阅读说明：本技术 一种检测蜂蜜中33种生物碱的方法 (Method for detecting 33 alkaloids in honey ) 是由 徐敦明 张志刚 林建忠 杜凤君 袁文萱 赖国银 林立毅 吴敏 于 2019-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种检测蜂蜜中33种生物碱的方法,使用乙腈作为提取溶剂,采用PSA粉末对试样进行净化,选择0.1％甲酸水-甲醇作为流动相进行梯度洗脱,经Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18反相液相色谱柱分离,在电喷雾正离子多反应监测模式下,以保留时间和特征离子对信息进行定性分析和定量分析。该方法在0.5～50μg/L浓度范围内,33种生物碱均具有良好的线性关系,其操作简单,灵敏度高,可以快速地进行定性和定量分析,从而为蜂蜜中有毒生物碱的安全评价提供依据。(The invention relates to a method for detecting 33 alkaloids in honey, which uses acetonitrile as an extraction solvent, adopts PSA powder to purify a sample, selects 0.1% formic acid water-methanol as a mobile phase to carry out gradient elution, separates the sample by an Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 reversed phase liquid chromatographic column, and carries out qualitative analysis and quantitative analysis on information by retention time and characteristic ions under an electrospray positive ion multiple reaction monitoring mode. The method has the advantages that within the concentration range of 0.5-50 mug/L, the 33 alkaloids have good linear relation, the operation is simple, the sensitivity is high, qualitative and quantitative analysis can be rapidly carried out, and therefore a basis is provided for safety evaluation of toxic alkaloids in honey.)

一种检测蜂蜜中33种生物碱的方法

技术领域

本发明涉及生物碱检测分析技术，尤其是一种检测蜂蜜中33种生物碱的方法。

背景技术

生物碱是一类具有含氮杂环结构的碱性物质，具有高效的药理作用和生理活性。临床上，治疗剂量的阿片类生物碱具有镇静、镇痛及抑制肠蠕动的作用；马钱子类生物碱具有治疗四肢麻木、痈疮肿毒、咽喉肿痛的功效；荷叶碱类生物碱具有清热解毒、降脂减肥、止血散瘀等作用。然而，许多生物碱毒性极强，摄入毫克量级即可对人体造成伤害，具有致命性毒性。过量误食、误服含有毒生物碱类食物、药物将导致食物中毒或药物成瘾。例如，长期食用含阿片类生物碱的食物可产生成瘾性，严重时会造成神经系统、消化系统损伤；过量服用马钱子碱会导致中枢神经系统兴奋、反射亢进，造成中枢神经系统疲惫与麻痹而死亡，严重危害人体健康。

蜂蜜是天然甜物质，由蜜蜂采集植物花蜜酿造，其中花蜜种类决定了蜂蜜的品质。蜂蜜由蜜蜂采集花蜜而来，自然界中，某些植物的花粉和花蜜中含有具有天然毒素的生物碱，比如吡咯里西啶生物碱和异喹咻类生物碱。近年来，包括蜂产品在内的多种食品中生物碱中毒事件时有发生，引起了越来越多研究人员的关注，并对其开展了残留分析研究，但目前国内对生物碱的研究并不多, 生物碱的测定方法主要有化学分析法、分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法等。化学分析法、分光光度法操作简便、成本低廉、适用于总生物碱含量测定方法。依托色谱的分离优势，薄层色谱法、高效液相色谱法可用于单体生物碱含量的测定。高效液相色谱串联质谱法结合了液相色谱高效的在线分离能力和质谱的高选择性、高灵敏度，具有同时检测多种不同性质目标物的能力，在药物多残留分析中显示出越来越广阔的应用前景。蜂蜜中倒千里光碱、克氏千里光宁等吡咯啶类生物碱可以采用强阳离子固相萃取柱进行富集和净化，然后高效液相色谱串联质谱进行定性和定量分析。现有的液相色谱-串联质谱法大多只适用于检测化学性质相近的一类生物碱，对化学性质差别巨大的多类生物碱同时检测尚未建立有效的检测方法。

专利申请CN110161143A公开了一种同时检测食品中20种生物碱的色谱- 质谱联用方法，属于食品检测技术领域。本发明使用乙腈和Na2EDTA- Mcllvaine缓冲液提取样品中的生物碱目标物，得到待测液；然后将待测液依次进行色谱分析和质谱分析。本发明的联用方法对20种生物碱的定量下限为 5.0μg/kg；对奶粉、蜂蜜、麦片和辅食四类样品进行3个浓度水平的添加回收实验，平均回收率为81％～109％，相对标准偏差为在1.6％～8.3％。请分析上述专利不能用于检测蜜蜂中33种生物碱的原因。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种检测蜂蜜中33种生物碱的方法。

