞</sub>(μM·h)	12.5±0.7	12.5±0.5
t<sub>1/2</sub>(h)	0.66±0.02	0.62±0.06
			CL<sub>tot,p</sub>(L/h/kg)	0.53±0.03	0.56±0.03
V<sub>ss</sub>(L/kg)	0.34±0.01	0.34±0.02

表7

尿***参数	血必净组	羟A组
			Cum.A<sub>e-U</sub>(μmol)	1.40±0.05	1.34±0.10
CL<sub>R</sub>(L/h/kg)	0.51±0.02	0.51±0.03
			f<sub>e-U</sub>(％)	92.8±3.7	92.3±3.7

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。