具体实施方式

为了使本技术领域的技术人员能更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对其具体实施方式进行详细地说明：

实施例中涉及的试剂与耗材如表1所示：

表1

实施例中受试物及编号如表2所示：

表2

一、溶液配制：

1、配制FACS缓冲液：将100mg BSA粉末溶解于100mL 1xPBS(磷酸缓冲盐溶液)中，0.22μm滤膜过滤即可。

2、FcR阻断剂工作液：向100μL FACS缓冲液中加入0.5μL FcR阻断剂抗体即可。

3、7-AAD工作液：向398μL FACS缓冲液中加入2μL 7-AAD即可。

二、实验过程：

本发明的最佳实施例，一种体外细胞与3D表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法，包括以下步骤：

步骤S1，THP-1细胞培养和3D表皮培养；

(1)THP-1细胞培养：

THP-1细胞购买于中科院上海细胞库，根据指示说明，使用RPMI-1640培养基添加10％的胎牛血清，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。每 3-4天进行传代，1:3-1:4传代。采用RPMI-1640+10％FBS完全培养基培养，所有培养条件均为37±0.5℃，(5±1)％CO2浓度，饱和湿度。

(2)3D表皮培养：

SkinEthic皮肤模型购于上海斯安肤诺生物科技有限公司，根据指示说明，每批次含：皮肤模型、维持培养基及检测培养基。SkinEthic皮肤模型到达实验室后，使用镊子将皮肤模型移入已经添加1mL的维持培养基的6孔板中，于37℃，5％CO2 和95％湿度的培养条件下孵育过夜，待3D表皮模型稳定后进行实验。

步骤S2，THP-1细胞及3D表皮活力检测确定实验样品的检测浓度，包括以下工序：

步骤S21，取步骤S1中生长状态稳定的3D表皮模型，加入实验样品，所述实验样品为待测化妆品原液，对照样品为不添加任何样品的培养基溶液，培养18-24h 后，用MTT检测3D表皮模型的组织存活率；

步骤S22，根据步骤S21筛选得到组织存活率大于50％时对应的实验样品的浓度为3D表皮模型给药浓度。

步骤S3，细胞铺板及表皮模型联合培养步骤：取步骤S1中对数生长的THP-1 细胞接种至6孔细胞培养板，具体是将预先培养的对数生长的THP-1细胞离心，去上清，用培养基重悬细胞，浓度为10⁶个/mL，吸取1mL上述重悬液接种至6孔细胞培养板，这样，THP-1细胞以10⁶个细胞/mL的密度接种至6孔细胞培养板，每孔培养基1mL，每个培养孔设置3个复孔；6孔细胞培养板上分别设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和待测物处理组，空白对照组加入完全培养基，阴性对照组加入乳酸，阳性对照组加入肉桂醛，待测物处理组加入待测物质；阴性对照组中加入的乳酸为用细胞培养基将乳酸稀释至体积浓度为0.1％的乳酸溶液；阳性对照组加入肉桂醛为用细胞培养基将肉桂醛稀释至体积浓度为0.5％的肉桂醛溶液；

同时将3D表皮模型放置在6孔细胞培养板的板内的THP-1细胞上方，放置过程中不要产生气泡；然后将空白对照、阴性对照、阳性对照及待测物质一一对应涂抹在空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和待测物处理组的3D表皮模型上，用量150-200μL；

待测物质包括#3防晒喷雾、#4抗老化防晒乳、#5防晒凝露、#6物理防晒乳、#7男士防晒乳、#8美白防晒喷雾和#9清透防晒乳。

步骤S4，受试物暴露步骤：然后将步骤S3中的6孔细胞培养板转移至37℃、 5％CO₂、相对湿度95％的CO₂培养箱内，培养时间20-24h。

步骤S5，冲洗步骤：取出6孔细胞培养板，用PBS(磷酸缓冲盐溶液)将3D 表皮模型表面的空白对照、阴性对照、阳性对照及待测物质冲洗掉。

步骤S6，MTT组织活性检测步骤，具体包括以下步骤：

S61，表皮模型MTT处理步骤：将步骤S5中经过冲洗的3D表皮模型从6孔细胞培养板中取出，取一块24孔细胞培养板，放入200μL的1mg/mL MTT工作液中，将3D表皮模型转移至24孔细胞培养板上，并放入37℃，5％CO2，相对湿度95％的CO2培养箱内，培养时间3h；