本研究选取了结构差异显著，化学性质悬殊的33种生物碱为研究对象，旨建立蜂蜜中多种类多类型生物碱的液相色谱-串联质谱测定方法。本方法操作简易，检出限低，灵敏度高，稳定性好，可以快速、准确地进行定性定量分析，从而为食品中有毒生物碱的安全评价提供依据。33种生物碱分别为：盐酸麻黄碱、野百合碱、槐定碱、白屈菜红碱、安妥、对新乌头碱、次乌头碱、番木鳖碱、荷叶碱、鬼臼毒碱、乌头碱、槟榔碱、毛果芸香碱、钩吻碱、毒扁豆碱、茄碱、D-四羟基药根碱、去氢骆驼蓬碱、苦参碱、原阿片碱、盐酸匹鲁卡品、惹桌碱、千里光碱、东莨菪碱、延胡索乙素、盐酸黄连碱、苯甲酰乌头原碱、吴茱萸碱、秋水仙碱、***、盐酸伪麻黄碱、喜树碱、阿托品。

相比于CN110161143A公开的方案，本申请分析目标物增加，从而需才有特定的提取和净化方案，本申请提取方案效果更好，操作更简单；利用PSA粉，可以有效降低基质效益。

具体方案如下：

一种检测蜂蜜中33种生物碱的方法，包括以下步骤：

样品前处理：准确称取4-6g蜂蜜于50mL离心管中，加入3-7mL二次水， 200±20μL氨水，再加入10±2mL乙腈，混匀；然后加入氯化钠至饱和，涡旋 1-2min，离心，取上层；下层水相再加入10mL±2乙腈，涡旋1-3min，离心，合并上层有机相；将合并上层有机相氮吹至干，用0.05M HCl：甲醇＝8:2(V/V) 定容至2mL，得到提取液；向所述提取液中加入0.1-0.3gN-丙基乙二胺粉末，涡旋混匀1-2min，10000-20000r/min离心2-5min，取上清夜经0.2-0.3μm微孔滤膜过滤后，待测；

高效液相色谱-串联质谱检测：将经过前处理的样品依次送入高效液相色谱和质谱进行分析，

所述高效液相色谱的条件如下：

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18，流动相A：0.1±0.05％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；流动相洗脱程序：0.0～1.0min，40％B；1.0～3.0min，40％～60％B； 3.0～5.0min，60％～70％B；5.0～5.1min，70％～90％B；5.10～10min，90％～100％B；10.0～12.0min100％B；柱温：35-45℃；进样量：10.0±1.0μL；流速：0.1-0.3mL/min；

所述质谱的条件如下：

离子源：电喷雾离子源，正离子扫描方式；调节参数使生物碱目标化合物分析条件最优化：雾化气温度250-350℃，干燥气流速8.0±1.0L/min，雾化器压力35±5psi，鞘流气气体温度350-450℃，鞘流气气体流速12.0±1.0L/min，毛细管电压3500±100V，喷嘴电压500±30V；

根据分析结果定性判断蜂蜜中33种生物碱的存在，或定量计算出蜂蜜中33 种生物碱的含量：

所述定性判断蜂蜜中33种生物碱为对新乌头碱、次乌头碱、番木鳖碱、荷叶碱、鬼臼毒碱、乌头碱、槟榔碱、毛果芸香碱、钩吻碱、毒扁豆碱、茄碱、 D-四羟基药根碱、去氢骆驼蓬碱、苦参碱、原阿片碱、盐酸匹鲁卡品、惹桌碱、千里光碱、东莨菪碱、延胡索乙素、盐酸黄连碱、苯甲酰乌头原碱、吴茱萸碱、秋水仙碱、***、盐酸伪麻黄碱、喜树碱、阿托品，盐酸麻黄碱、野百合碱、槐定碱、白屈菜红碱、安妥，定性判断方法采用4个识别点进行定性；

所述定量计算出蜂蜜中28种生物碱为对新乌头碱、次乌头碱、番木鳖碱、荷叶碱、鬼臼毒碱、乌头碱、槟榔碱、毛果芸香碱、钩吻碱、毒扁豆碱、茄碱、 D-四羟基药根碱、去氢骆驼蓬碱、苦参碱、原阿片碱、盐酸匹鲁卡品、惹桌碱、千里光碱、东莨菪碱、延胡索乙素、盐酸黄连碱、苯甲酰乌头原碱、吴茱萸碱、秋水仙碱、***、盐酸伪麻黄碱、喜树碱、阿托品；定量计算的方法为：配制系列标准溶液，按照所述高效液相色谱的条件进行相同体积的进样，以进样浓度为横坐标，定量离子对的峰面积为纵坐标建立标准曲线，外标标准曲线法进行定量。

