阅读说明：本技术 一种检测动物源性食品中兽药残留方法及其应用 (Method for detecting veterinary drug residues in animal-derived food and application thereof ) 是由 王守伟 赵文涛 郭文萍 李莹莹 李石磊 郭超 李志刚 姜锐 王娟强 王妍 张颖颖 于 2019-11-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种检测动物源性食品中兽药残留的方法及其应用,所述方法包括将动物源性食品经提取、净化后进行高效液相色谱-高分辨质谱分析；所述高效液相色谱条件为：色谱柱：Agilent Eclipse plus C18；流动相：A：0.1％甲酸-水溶液B：乙腈；洗脱程序：0～0.5min A的含量保持95～98％,0.5～20min A的含量线性变化至0,20～25min A的含量维持0,25～28min A的含量维持95～98％。本发明的检测动物源性食品中兽药残留的方法可以提取并检测各类动物源食品中155种兽药残留,通过高效液相色谱-高分辨质谱联用技术可以对兽药残留同时进行定性和定量分析。(The invention relates to a method for detecting veterinary drug residues in animal-derived food and application thereof, wherein the method comprises the steps of extracting and purifying the animal-derived food, and then carrying out high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry; the high performance liquid chromatography conditions are as follows: a chromatographic column: agilent Eclipse plus C18; mobile phase: a: 0.1% formic acid-water solution B: acetonitrile; elution procedure: the content of 0-0.5 min A is kept at 95-98%, the content of 0.5-20 min A is linearly changed to 0, the content of 20-25 min A is kept at 0, and the content of 25-28 min A is kept at 95-98%. The method for detecting the veterinary drug residues in the animal-derived food can extract and detect 155 veterinary drug residues in various animal-derived foods, and can perform qualitative and quantitative analysis on the veterinary drug residues simultaneously by using a high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry combined technology.)

一种检测动物源性食品中兽药残留方法及其应用

技术领域

本发明涉及食品安全领域，尤其涉及一种检测动物源性食品中兽药残留方法及其应用。

背景技术

近些年，食品安全问题越来越成为广大消费者关注的问题，食品检验机构也随之面临着大量的检测工作。现有的用于家畜和鱼类饲养过程中的兽药数量有数百种之多，其化学结构、性质差别极大，用单一的方法对其进行检测难度极大，目前常用的兽药残留的检测标准方法有100多种。通常一个标准检验方法只适用于一类基质或几类基质中单类兽药残留的分析，需要用多个方法分析多个基质中的100多种兽药残留，对于常规检查任务来说，工作量巨大，耗时耗力。为应对这一问题，使用液相色谱串联高分辨质谱对复杂样品基质中的多种兽药残留进行痕量分析及其快速定量检测，能够大大提高实验室的检测通量。

目前，国内外开展的多兽残快速筛查方法较多，也有多种使用液相色谱串联高分辨质谱检测某一类样品基质中兽药残留的方法，但一般检测范围较窄，仅涉及某一类动物源性食品，例如鱼类基质，并且检测兽药种类较少，难以全面，准确地对动物源性食品中的兽药残留进行检测。

发明内容

本发明提供一种检测动物源性食品中兽药残留方法及其应用，通过prime固相萃取柱净化样品结合高效液相色谱/高分辨质谱联用技术可以检测出动物源性食品中的155种兽药残留。