S62，表皮模型活力检测步骤：取一块新的24孔板，先在孔内加入500-1000μl 异丙醇，将步骤S6处理后的3D表皮模型转移到该24孔板内，放置过程中不要产生气泡，在3D表皮模型内加入500-1000μL异丙醇萃取，用封口膜将24孔板覆盖封住，封一层后，盖上盖子再封一层，将24孔板避光过夜；24孔板取出后在摇床上混匀1-2h；将溶液混匀，酶标板空白孔为异丙醇，甲瓒萃取液200μL/每孔，6个复孔，用酶标仪570nm进行检测；取组织存活率大于50％的3D表皮模型进行后续的细胞致敏性实验测试。

步骤S7，体外细胞致敏模型建立步骤，需要进行细胞表面目标分子表达量检测，目标分子为细胞表面标记物CD86和细胞表面标记物CD54，具体包括以下步骤：

步骤S71，THP-1细胞收集步骤，将步骤S5中经过冲洗的3D表皮模型从6孔细胞培养板中取出后，将每种受试物作用下的THP-1细胞，从6孔细胞培养板中分别移入对应的1mLEP管中，离心沉淀THP-1细胞，并用FACS缓冲液清洗一次，再次离心收集THP-1细胞；

步骤S72，FcR阻断步骤：按THP-1细胞数量配制适宜浓度的FcR阻断剂， 50-100μL体积的一百万个细胞需要2.5μg的FcR阻断剂，随后将离心获得的THP-1 细胞进行阻断；

步骤S73，抗体染色步骤：将进行过阻断的THP-1细胞按每管50μL平均分配至4支1mL的EP管中，在4支1mL的EP管一一对应地加入抗体FITC标记的CD86 抗体、PE标记的CD54抗体、FITC标记的小鼠同型对照IgG1和PE标记的小鼠同型对照IgG1；4℃环境和暗室条件下染色30min；使用FACS缓冲液清洗2次，再用500μLFACS缓冲液重悬细胞并转移5mL流式管中待检测；每次实验条件下同时进行7-AAD的染色，确定该浓度下细胞活力与相应抗体染色的情况；

步骤S74，流式细胞测定步骤：收集分析10000个THP-1细胞，通过无处理的空白对照组的THP-1细胞调节实验FSC vs SSC的实验电压，以确保本批次THP-1 细胞后续实验的计算结果的准确性，得到细胞表面目标分子表达量，建立以目标分子表达量为基准的体外细胞致敏模型。

步骤S8，结合体外细胞致敏模型，参照步骤S7的方法对待测物质的致敏性进行评价，以目标分子表达量为基准，计算待测物质引起的目标分子相对表达量的变化，以目标分子相对表达量的变化值表示致敏的强度，目标分子相对表达量的变化值越大，待测物质的潜在致敏性越强。

三、实验结果

1、3D表皮模型活力测试

请参阅图1和表3来评估受试物对SkinEthic皮肤模型活力的影响。

表3

请参阅图1，不同受试物所引起的3D表皮活力变化结果，再结合表3，待测物 #5、#6、#8、#9作用的3D表皮活力相对较低，但所有受试物作用的3D表皮活力均超过50％。

2.THP-1细胞活力测试

不同受试物对THP-1细胞存活率的影响如表4所示：

表4

3.受试物引起的目标分子表达量检测

不同受试物引起的细胞表面标记物CD86和CD54的表达量如表5所示：

表5

请参阅图2，不同受试物所引起的细胞表面标记物CD86和CD54的表达量变化结果，再结合表4和表5，待测物#6能引起目标分子CD86和CD54的表达量明显增高，判断其可能具有潜在致敏性，需要后续进一步研究。另外，#3、#4、#5、 #7、#8、#9均未引起目标分子的表达量增高，不具有致敏性。

本发明提供的通过结合3D表皮的组织活性及细胞表面CD86、CD54的表达筛选活性物的方式，稳定性高，重现性好，可以用于特定目的的化妆品产品的筛选，为后续研发提供了新的思路。

综上所述，本发明的体外细胞与3D表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法，结合细胞模型和3D表皮模型检测结果，将待测物作用于所建立的致敏模型中，筛选能够抑制或促进目标分子表达的活性物质，从而对产品的致敏安全性进行评价，具有快速、高效的优势；为皮肤护理产品的致敏性提供快捷可靠的评价方法，为原料的复配方案提供参考依据，也为护肤品行业动物替代实验、皮肤护理产品开发及功效验证的进一步研究提供有效依据。

本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。