进一步的，所述样品前处理为：准确称取5g蜂蜜于50mL离心管中，加入 5mL二次水，200μL氨水，再加入10mL乙腈，混匀；然后加入氯化钠至饱和，涡旋2min，离心，取上层；下层水相再加入10mL乙腈，涡旋2min，离心，合并上层有机相；将合并上层有机相氮吹至干，用0.05M HCl：甲醇＝8:2(V/V) 定容至2mL，得到提取液；向所述提取液中加入0.2g N-丙基乙二胺粉末，涡旋混匀1min，与15000r/min离心3min，取上清夜经0.22μm微孔滤膜过滤后，待测。

进一步的，所述高效液相色谱的条件为：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18(3.0×50mm，1.8μm)，流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；流动相洗脱程序：0.0～1.0min，40％B；1.0～3.0min，40％～60％B；3.0～5.0min，60％～70％ B；5.0～5.1min，70％～90％B；5.10～10min，90％～100％B；10.0～12.0min 100％B；柱温：40℃；进样量：10.0μL；流速：0.2mL/min。

进一步的，所述质谱的条件为：离子源：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描方式；调节参数使生物碱目标化合物分析条件最优化：雾化气温度300℃，干燥气流速8.0L/min，雾化器压力35psi，鞘流气气体温度400℃，鞘流气气体流速12.0L/min，毛细管电压3500V，喷嘴电压500V。

进一步的，所述检测蜂蜜中33种生物碱的方法，对0.5～50μg/L浓度范围内的33种生物碱均具有良好的线性关系。

进一步的，所述检测蜂蜜中33种生物碱的方法，检出限(信噪比S/N＝3) 和定量限(信噪比S/N＝10)，33种生物碱的检出限为0.33-6.7μg/kg，定量限为 1.0-20μg/kg。

进一步的，所述检测蜂蜜中33种生物碱的方法，对蜂蜜基质中进行2、4、 20μg/kg水平的加标回收试验，经基质匹配曲线校正，新乌头碱、次乌头碱、番木鳖碱、荷叶碱、鬼臼毒碱、乌头碱、槟榔碱、毛果芸香碱、钩吻碱、毒扁豆碱、茄碱、D-四羟基药根碱、去氢骆驼蓬碱、苦参碱、原阿片碱、盐酸匹鲁卡品、惹桌碱、千里光碱、东莨菪碱、延胡索乙素、盐酸黄连碱、苯甲酰乌头原碱、吴茱萸碱、秋水仙碱、***、盐酸伪麻黄碱、喜树碱、阿托品28种生物碱回收率范围为64.5％～100.2％，相对标准偏差为在4.7％～14.6％之间。

有益效果：本发明所述检测蜂蜜中33种生物碱的方法，操作简单，灵敏度高，可以快速地进行定性和定量分析，从而为蜂蜜中有毒生物碱的安全评价提供依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，而非对本发明的限制。

图1是本发明一个实施例1提供的生物碱标准品混合溶液(50μg/L)TIC 总离子流图；

图2是本发明一个实施例2提供的不同提取液对生物碱提取效果比较图；

图3是本发明一个实施例3提供的不同净化方式对生物碱净化效果图；

图4a是本发明一个实施例6提供的野百合碱的MRM图之一；

图4b是本发明一个实施例6提供的野百合碱的MRM图之二；

图4c是本发明一个实施例6提供的野百合碱的MRM图之三；

图5a是本发明一个实施例6提供的千里光碱的MRM图之一；

图5b是本发明一个实施例6提供的千里光碱的MRM图之二；

图5c是本发明一个实施例6提供的千里光碱的MRM图之三；

图6是本发明一个实施例6提供的新乌头碱标准曲线图；

图7是本发明一个实施例6提供的次乌头碱标准曲线图；

图8是本发明一个实施例6提供的番木鳖碱标准曲线图。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在下面的实施例中，如未明确说明，“％”均指重量百分比。

实施例中使用的设备包括：Agilent 1290Infinity II高效液相色谱仪、6470 三重四级杆串联质谱仪(美国Agilent公司)；漩涡混匀器(德国IKA公司)；离心机(上海安亭科学仪器厂)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