第一方面，本发明提供一种检测动物源性食品中兽药残留的方法，包括将动物源性食品经提取、净化后进行高效液相色谱-高分辨质谱分析；所述高效液相色谱的条件为：

色谱柱：Agilent Eclipse plus C18；流动相：A：0.1％甲酸-水溶液B：乙腈；洗脱程序：

0～0.5min A的含量保持95～98％，

0.5～20min A的含量线性变化至0，

20～25min A的含量维持0，

25～28min A的含量维持95～98％。

进一步地，所述高效液相色谱的条件为：

色谱柱：Agilent Eclipse plus C18；流动相：A：0.1％甲酸-水溶液B：乙腈；洗脱程序：

0～0.5min A的含量保持98％，

0.5～20min A的含量线性变化至0，

20～25min A的含量维持0，

25～28min A的含量维持98％。

在大批量兽药的高通量检测过程中，容易出现不同兽药色谱峰重叠或同分异构体无法实现色谱分离的问题，一方面，如果大部分的化合物在同一时间出峰，会导致质谱对各化合物离子的扫描时间减少，从而降低仪器的灵敏度；另一方面，例如在磺胺类兽药中存在四对同分异构体，如果这些化合物不在色谱条件下实现分离，将无法在质谱条件下区别。本发明针对155种兽药设定特定的高效液相色谱分析的条件，解决了这一问题，在检测结果中，可以准确地对155种兽药进行定性和定量分析。

进一步地，所述将动物源性食品经提取、净化具体步骤为：

在所述动物源性食品加入提取液中，混匀离心后取上清液过Prime HLB固相萃取柱；其中，所述提取液包括以下质量百分比的成分：0.15～0.25％甲酸、75～85％乙腈。

在实际分析过程中，由于各成分间相互干扰，导致各种兽药检出限不同，多种兽药难以同时检出，容易出现假阴性结果。本发明发现采用Prime HLB固相萃取柱，配合特定采用含0.2％甲酸的80％乙腈水溶液提取各类动物源性食品中的残留兽药，在提取的同时对提取液进行净化，可以有效降低基质的干扰作用并减少对质谱的污染，可以提取至少155种残留的兽药成分。

进一步地，在所述进行高效液相色谱-高分辨质谱分析后，进行如下步骤：

(1)将获取的母离子和二级碎片离子的质核比、保留时间，和各兽药的基质加标样品中的相应标准进行对比，对所述动物源性食品中的兽药残留进行定性分析；

(2)通过外标法检测各兽药的浓度，对所述动物源性食品中的兽药残留进行定量分析。

进一步地，所述兽药为磺胺苯吡唑、磺胺苯酰、磺胺吡啶、磺胺醋酰、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺恶唑、磺胺二甲基异唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲异嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺氯吡嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺脒、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲噻二唑、奥比沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、氟甲喹、氟罗沙星、环丙沙星、洛美沙星、萘啶酸、诺氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星、双氟沙星、司帕沙星、伊诺沙星、氧氟沙星、克伦特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、喷布特罗、异丙喘宁、福莫特罗、非诺特罗、塞布特罗、班布特罗、苯乙醇胺A、噻苯达唑、沙丁胺醇、特布他林、妥布特罗、西马特罗、氟苯尼考、金霉素、强力霉素、四环素、土霉素、红霉素、吉他霉素、林可霉素、泰乐菌素、替米考星、泰万菌素、竹桃霉素、罗硝达唑、地美硝唑、羟基甲硝唑、羟甲基甲硝咪唑、甲硝唑、奥芬达唑、苯硫氨酯、芬苯达唑、氨苄西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、青霉素、头孢匹啉、头孢喹肟、头孢噻呋、头孢氨苄、19-去***、醋酸甲孕酮、睾酮、甲基睾酮、氯丙嗪、阿扎哌隆、异丙嗪、乙酰丙嗪、***、多拉菌素、伊维菌素、马杜霉素、盐霉素、莫能菌素、喹恶啉-2-羧酸、卡巴氧、喹乙醇、脱氧卡巴氧、左旋咪唑、克百威、蝇毒磷、倍硫磷砜、倍硫磷亚砜、马拉硫磷、辛硫磷、敌百虫、甲氧苄啶、阿托品、普鲁卡因、利多卡因、东莨菪碱、山莨菪碱、磺胺、马布特罗、头孢唑啉、金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林、奥司他韦、差向土霉素、差向金霉素、去甲基金霉素、甲苄喹啉、氯羟吡啶、氨丙啉、常山酮、甲基盐霉素、阿苯达唑-2-氨基砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑、磺胺硝苯、氯霉素、倍氯米松、醋酸可的松、***、甲基***龙、可的松、***、氢化可的松、醋酸氟氢可的松、倍他米松、己烯雌酚、***、己烷雌酚、拉沙洛菌素、氟虫腈、克拉珠利、尼卡巴嗪、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜、氟甲腈、甲砜霉素和阿维菌素中的一种或多种。