实施例中使用的试剂包括：甲醇、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸 (色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司)；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0x 50mm，1.8μm)色谱柱(美国Agilent公司)；实验用水由纯水发生器制备。

33种生物碱标准品购自上海安谱科学仪器有限公司，中英文名称及CAS号详见表1。

表1 33种生物碱的保留时间、定量离子、定性离子、碰撞能量和碎裂电压等参数

*为定性离子

实施例1色谱条件

生物碱是一类具有含氮杂环结构的碱性物质，酸性条件下，含氮结构单元容易被质子化，因此，适合采用电喷雾正离子多反应监测模式进行测定。本文考察了水-甲醇，水-乙腈，0.1％甲酸水-甲醇，0.1％甲酸水-乙腈四种流动相的分离效果。实验发现，乙腈对生物碱的洗脱能力比甲醇强，以乙腈为流动相时所有目标物在3分钟内被全部洗脱，流动相的酸化与否不会造成出峰时间的变化。大多数生物碱在甲醇中的响应大于乙腈中的响应，鬼臼毒碱、10-羟基喜树碱、茄碱、秋水仙碱、可的松、喜树碱、安妥等在乙腈中响应同高于甲醇中的响应；同时，水相使用甲酸酸化后，各目标化合物峰响应都比使用未酸化的水相具有更高的响应。生物碱标准品混合溶液(50μg/L)的总离子流图见图1。

从图1可以看出，以0.1％甲酸水-甲醇作为流动相进行梯度洗脱，分离度好，峰形对称。

实施例2提取条件

生物碱具有环状结果，能溶于有机溶剂，与酸成盐后能溶于水。根据生物碱的溶解特性及两性结构，本文考察了乙腈、***、乙酸乙酯的提取效果。取三试管，分别称取5g蜂蜜，加入5mL二次水，加入生物碱标准工作液0.5mL，加入200μL氨水，加入氯化钠至饱和后，分别采用10mL乙腈、***、乙酸乙酯提取。涡旋混匀，5000r/min离心，取上层过膜上机，不同提取溶剂回收率见图2。

从图2可以看出，提取效率乙腈>***>乙酸乙酯。因此，采用乙腈作为提取溶剂，可以获得较好的提取效率。

实施例3净化方法

本文考察了PSA粉末、C18粉末、MCX小柱、HLB小柱对样品的净化效果。称取适量试样4份，2份供基质分散固相萃取(QuEChERS)净化，2份供 SPE小柱净化。在样品中加入生物碱标准中间液50μL，混匀，加入氯化钠至饱和，加入10mL乙腈，涡旋，离心，取上清液；残渣再加入10mL乙腈，涡旋，离心，合并有机相，氮吹至干，用0.05M HCl：甲醇＝8:2(V/V)定容至2mL。一份加入0.2g PSA粉末，一份加入0.2g C18粉末，涡旋，离心，过膜，上机。一份过MCX小柱，一份过HLB小柱，洗脱液氮吹至干，用0.05M HCl：甲醇＝8:2(V/V)定容至2mL。定容液过膜备测。样品回收率见图3。

从图3可看出，盐酸麻黄碱、野百合碱、槐定碱、白屈菜红碱、安托4种净化手段的回收率均小于50％，其余29种生物碱采用HLB小柱净化的试样回收率最差；采用C18粉末净化的试样中次乌头碱、荷叶碱、鬼臼毒碱、乌头碱、茄碱、苦参碱、喜树碱回收率不佳；采用PSA粉末、MCX柱净化的试样各生物碱回收率水平相当，回收率在60％-120％之间。因此，采用PSA粉末对试样进行净化，可以节约实验时间、溶剂以及实验成本，同时保证较好的回收率。

实施例4基质效应评价

基质效应是指在目标物测试过程中，由于目标物以外的其他物质的存在，造成目标物离子化过程受到增强或抑制的现象，从而影响方法的准确度、检出限和定量下限。当前基质效应的评价方法有标准曲线法和相对响应值法。本文采用标准曲线法(基质效应＝基质匹配溶液在线性范围内斜率/溶剂标准溶液在线性范围内斜率*100％)考察了生物碱在蜂蜜中的基质效应，用空白样品提取液为标准液的稀释溶液，使标准溶液和样品溶液具有相同的离子化条件。研究结果表明，喜树碱、10-羟基喜树碱、茄碱表现为基质增强效应(105％～110％)，其他目标物在基质中的都为基质抑制效应(60％～90％)，其中鬼臼毒素的基质抑制效应最为强烈(20％～60％)。