进一步地，所述定性分析的标准为：

在分析结果中，任一兽药的母离子与二级碎片离子的精确质核比的相对偏差在5ppm以内，保留时间的相对偏差在±2.5％以内即可判断所述动物源性食品中含有该兽药。

进一步地，所述外标法具体为：

取阴性样品，分别配置每一种兽药不同浓度的标准溶液后，进行高效液相色谱-高分辨质谱分析，根据色谱峰面积和对应的浓度绘制标准工作曲线，通过所述标准工作曲线对所述动物源性食品中的兽药残留进行定量分析。

进一步地，在所述进行高效液相色谱-高分辨质谱分析前，将萃取液吹干后加入1mL的初始流动相后过滤。

进一步地，所述高分辨质谱的参数为：

高分辨质谱：ScanType：Full MS--dd-MS2，Polarity：Negative，Sheath gas flowrate:40L，Aux gas flow rate:15L，Spray voltage:3.5KV，Capillary temp:325℃，Auxgas heater temp:450℃，Full MS Resolution:60000，dd-MS2 Resolution:15000。

本发明进一步提供上述方法在动物源性食品安全评价中的应用。

本发明提供一种检测动物源性食品中兽药残留方法及其应用，具有如下有益效果：

(1)通过特定的高效液相色谱-高分辨质谱条件可以全面检测出动物源性食品中的155种兽药成分，检出率及检测准确度较高。

(2)通过特定的溶液提取动物源性食品中残留的兽药，配合Prime HLB固相萃取柱的净化过程可以检测出各类动物源性食品中残留的兽药，例如水生动物、家禽或野生动物可食用组织中的155种兽药成分，检测范围广，具有较高的灵敏度。

(3)通过高效液相色谱-高分辨质谱法可以同时对动物源性食品中的兽药残留进行准确定性和定量分析。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的正模式132种兽药残留标准品的总离子流图；

图2为本发明实施例1提供的负模式23种兽药残留标准品的总离子流图；

图3为本发明实验例2提供的60％、70％、80％、90％、100％的乙腈水溶液对155种兽药的平均回收率对比图；

图4为本发明实验例3提供的分别含有0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％甲酸的80％乙腈水溶液对155种兽药的平均回收率对比图；

图5为本发明实验例4提供的Prime HLB固相萃取柱净化、QuEChERS法、FaVEx固相萃取净化法以及vQSM快速净化法对提取液净化后对155种兽药的平均收率对比图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种检测检测动物源性食品中兽药残留方法，具体步骤如下：

(1)样品处理

称取2.5g均质好的样品，加入提取液：80％乙腈水溶液(含0.2％甲酸)10mL，旋涡振荡，4000r/min高速离心5min，取上清液待净化。

将3mL上清液过PRiME HLB固相萃取柱，收集全部流出液，然后再准确量取2mL流出液，氮气下吹干，1mL初始流动相定容，过滤膜经高效液相色谱/高分辨质谱联用(HPLC-QE-MS)技术进行检测。

检测参数为：

高效液相色谱：仪器：Thermo Q Exactive H-X；色谱柱：Agilent Eclipse plusC18，3.0x 150mm,1.8μm；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；流动相：A：0.1％甲酸-水溶液B：乙腈；洗脱条件0～0.5min保持98％A，0.5～20min A的含量由98％线性变化至0，20～25min A的含量维持0，25～28min A的含量维持98％；正模式和负模式洗脱条件相同。