为了确保测定的准确性，消除基质干扰，本研究采用基体匹配法进行定量。用不含分析目标物的蜂蜜提取液配制0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0μg/L 系列标准溶液。以浓度(x，μg/L)为横坐标，定量离子峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线，最终得到33种生物碱的线性方程、相关系数，见表2。结果表明，在0.5～50μg/L浓度范围内，33种生物碱均具有良好的线性关系。在蜂蜜基质中添加33种生物碱，考察方法的检出限(信噪比S/N＝3)和定量限(信噪比 S/N＝10)，33种生物碱的检出限为0.33-6.7μg/kg，定量限为1.0-20μg/kg，详见表2。

表2 33种生物碱标准溶液曲线线性方程、相关系数、检出限及定量限

实施例5加标回收和精密度实验

添加2，4，20μg/kg三个水平的回收实验，重复6次，其平均回收率和相对标准偏差见表3。从表上可以看出，新乌头碱、次乌头碱、番木鳖碱、荷叶碱、鬼臼毒碱、乌头碱、槟榔碱、毛果芸香碱、钩吻碱、毒扁豆碱、茄碱、D-四羟基药根碱、去氢骆驼蓬碱、苦参碱、原阿片碱、盐酸匹鲁卡品、惹桌碱、千里光碱、东莨菪碱、延胡索乙素、盐酸黄连碱、苯甲酰乌头原碱、吴茱萸碱、秋水仙碱、***、盐酸伪麻黄碱、喜树碱、阿托品28种生物碱回收率范围为64.5％～100.2％，相对标准偏差为在4.7％～14.6％之间，方法回收率和精密度良好，符合实验要求。盐酸麻黄碱、野百合碱、槐定碱、白屈菜红碱、安妥5个生物碱的回收率低，无法满足相关技术要求，但可以做为定性分析。

表3 33种生物碱在蜂蜜回收率和相对标准偏差(n＝6)

*分析目标物的回收率过低。

实施例6市售样品的检测

对20个市售样品中的生物碱进行测定，方法如下：

样品前处理为：准确称取5g蜂蜜于50mL离心管中，加入5mL二次水， 200μL氨水，再加入10mL乙腈，混匀；然后加入氯化钠至饱和，涡旋2min，离心，取上层；下层水相再加入10mL乙腈，涡旋2min，离心，合并上层有机相；将合并上层有机相氮吹至干，用0.05M HCl：甲醇＝8:2(V/V)定容至2mL，得到提取液；向所述提取液中加入0.2g N-丙基乙二胺粉末，涡旋混匀1min，与 15000r/min离心3min，取上清夜经0.22μm微孔滤膜过滤后，待测。

高效液相色谱-串联质谱检测：将经过前处理的样品依次送入高效液相色谱和质谱进行分析，

所述高效液相色谱的条件如下：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 (3.0×50mm，1.8μm)，流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；流动相洗脱程序：0.0～1.0min，40％B；1.0～3.0min，40％～60％B；3.0～5.0min， 60％～70％B；5.0～5.1min，70％～90％B；5.10～10min，90％～100％B；10.0～12.0min 100％B；柱温：40℃；进样量：10.0μL；流速：0.2mL/min。

所述质谱的条件如下：离子源：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描方式；调节参数使生物碱目标化合物分析条件最优化：雾化气温度300℃，干燥气流速8.0L/min，雾化器压力35psi，鞘流气气体温度400℃，鞘流气气体流速12.0 L/min，毛细管电压3500V，喷嘴电压500V。

根据分析结果进行判断，具体的：

定性判断：根据欧盟2002/657/EC规定，采用4个识别点进行定性一，1个母离子计1分，1个子离子计1.5分。离子详细情况表1。如：根据表1，新乌头碱母离子为632.1，离子分别为105.0、571.8，当出现上述峰值时可判定样品中含有新乌头碱。次乌头碱母离子为616.2，离子分别为105.3、556.6。当出现上述峰值时可判定样品中含有次乌头碱。

本实施例6个样品中检出生物碱，6个样品中检出了野百合碱，样品中野百合碱的MRM图见图4a-图4c；其中3个样品还检出千里光碱，样品中千里光碱的MRM图见图5a-图5c。

定量计算：用标准贮备液分别配制成系列标准溶液，在本实施例所采用的实验条件及色谱条件下进行相同体积的进样，以进样浓度为横坐标，定量离子对的峰面积为纵坐标建立标准曲线，外标标准曲线法进行定量。线性方程见表2。如：新乌头碱，其标准曲线见图6；次乌头碱，其标准曲线见图7；番木鳖碱，其标准曲线见图8。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。