高分辨质谱：ScanType：Full MS--dd-MS2，Polarity：Negative，Sheath gas flowrate:40L，Aux gas flow rate:15L，Spray voltage:3.5KV，Capillary temp:325℃，Auxgas heater temp:450℃，Full MS Resolution:60000，dd-MS2 Resolution:15000。

(2)定性分析

将步骤(1)所获得的的样品保留时间以及母离子与二级碎片离子的精确质核比与表1和表2进行对比，若保留时间的相对偏差在±2.5％；且样品母离子与二级碎片离子的精确质核比的相对偏差均在5ppm以内，则可判定为存在该兽药组分。

表1正模式各化合物参数及方法检出限

表2负模式各化合物参数及方法检出限

图1为上述表1中正模式132种兽药残留标准品的总离子流图。

图2为上述表2中负模式23种兽药残留标准品的总离子流图。

(3)定量分析

取阴性样品，分别配置步骤(2)中每一种兽药不同浓度的标准溶液后进行高效液相色谱-高分辨质谱分析后根据色谱峰面积和对应的浓度绘制标准工作曲线，得到155种兽药的线性范围，线性方程和相关系数R。

表3正模式132种兽药线性范围、线性方程及相关系数R

表4负模式23种兽药线性范围、线性方程及相关系数R

步骤(1)检测结果通过步骤(2)的定性分析可以判断出动物源性食品中的残留的兽药种类，继而通过步骤(3)的定量分析可以测定出其含量。

(4)质量控制

取阴性样品，对其进行155种兽药的加标回收率进行检测，得表5所示结果：

表5阴性样品加标回收率检测结果

实验例1

本实验例通过改变高效液相色谱的条件，对动物源性食品中的155种兽药残留进行检测：

实验组：实施例1所示高效液相色谱条件；

对照组1：流动相采用A：水，B：甲醇；

对照组2：洗脱条件调整为A：0.1％甲酸-水溶液B：乙腈；洗脱条件0～0.5min保持80％A，0.5～20min A的含量由80％线性变化至20％，20～25min A的含量维持20％，25～28minA的含量维持80％。

结果发现对照组1及对照组2在分别改变流动相和洗脱条件之后，对于这些兽药中的同分异构体，例如：磺胺二甲基嘧啶和磺胺二甲异嘧啶；磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶和磺胺甲氧哒嗪；磺胺二甲氧嘧啶和磺胺邻二甲氧嘧啶；磺胺异噁唑和磺胺二甲恶唑进行检测时出现色谱峰重叠的状况，无法继续进行高分辨质谱法检测。

实验例2

本实验例分别比较不同乙腈浓度下对155种兽药的回收率，检测方法与实施例1相同，仅改变提取液的成分，分别设置60％、70％、80％、90％、100％的乙腈水溶液对155种兽药的回收率进行检测，得到如图3所示结果，结果显示：当乙腈水溶液的比例为8:2时，平均回收率最高。

实施例3

本实验例分别比较不同甲酸浓度下对155种兽药的回收率，检测方法实施例1相同，仅改变提取液汇总甲酸浓度，提取液包含以下质量百分比的成分：

在8:2乙腈水提取溶液中分别添加0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％甲酸，考察155种兽药的平均回收率，得到如图4所示结果，结果显示当甲酸浓度为2％时，平均回收率最高。

实验例4

本实验例分别比较不同净化方法对155种兽药的回收率，检测方法实施例1相同，仅改变净化方法，分别采用：

Prime HLB固相萃取柱净化、QuEChERS法、FaVEx固相萃取净化法以及vQSM快速净化法。

得到如图5所示结果，结果显示Prime HLB固相萃取柱净化对155种兽药的平均回收率最高。

实验例5

本实验例从市售的160件动物源性食品为原材料，通过实施例1所示的方法对其进行定性和定量检测，得到如表6所示结果：

表6实验组兽药残留检测结果

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。